Summary
本稿では, C. elegansを 元の栽培プレートに まとめて固定化するための冷却ステージを構築・運用するためのプロトコルについて述べる.
Abstract
高解像度 のin vivo 顕微鏡アプローチは、モデル動物の カエノラブディティスエレガンス (C. elegans)の内部の微妙な情報と細部を明らかにすることができますが、画像のモーションブラーを防ぐために強力な動物の固定化が必要です。残念ながら、現在のほとんどの固定化技術はかなりの手作業を必要とし、高解像度のイメージングを低スループットにします。 C.エレガンスの 固定化は、個体群全体を栽培プレートに直接簡単に固定できる冷却アプローチを使用することにより、大幅に簡素化されます。冷却段階は、栽培プレート上に均一な分布を有する広範囲の温度を確立し、維持することができる。この記事では、冷却ステージを構築するプロセス全体について説明します。目的は、典型的な研究者がこのプロトコルに従って実験室で問題なく運用可能な冷却ステージを構築できることです。以下の3つのプロトコルの冷却ステージの利用が示されており、各プロトコルは異なる実験に利点があります。また、最終温度に近づくステージの冷却プロファイルの例と、冷却固定化を使用する際に役立つヒントも示します。
Introduction
高分解能光学顕微鏡は、生体内生体構造を細胞内レベルで研究するために不可欠なツールです。多くの生物学的研究では、ニューロンの形態1,2、膜構造3,4、タンパク質局在5,6など、微妙な解剖学的詳細を解決するためにサブミクロン分解能のイメージングが必要です。高解像度画像は、撮像モダリティおよびプローブ7、8に応じて、数ミリ秒〜数秒の露光時間を必要とする。最適な結果を得るには、顕微鏡ベースの実験を慎重に計画し、実施することが不可欠です。この取り組みに不可欠なのは、高解像度イメージングを容易にする効率的な動物調製方法です。
線虫C.エレガンスは、多くの生物学的プロセスを研究するために広く利用されているモデル生物です9。この小動物は通常、線虫増殖培地(NGM)寒天プレートで培養され、自家受精によって急速に繁殖するため、大規模な研究に適しています。それらの透明性と幅広いラベリング技術により、内部解剖学的構造を簡単に視覚化できます10,11。C.エレガンスの微細構造は、ニューロン再生12、ニューロン変性13、細胞分裂14などの細胞内レベルでの生物学的プロセスの研究に最適です。このような研究では、サブミクロンの解像度でのイメージングと、画像のぼやけを防ぐのに十分な強度の動物の固定化が必要です。強力な固定化は、3D画像スタック(zスタック)やタイムラプスイメージングなど、空間または時間内の複数の画像を含む技術にとって特に重要です。曝露間の動物の動きは、結果を不明瞭にする可能性があります。C. elegansの場合、強力な固定化には、通常、個々の動物を手動で操作し、麻酔薬を使用してスライドに取り付けることが含まれます15,16。これらの時間と労力のかかる手順は、大規模な実験を非常に困難にします。動物を元の培養プレートに直接かつ可逆的に固定化する固定化戦略は、ハイスループット、高解像度イメージングを可能にする可能性があります。
C.エレガンスの冷却固定化はいくつかの研究で示されていますが、広く利用されていません。通常、動物をさらに拘束するためにマイクロ流体装置と組み合わされる17、18、19。しかし、マイクロ流体デバイスは複雑で、重要な操作トレーニングを必要とし、C.エレガンス実験の一般的な固体培養ワークフローと簡単に統合することはできません。したがって、マイクロフルイディクスは、C.エレガンスの固定化に広く利用されていません。ここでは、Chung Laboratoryの最近の出版物20と併せて、これらの欠点に対処するために熱電冷却ステージ(図1)を使用した新しい冷却固定化アプローチを紹介します。冷却段階では、一般的な60mmのポリスチレン栽培プレートを、-8°Cから室温までの任意の目標温度(Tセット)まで冷却することができます。この冷却段階アプローチは、最小限のユーザーの労力で動物集団全体を容易かつ可逆的に固定化することができ、動物処理時間の98%を排除する20。
