Summary
Dit artikel beschrijft protocollen voor het bouwen en bedienen van een koeltrap om C. elegans massaal op hun oorspronkelijke teeltplaten te immobiliseren.
Abstract
Hoge resolutie in vivo microscopiebenaderingen kunnen subtiele informatie en fijne details in het modeldier Caenorhabditis elegans (C. elegans) onthullen, maar vereisen een sterke immobilisatie van dieren om bewegingsonscherpte in de beelden te voorkomen. Helaas vereisen de meeste huidige immobilisatietechnieken aanzienlijke handmatige inspanningen, waardoor beeldvorming met hoge resolutie een lage doorvoer heeft. Immobilisatie van C. elegans wordt sterk vereenvoudigd door een koelbenadering te gebruiken die gemakkelijk hele populaties direct op hun teeltplaten kan immobiliseren. De koelfase kan een breed temperatuurbereik vaststellen en handhaven met een uniforme verdeling op de teeltplaat. In dit artikel wordt het hele proces van het bouwen van de koelfase gedocumenteerd. Het is de bedoeling dat een doorsnee onderzoeker volgens dit protocol zonder problemen een operationele koeltrap in zijn laboratorium kan bouwen. Het gebruik van de koelfase volgens drie protocollen wordt getoond en elk protocol heeft voordelen voor verschillende experimenten. Ook wordt een voorbeeld van een koelprofiel van het podium getoond terwijl het zijn eindtemperatuur nadert en enkele nuttige tips voor het gebruik van koelimmobilisatie.
Introduction
Hoge resolutie optische microscopie biedt een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van in vivo biologische structuren op subcellulair niveau. Veel biologische studies vereisen beeldvorming met submicronresolutie om subtiele anatomische details op te lossen, waaronder neuronmorfologie 1,2, membraanstructuur3,4 en eiwitlokalisatie 5,6. Een afbeelding met een hoge resolutie vereist een belichtingstijd van enkele milliseconden tot seconden, afhankelijk van de beeldmodaliteit en sonde 7,8. Om optimale resultaten te bereiken, is het essentieel om op microscopie gebaseerde experimenten zorgvuldig te plannen en uit te voeren. Cruciaal voor deze inspanning is een efficiënte dierbereidingsmethode die beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt.
De nematode C. elegans is een veel gebruikt modelorganisme voor het bestuderen van vele biologische processen9. Dit kleine dier wordt meestal gekweekt op nematode groeimedium (NGM) agarplaten en ze planten zich snel voort door zelfbevruchting, waardoor ze zeer geschikt zijn voor grootschalige studies. Hun transparantie en een breed scala aan etiketteringstechnieken maken de eenvoudige visualisatie van hun interne anatomiemogelijk 10,11. De fijne structuren in C. elegans zijn ideaal voor het bestuderen van biologische processen op subcellulair niveau, zoals neuronregeneratie 12, neurondegeneratie13 en celdeling14. Dergelijke studies vereisen beeldvorming met submicronresolutie en immobilisatie van dieren die sterk genoeg is om beeldonscherpte te voorkomen. Sterke immobilisatie is vooral cruciaal voor technieken waarbij meerdere afbeeldingen in ruimte of tijd betrokken zijn, zoals 3D-beeldstapels (d.w.z. z-stacks) en time-lapse-beeldvorming. Elke beweging van dieren tussen de blootstellingen kan het resultaat verdoezelen. Voor C. elegans omvat sterke immobilisatie meestal handmatige manipulatie van individuele dieren en het monteren ervan op dia's met een verdovingsmiddel15,16. Deze tijd- en arbeidsintensieve procedures maken grootschalige experimenten erg moeilijk. Een immobilisatiestrategie waarbij dieren direct en omkeerbaar worden geïmmobiliseerd op hun oorspronkelijke teeltplaten, zou beeldvorming met hoge doorvoer en hoge resolutie mogelijk kunnen maken.
Koelimmobilisatie van C. elegans is aangetoond in een paar studies, maar wordt niet op grote schaal gebruikt. Het wordt meestal gecombineerd met een microfluïdisch apparaat om dieren verder te beperken17,18,19. Microfluïdische apparaten zijn echter complex, vereisen een aanzienlijke operationele training en kunnen niet gemakkelijk worden geïntegreerd met typische vaste teeltworkflows van C. elegans-experimenten. Microfluïdica worden dus niet op grote schaal gebruikt voor immobilisatie van C. elegans. Hier gepresenteerd, in combinatie met de recente publicatie20 van het Chung Laboratory, is de introductie van een nieuwe koelimmobilisatiebenadering met behulp van een thermo-elektrische koeltrap (figuur 1) om deze tekortkomingen aan te pakken. Met de koelfase kan een typische 60 mm polystyreen teeltplaat worden afgekoeld tot elke doeltemperatuur (T-set) tussen -8 °C tot kamertemperatuur. Deze koelfasebenadering kan gemakkelijk en omkeerbaar een hele dierpopulatie immobiliseren met minimale gebruikersinspanning, waardoor 98% van de verwerkingstijd van dieren wordt geëlimineerd20.
Hieronder worden de procedures beschreven voor het helemaal opnieuw bouwen van een koelfase. Met uitzondering van het bewerken van onderdelen en 3D-printen, zal de hele procedure naar verwachting 4 uur duren zonder de vereiste van speciaal gereedschap of expertise. Vervolgens worden drie verschillende koelstrategieën met verschillende koelsnelheden en gebruikersinspanningen om C. elegans te immobiliseren op een typische rechtopstaande microscoop verder beschreven. De voorkeursstrategie kan afhankelijk zijn van de gebruikerstoepassing. De protocollen voor deze drie koelimmobilisatiestrategieën worden in detail beschreven.
Protocol
1. Vervaardiging en voorbereiding van elk onderdeel van de koelfase
OPMERKING: De koelfase bestaat uit verschillende componenten (zie materiaaltabel). De meeste componenten zijn kant-en-klaar. Het saffiervenster vereist een aangepaste bestelling, terwijl de koperen plaat, houder en isolatieplaat ter plaatse kunnen worden vervaardigd met een computer numerieke besturingsmolen of 3D-printer. Na de eerste productie duurt het latere assemblageproces ongeveer 2-3 uur.
- Gebruik een computer numerieke regelmolen om de koperplaat te bewerken uit een 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% zuiver koperen metalen plaat (figuur 2A). De 2D-tekening voor deze productie is opgenomen in het Aanvullend Dossier 1. Gebruik fijnkorrelig schuurpapier om scherpe randen en vuilresten te verwijderen.
- Gebruik voor de vervaardiging van de houder en de isolatieplaat een 3D-printer en een polymelkzuur (PLA)-filament met een diameter van 1,75 mm (figuur 2B,C). Voor een betere kwaliteit moet de 3D-printer een laaghoogte fijner dan 0,2 mm bieden.3D modellen worden geleverd in Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3.
2. Constructie van de waterkoelingsassemblage
- Bereid de platina-uitgeharde siliconenbuis, pomptank, koperen koelblok en radiator (figuur 3A) voor op het bouwen van de waterkoelingsassemblage. Maak een scheermesje, schaar en inbussleutel klaar voor gebruik. Houd rekening met elektrische gevaren als gevolg van het gebruik van water tijdens de montage.
- Snijd de siliconenbuis in drie secties met voorgestelde lengtes van 40 cm, 50 cm en 80 cm. Pas de lengte aan wanneer dat nodig is.
- Sluit de siliconen buissecties van stap 2.2 aan op de poorten van de radiator, pomptank en koperen koelblok, zoals weergegeven in figuur 3B. Zorg ervoor dat alle aansluitingen waterdicht zijn. De waterkoelingsassemblage is nu gebouwd.
- Bereid de waterkoelingsassemblage voor, een 12 V-voeding, drie rode en drie zwarte jumperdraden, een breadboard en 500 ml gezuiverd water.
- Zorg ervoor dat de werkbank vrij is van vloeistof voor elektrische veiligheid.
- Sluit de pomptanks en de draden van de radiator aan op de 12 V-voeding via het breadboard (figuur 3C). Het breadboard wordt gebruikt voor het gemak.
OPMERKING: Voor een meer permanente en veilige verbinding kunnen onderzoekers het breadboard vervangen door soldeerdraden. - Open de tankdop van de pomp met een platte schroevendraaier. Gebruik een trechter om water toe te voegen totdat de pomptank voor ongeveer 80% vol is (figuur 3D). Sluit de pomptank na deze vulling niet af.
- Schakel de waterkoelingsassemblage in door de 12 V-voeding aan te sluiten of in te schakelen (als er een schakelaar aanwezig is). Na het inschakelen stroomt het water in de montage en moeten de ventilatoren op de radiator blazen.
- Door de waterstroom uit de pomptank zal het vloeistofniveau in de tank dalen. Voeg meer water toe aan de pomptank totdat deze stabiliseert op bijna 2/3 vol (figuur 3E).
- Schud de radiator om luchtbellen te verwijderen en sluit vervolgens de koeltank af.
- Schakel de voeding uit voordat u naar de volgende stap gaat.
3. Testen van Peltier koude en warme oppervlakken
OPMERKING: De Peltier, een belangrijk onderdeel van de koelfase, is een solid-state actieve warmtepomp die warmte van de ene naar de andere kant overbrengt21. Het ene oppervlak van de Peltier wordt heet en het andere oppervlak wordt koud bij het leveren van elektrische stroom. Standaard markeren Peltier-fabrikanten het koude oppervlak voordat ze het verkopen, maar het is nog steeds handig om het handmatig te testen voordat het wordt gemonteerd.
- Bereid de afstembare voeding en de Peltier voor, zoals weergegeven in figuur 4A.
- Zorg ervoor dat de instelbare voeding is uitgeschakeld om mogelijke elektrische gevaren te voorkomen.
- Sluit de rode draad van de Peltier aan op de positieve uitgang en de zwarte draad op de negatieve uitgang van de afstembare voeding met krokodillenklemmen, die bij de voeding worden geleverd (figuur 4B).
- Schakel de instelbare voeding in en stel deze in op ongeveer 2 V door zowel de spannings- als de stroomknoppen op de bovenste rij van de voeding te moduleren. Gebruik onmiddellijk een blote vinger om de twee oppervlakken van de Peltier te voelen. Eén oppervlak wordt binnen enkele seconden koud.
- Nadat u hebt vastgesteld welk oppervlak koud is, schakelt u onmiddellijk de voeding uit en koppelt u de Peltier los.
- Gebruik een marker om het koude oppervlak aan te geven voor toekomstige montage.
4. Het bouwen van de assemblage om de Peltier te koelen met behulp van waterkoeling
- Zoals weergegeven in figuur 4A, bereidt u de uitgeschakelde waterkoelingsassemblage, de Peltier (koud oppervlak gemarkeerd) en de koelpasta (voor een betere thermische geleiding) voor.
- Reinig alle oppervlakken van het koperen koelblok met 70% ethanol (of een andere schonere oplossing) in de waterkoelingsassemblage.
- Breng ongeveer 0,4 g koelpasta aan op één oppervlak van het koperen waterkoelblok en zorg ervoor dat deze oppervlakteoriëntatie voorkomt dat de buizen elkaar kruisen of buigen wanneer ze naar beneden zijn gericht. Gebruik een handschoen om de huid te beschermen en probeer de koelpasta dun en gelijkmatig te verdelen (figuur 4C).
- Reinig op dezelfde manier het hete oppervlak van de Peltier en breng vervolgens de koelpasta aan op het oppervlak (figuur 4D).
- Verbind het Peltier hot surface met het koperen koelblokoppervlak met koelpasta. Oefen druk uit om ervoor te zorgen dat het veilig is. Volg de oriëntatie van de draden op de Peltier en de buizen van het koperen koelblok, zoals weergegeven in figuur 4E. Reinig de overtollige koelpasta.
- Houd zowel de 12 V-voeding als de afstembare voeding uit. Sluit de Peltier aan op de instelbare voeding, zoals in sectie 3.
- Controleer zowel de elektrische als de waterkoelende assemblageaansluitingen opnieuw en schakel vervolgens de 12 V-voeding en afstembare voeding sequentieel in.
- Zet de instelbare voeding geleidelijk op 12 V. Met de voorgestelde Peltier zou de stroom rond de 7,3 A moeten liggen.
- Wacht 2 min; de temperatuur van het koude oppervlak van Peltier moet kouder worden dan -35 °C. Meet deze temperatuur met een infraroodthermometer (figuur 4F). Raak het koude oppervlak niet aan om letsel aan de handen te voorkomen.
- Controleer alle aansluitingen en componenten als de temperatuur niet onder de -30 °C kan komen. Luchtbellen in de waterkoeling zijn een mogelijke reden voor suboptimale koelprestaties.
- Om de veiligheid in latere stappen te garanderen, schakelt u de instelbare voeding uit, wacht u 1 minuut en schakelt u vervolgens de 12 V-voeding uit.
5. Het bouwen van koperen plaat en saffiervenster montage
- Bereid de koperen plaat, het saffiervenster met een diameter van 80 mm, koelpasta, een 4 inch brede tape en een scherp mes voor om te snijden (figuur 5A).
- Reinig de koperen plaat en het saffiervenster zorgvuldig met 70% ethanol en gebruik schuurpapier met fijne korrels om ruwe oppervlakken glad te maken.
- Breng de koelpasta aan op drie binnenoppervlakken, zoals weergegeven in figuur 5B. Zorg ervoor dat de koelpasta alle drie de oppervlakken bedekt, maar niet te dik is, ongeveer 0,5 mm.
- Leg de koperen plaat op het tafelblad beschermd met printerpapier. Het papier maakt het later opruimen makkelijker.
- Steek het saffiervenster in het koperen plaatgat (figuur 5C). Zorg ervoor dat de saffier niet roteert tijdens het inbrengen om te voorkomen dat de koelpasta naar andere gebieden beweegt. Verwijder overtollige koelpasta.
- Plak de 4 inch brede tape op het bovenoppervlak van de koperen plaat-saffier raamassemblage (het oppervlak met het vierkante depressiegebied, zoals weergegeven in figuur 5D). Vermijd luchtbellen tussen de tape en koperen oppervlakken tijdens het plakken door de hechting langzaam van de ene naar de andere kant te leiden.
- Knip de gespecificeerde blauwe stippelgebieden van de tape uit met een scherp mes, volgens figuur 5E. Snijden legt de twee draadgaten, de vierkante depressie en het gebied met een diameter van 70 mm van het saffiervenster bloot.
- Plak het onderoppervlak van de koperen plaat-saffiervensterassemblage af en herhaal vervolgens de snijprocedure (alleen saffiergebied) op dit oppervlak, zoals weergegeven in figuur 5F.
OPMERKING: Nu is het saffiervenster bevestigd aan de koperen plaat en worden de koperen oppervlakken beschermd tegen roest.
6. Eindmontage koelfase
- Zorg ervoor dat alle essentiële subassemblage en componenten klaar zijn.
- Breng ongeveer 0,4 g koelpasta aan op de vierkante depressie van de koperplaat (figuur 6A).
- Breng ongeveer 0,4 g koelpasta aan op het koude oppervlak van de Peltier. Merk op dat de Peltier al is bevestigd aan het koperen koelblok (figuur 6B).
- Verbind het Peltier koude oppervlak met de koperen plaatdepressie met neerwaartse druk. Reinig alle overtollige koelpasta (figuur 6C).
- Monteer de 3D-geprinte beugel aan de bovenkant van het koperen koelblok en gebruik vervolgens een inbussleutel om twee 8-32, 0,5 inch lange schroeven aan te draaien om de beugel aan de koperen plaat te bevestigen (figuur 6D). Gebruik een aanscherping met een laag koppel, zodat de bedrukte beugel niet breekt of vervormt om een goede thermische geleiding van de Peltier naar het koper te garanderen.
- Plaats de koperen plaat in de 3D-geprinte isolatiebasis voor thermische isolatie van de tafel- of microscoopbasis tijdens bedrijf (figuur 6D).
- De koeltrap is geassembleerd en klaar voor gebruik (figuur 6E).
- Plaats voor microscopie de voltooide koelfase op een rechtopstaand microscoopplatform (figuur 7A).
- De montage van de koelfase is voltooid. Verdere details zijn beschikbaar in de begeleidende publicatie van het Chung Laboratory, die de gedetailleerde strategieën en dierbewegingen volledig karakteriseren20.
OPMERKING: In de volgende secties worden langzame, snelle en abrupte koelprotocollen besproken. N2 hermafrodieten op L4- of jongvolwassen leeftijd werden gebruikt om de volgende gegevens te produceren. De langzame koelstrategie is nuttig voor het immobiliseren van 20 °C gekweekte N2-dieren bij 6 °C; 15 °C-gekweekte N2-dieren worden het sterkst geïmmobiliseerd bij 1 °C20. Een korte vergelijking tussen deze drie koelprotocollen is weergegeven in tabel 1.
7. Langzaam koelend immobilisatieprotocol
- Verplaats de teeltplaat met deksel naar een koelkast van 4 °C.
- Nadat u de teeltplaat naar de koelkast hebt verplaatst, schakelt u de 12 V-voeding van de koeltrap in en stelt u de instelbare voedingsspanning in op 5,5 V.
- Nadat de dekselteeltplaat 1 uur in de koelkast van 4 °C heeft gestaan, brengt u de plaat onmiddellijk over naar de koelfase en verwijdert u het deksel (figuur 7A). Dergelijke teeltplaten liggen meestal rond de 6 °C. De voorgekoelde fase is stabiel en koud genoeg om het agaroppervlak op 6 °C te houden.
- Als de temperatuur van het agaroppervlak verandert, zoals gemeten of door de beweging van het dier te noteren, pas dan de spanning enigszins aan totdat deze stabiliseert op 6 °C.
- Dieren worden op de juiste manier geïmmobiliseerd op het moment van overdracht.
8. Snel koelend immobilisatieprotocol
OPMERKING: De snelle koelingsstrategie is de meest elementaire immobilisatiemethode (zie film 1); agarplaten bezetten echter werkeloos het podium voor een langere tijd terwijl ze deT-set bereiken. Ook wanneer een sterke immobilisatie nodig is en deT-set 6 °C is, wordt de stationaire tijd verlengd tot ongeveer 1 h20.
- Schakel de 12 V-voeding van de koeltrap in en stel de instelbare voedingsspanning in op ongeveer 12 V. Wacht 10 minuten.
- Breng een kweekplaat uit de broedmachine rechtstreeks naar de koelfase en verwijder het deksel.
- Zodra de oppervlaktetemperatuur van de agar daalt tot (T-set + ΔT) °C, stelt u de instelbare voeding in op V-set en wacht u tot de agar deT-set bereikt. De V-set is de juiste spanning om de agar opT-set te stabiliseren. De ΔT is een variabele die overkoeling voorkomt. Zie tabel 2 voor de combinatie van T-verzameling, ΔT enV-verzameling.
OPMERKING: De gegevens in tabel 2 hebben specifiek betrekking op het Chung-laboratorium en daarom moet worden opgemerkt dat experimentele parameters kunnen variëren op basis van de unieke omgevings- en gebruiksomstandigheden van elk afzonderlijk experiment. - Dieren worden geïmmobiliseerd wanneer de agarT-set bereikt. Immobilisatie verbetert met de tijd tot ~ 50 minuten na het begin van de koeling.
9. Abrupt afkoelingsimmobilisatieprotocol
OPMERKING: De abrupte koelstrategie verbruikt de meeste gebruikerstijd, maar immobiliseert dieren het snelst van hun teelttemperatuur.
- Schakel de 12 V-voeding van de koeltrap in en zet de instelbare voedingsspanning op ongeveer 12 V. Houd gedurende 10 minuten.
- Breng een onbezette agarplaat naar de koelfase. Gebruik stap 8.3 in het immobilisatieprotocol voor snelle afkoeling om de temperatuur van het agaroppervlak te stabiliseren op deT-set.
- Verplaats de dieren van hun oorspronkelijke kweekplaat naar de gekoelde plaat die op het koelpodium zit.
- Op basis van de grootte van de kleine dieren wordt verwacht dat de dieren binnen enkele secondenafkoelen tot T-set en worden geïmmobiliseerd. Immobilisatie verbetert met de tijd tot ~ 50 minuten na het begin van de koeling.
10. Heropleving van dieren na afkoeling immobilisatie
- Verplaats de afgekoelde kweekplaat terug naar de oorspronkelijke incubator of naar kamertemperatuur.
- Wacht 20 minuten tot 1 uur totdat alle wormen op het bord hun normale kruip- en voedingsgedrag hervatten.
Representative Results
Meting van de koeltemperatuur
Voor de eerste koelimmobilisatie-experimenten is het belangrijk om de oppervlaktetemperatuur van de agar te volgen om ervoor te zorgen dat de dieren goed kunnen worden geïmmobiliseerd. Toekomstige experimenten die worden gerepliceerd vanaf de eerste kunnen dezelfde parameters gebruiken, meestal zonder frequente temperatuurregistratie. Voor temperatuurmeting wordt de thermokoppelpunt van de thermometer gesteriliseerd met behulp van 70% ethanoloplossing, wachtend tot de ethanol volledig verdampt voor gebruik. Vervolgens wordt de thermokoppelpunt 1 mm in de NGM-agar gestoken om een nauwkeurige temperatuurmeting te garanderen. De punt van de thermometer wordt vastgehouden met behulp van een klemhouder of andere houders (figuur 7B).
Temperatuurmeting met een infraroodcamera
De koeltrap is ontworpen om ervoor te zorgen dat de temperatuurverdeling in het centrale gebied met een diameter van 40 mm gelijkmatig is. Een forward-looking infrared (FLIR) camera wordt gebruikt om de temperatuurverdeling op het agaroppervlak in beeld te brengen. Het maximale temperatuurverschil is ongeveer 1 °C wanneer deT-set 1, 3 of 6 °C is (figuur 8A).
Beoordeling van de koelsnelheid met de snelle koelstrategie
De snelle koelstrategie wordt gebruikt om de koelsnelheid van een trap bij 12 V te karakteriseren. Een 20 °C plaat wordt op de koeltrap geplaatst en een thermokoppelthermometer wordt gebruikt om de oppervlaktetemperatuur te volgen. De fase koelt de platen van 20 °C af tot 6 °C in 6 min, tot 1 °C in 10 minuten en stabiliseert uiteindelijk onder -7 °C in ongeveer 40 minuten (figuur 8B).
De koeltrap gebruiken op een rechtopstaand microscoopplatform
Een rechtopstaande microscoop bestaat meestal uit een objectief voor beeldvorming, een podium voor het vasthouden van monsters en verlichting. Deze koeltrap is ontworpen voor gebruik op een typische rechtopstaande microscooptrap met eenvoudige inbrenging en verwijdering (figuur 8C). Wanneer koelimmobilisatie nodig is voor beeldvorming of screening, wordt de koeltrap eenvoudig op de microscooptrap geplaatst om de installatie te voltooien en vice versa.
Immobilisatie van wormen op de koelplaat wordt getoond in film 1.
Figuur 1: 3D-model van het koelpodiumapparaat. Elektronische verbindingen worden niet getoond voor de duidelijkheid. Een tank pompt water door het koelblok om de warmte te verwijderen die wordt overgedragen door de Peltier die in het podium is ingebed. Een typische 60 mm polystyreen teeltplaat kan op het transparante saffiervenster zitten en per podium worden gekoeld. Model gegenereerd in Solidworks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 3D-modellen van te vervaardigen componenten. (A) Koperen plaat. (B) 3D-geprinte houder . (C) 3D-geprinte isolatieplaat. Modellen gegenereerd in Solidworks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Waterkoelingsassemblage . (A) Afzonderlijke componenten. Buizen gesneden op gespecificeerde lengtes. (B) Aangesloten waterkoelingscomponenten. (C) Draden die de pomptank en de radiator verbinden met de 12 V-voeding. Over het algemeen verbinden rode draden zich met het positieve uiteinde en zwarte draden met het negatieve uiteinde. (D) Gezuiverd water dat in de pomp wordt gegoten. (E) De tank is tot meer dan tweederde gevuld voor optimale pompefficiëntie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Aansluiten van de Peltier en waterkoelingsassemblage. (A) Onderdelen voor de bediening van de Peltier. (B) Het gebruik van de afstembare voeding om de warme en koude kanten van de Peltier te bepalen. Voor de veiligheid wordt niet meer dan 2 V gebruikt. (C) Zelfs toepassing van koelpasta op het oppervlak van koperblok. (D) Zelfs toepassing van koelpasta op het hete oppervlak van Peltier. (E) Hete zijde van de Peltier met koelpasta op het koperblok gedrukt. (F) Infraroodthermometer die wordt gebruikt om de koude oppervlaktetemperatuur van Peltier te meten. Idealiter kan de koude temperatuur oplopen tot in de buurt van -35 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Montage van de koperen plaat en het saffiervenster . (A) Vereiste onderdelen. (B) Koelpasta aangebracht op drie binnenoppervlakken van de koperplaat waar het saffiervenster in contact komt. Twee naar beneden gerichte weergaven van de koperen plaat die de locatie van de drie oppervlakken laten zien. (C) Saffiervenster in het koperen plaatgat. (D) Tape aangebracht op het bovenoppervlak van het samenstel. (E) Bovenzijde: Blauwe stippellijnen geven de locaties aan waar tape moet worden gesneden en verwijderd: vierkante depressie, twee gaten en een saffiergebied met een diameter van 70 mm. (F) Onderzijde: Tape wordt gesneden en verwijderd zoals afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Eindassemblage koelfase . (A) Koelpasta aangebracht op de onderdruk van de koperplaat. (B) Koelpasta aangebracht op de koude zijde van de Peltier. (C) Koud oppervlak van de Peltier verbonden met de depressie. (D) Koperen koelblok dat met schroeven aan de koperen plaat is bevestigd. Koelfase in de isolatiebasis. (E) Voltooide koelfase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Koelfase op de microscoop en thermokoppelmeting . (A) Koeltrap geplaatst op de microscoopbasis voor beeldvorming. Het saffiervenster is transparant, waardoor transilluminatie mogelijk is. (B) Thermokoppelthermometer die wordt gebruikt om de oppervlaktetemperatuur van de NGM-agar te meten. De punt bracht ongeveer 1 mm in de NGM-agar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Karakterisering en gebruik van de koelfase . (A) Warmtebeelden waarop het agaroppervlak is afgekoeld tot 1, 3 en 6 °C. Gelijkmatige temperatuurverdeling binnen het centrale gebied van 40 mm (witte stippelcirkel). (B) Temperatuur van het NGM-agaroppervlak in de loop van de tijd op de koelfase bij 12 V. Het oppervlak van de NGM-agar kan worden gekoeld tot -7 °C. Temperatuur gemeten volgens de methode in figuur 7B. (C) Koelfase in gebruik op een typische rechtopstaande microscoop. De koeltrap kan eenvoudig worden geïnstalleerd of verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| langzame koeling | snelle koeling | abrupte afkoeling | |
| podiumbezetting | minimum | lang | Gemiddeld |
| tijd totdat dieren worden geïmmobiliseerd | lang | Gemiddeld | zeer kort |
| immobilisatiesterkte | sterk | Gemiddeld | Gemiddeld |
| Inspanning van de gebruiker | minimum | iets meer dan het minimum | maximum |
Tabel 1: Vergelijking van koelstrategieën.
| T-set (°C) | ΔT (°C) | V-set (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tabel 2: Parameters om de gewenste temperatuur te bereiken in de snelle koelstrategie.
Aanvullend dossier 1: Koperplaat in metrisch. A2D-tekening voor het bewerken van de koperplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Houder beugel. Een 3D-tekening van een houder die door Solidworks kan worden geopend of gewijzigd en geëxporteerd naar 3D-printsoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: Isolatieplaat. Een 3D-tekening van een isolatieplaat die door Solidworks kan worden geopend of gewijzigd en geëxporteerd naar 3D-printsoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Film 1: Cooling video. Immobilisatiewormen op de NGM-agarplaat bij 2 °C. De plaat werd afgekoeld van kamertemperatuur tot 2 °C en bleef enkele minuten op 2 °C. Vervolgens werd de koelfase uitgeschakeld en begonnen platen op natuurlijke wijze op te warmen tot kamertemperatuur. De video wordt 10x versneld om een video van 1 uur in 6 minuten te passen. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Prijsschatting Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De productie, assemblage en het gebruik van de koelfase worden in dit manuscript getoond. De meeste componenten zijn kant-en-klare items die online kunnen worden gekocht. Sommige componenten, zoals de koperen plaat en het saffiervenster, hebben een aangepaste bestelling nodig en kunnen tot 1 maand duren om te fabriceren. Andere componenten die 3D-geprint kunnen worden, zijn in de meeste onderzoeksinstellingen eenvoudig te fabriceren (aanvullende tabel 1). Het assemblageproces heeft slechts een paar gereedschappen nodig en kan snel worden gedaan door een niet-expert in een paar uur. De meeste biologische laboratoria zouden dit apparaat dus gemakkelijk moeten kunnen implementeren.
De koelfase en de koelimmobilisatiebenadering hebben verschillende belangrijke verbeteringen ten opzichte van bestaande immobilisatiemethoden, zorgvuldig beschreven in de oorspronkelijke publicatie20. Kortom, de koelfase maakt de sterke immobilisatie mogelijk van grote populaties C. elegans van alle leeftijden, inclusief embryo's en dauers, op hun typische kweekplaten onder standaard microscopieworkflows. Het elimineert de noodzaak van complexe hardware-opstellingen, zoals microfluïdica, terwijl het een sterker immobilisatie-effect biedt. Bovendien minimaliseert het de mogelijke toxische chemische blootstelling aan dieren en onderzoekers, omdat er geen chemicaliën worden gebruikt, terwijl het een vergelijkbaar immobilisatie-effect biedt. Deze technische mogelijkheden maken de brede toepassing van dit apparaat en de aanpak van vele experimenten mogelijk die een hoge resolutie in vivo microscopie op grote aantallen dieren vereisen.
Er zijn enkele kritieke stappen tijdens het bouwen van het apparaat, waaronder alle toepassing van koelpasta en de brede tape om het saffiervenster aan de cooperplaat te bevestigen. De koelpasta zorgt voor een sterke thermische geleidbaarheid door openingen te vervangen door een materiaal met een lage thermische weerstand. Om de gewenste koelprestaties te bereiken, moet de pasta op de juiste manier worden ingebracht tussen alle abiterende / contactoppervlakken, inclusief het koude oppervlak van Peltier naar de koperplaat, het Peltier-hete oppervlak naar het koperen koelblok en de koperplaat naar het saffiervenster. De brede tape die op het podium is aangebracht, isoleert de koperen plaat om verwarming door lucht en condensatie te voorkomen, wat tot roest leidt. Het versterkt ook de verbinding tussen het saffiervenster en de koperplaat. Zowel het aanbrengen van koelpasta als de brede tape vereisen dus extra zorg.
In een echt koelimmobilisatie-experiment zijn de parameters in dit manuscript, zoals spanningen en tijden, afhankelijk van de specifieke eigenschappen van de teeltplaten en het stadium, zoals de hoeveelheid agar in de platen, de efficiëntie van het stadium en de omgevingstemperatuur en vochtigheid. In toekomstige wijzigingen kan een feedbackcontroller worden geïnstalleerd, zoals een proportioneel-integraal-derivaat (PID), om de spanningsingang actief aan te passen aan de koelfase om de gewenste temperatuur te bereiken en deze te stabiliseren.
Er zijn verschillende beperkingen van deze immobilisatie van de koelfase, zorgvuldig beschreven in de oorspronkelijke publicatie20. Kortom, dieren die bij verschillende temperaturen worden grootgebracht, worden in verschillende mate geïmmobiliseerd, wat mogelijk extra fine-tuning nodig heeft. Ook is deze huidige koeltrap niet ontworpen voor een omgekeerde microscoop. Verder kan beeldvorming of screening op een teeltplaat direct verontreiniging van de plaat veroorzaken.
We ontwerpen nieuwe versies van de koeltrap die geschikt zijn voor verschillende beeldvormingsplatforms, waaronder samengestelde rechtopstaande microscopen en omgekeerde microscopen. Deze nieuwe ontwerpen zullen directe immobilisatie van dierlijke koeling op kweekplaten mogelijk maken tijdens beeldvorming op deze platforms. De beeldvorming op deze koelfasen maakt gebruik van luchtonderdompelingsdoelstellingen op lange werkafstand, vergelijkbaar met de rechtopstaande configuratie. Tegenwoordig kunnen luchtonderdompelingsobjectieven een numeriek diafragma van maximaal 0,9 hebben, wat ongeveer een resolutie van 300 nm biedt voor beeldvorming van groene fluorescentie-eiwitten. De combinatie van een nieuwe koeltrap met een microscoop zou dus routinematig fluorescentiebeeldvorming met submicronresolutie mogelijk kunnen maken.
We geven ook enkele nuttige tips voor het gebruik van de koelfase volgens onze ervaring. Individuen moeten bijvoorbeeld controleren of er luchtbellen in de waterkoelingsassemblage zitten. Luchtbellen degraderen de koeling naar het hete oppervlak van Peltier en degraderen zo de koeleffectiviteit van de koelfase. Als er luchtbellen aanwezig zijn, moet de 12 V-voeding worden ingeschakeld om het water te laten stromen en moeten alle componenten van de waterstroom worden geschud. Luchtbellen kunnen uit ingesloten gebieden worden gespoeld en door de pomptank worden geventileerd. Onderzoekers moeten ervoor zorgen dat de waterstroombuizen niet worden gebogen of gekruist bij het monteren van de waterkoelingsassemblage. Het buigen of kruisen van buizen kan de adequate waterstroom voorkomen en de koelefficiëntie verminderen. Buisverbindingen moeten goed passen en strak zitten. Indien nodig kan in plaats daarvan een zachte buis met een andere diameter worden gebruikt om dichtheid te garanderen. Pasta mag niet worden aangebracht, zelfs als de verbinding niet strak genoeg is, omdat pasta bij toekomstig gebruik verstoppingen kan veroorzaken. De luchtvochtigheid in de ruimte beïnvloedt de koelprestaties en introduceert condensatie en ijs op de koelfase. Voordat u een kweekplaat op de koelfase plaatst, wordt aanbevolen om een papieren zakdoekje te gebruiken om condensatie te verwijderen of een koellichaam te gebruiken om snel ijs te verwijderen dat zich op het saffiervenster heeft gevormd. De pomptank en radiatorventilatoren kunnen kleine trillingen in de microscoop veroorzaken als ze op dezelfde tafel werken. Microscooptrillingen vertroebelen het verkregen beeld en moeten dus worden vermeden. Een kussen kan worden gebruikt om de tank en radiator mechanisch te isoleren, of ze kunnen op een aparte tafel in de buurt worden geplaatst. De koeltrap kan een verwarmingstrap worden door de elektrische aansluiting op de Peltier om te keren.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We erkennen Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) voor de bewerking van koperplaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