以下に、冷却ステージをゼロから構築する手順について説明します。部品の機械加工と3D印刷を除いて、特別なツールや専門知識を必要とせずに、手順全体に4時間かかると予想されます。次に、冷却速度を変化させた3つの異なる冷却戦略と、典型的な正立顕微鏡に C.エレガンス を固定化するためのユーザーの努力についてさらに説明します。推奨される戦略は、ユーザー アプリケーションによって異なる場合があります。これら3つの冷却固定化戦略のプロトコルについて詳しく説明します。
Protocol
1.冷却ステージの各コンポーネントの製造と準備
注意: 冷却ステージは、いくつかのコンポーネントで構成されています( 材料表を参照)。ほとんどのコンポーネントは既製です。サファイアウィンドウはカスタムオーダーが必要ですが、銅板、保持ブラケット、および絶縁プレートは、コンピューター数値制御ミルまたは3Dプリンターを使用して現場で製造できます。最初の製造後、後の組み立てプロセスには約2〜3時間かかります。
- コンピューター数値制御ミルを使用して、170 mm x 120 mm x 3 mm、99.9%純銅金属シートから銅板を加工します(図2A)。この製造の2D図面は、 補足ファイル1に記載されています。細かいサンドペーパーを使用して、鋭いエッジや汚れた残留物を取り除きます。
- 保持ブラケットとアイソレーションプレートを製造するには、3Dプリンターと直径1.75 mmのポリ乳酸(PLA)フィラメントを使用します(図2B、C)。より良い品質のために、3Dプリンターは0.2 mmより細かい層の高さを提供する必要があります.3Dモデルは 補足ファイル2 と 補足ファイル3で提供されます。
2.水冷アセンブリの構築
- 水冷アセンブリを構築するために、白金硬化シリコンチューブ、ポンプタンク、銅冷却ブロック、およびラジエーター(図3A)を準備します。かみそりの刃、はさみ、六角レンチを使用できるように準備します。組み立て全体で水を使用することによる電気的危険に注意してください。
- シリコンチューブを推奨長さ40 cm、50 cm、および80 cmの3つのセクションにカットします。必要に応じて長さを調整します。
- 図2.2に示すように、手順3Bに示すように、手順3のシリコンチューブセクションをラジエーター、ポンプタンク、および銅冷却ブロックのポートに差し込みます。すべての接続が防水であることを確認してください。これで水冷アセンブリが構築されました。
- 水冷アセンブリー、12 V 電源機構、3 本の赤ジャンパー線と 3 本の黒ジャンパー線、ブレッドボード、および 500 mL の精製水を準備します。
- 電気の安全のために、作業台に液体がないことを確認してください。
- ポンプタンクとラジエーターのワイヤーをブレッドボードを介して12V電源に接続します(図3C)。ブレッドボードは便宜上使用されています。
注意: より永続的で安全な接続のために、研究者はブレッドボードをはんだ付けワイヤーに置き換えることができます。 - マイナスドライバーを使用してポンプタンクキャップを開きます。漏斗を使用して、ポンプタンクが約80%いっぱいになるまで水を追加します(図3D)。この充填後は、ポンプタンクに蓋をしないでください。
- 12 V電源を差し込むか、スイッチをオンにする(スイッチがある場合)ことにより、水冷アセンブリの電源を入れます。電源を入れると、水がアセンブリ内を流れ、ラジエーターのファンが吹き飛ばされます。
- ポンプタンクからの水の流れにより、タンク内の液面が低下します。ポンプタンクがほぼ2/3いっぱいになるまで、ポンプタンクに水を追加します(図3E)。
- ラジエーターを振って気泡を取り除き、冷却タンクに蓋をします。
- 次の手順に進む前に、電源をオフにしてください。
3. ペルチェの低温および高温表面のテスト
注意: 冷却ステージの主要コンポーネントであるペルチェは、一方の側からもう一方の側に熱を伝達するソリッドステートアクティブヒートポンプです21。ペルチェの一方の表面は熱くなり、もう一方の面は電力を供給するときに冷たくなります。デフォルトでは、ペルチェメーカーは販売前に冷たい表面にマークを付けますが、組み立てる前に手動でテストすると便利です。
- チューナブル電源機構とペルチェを準備します ( 図 4A を参照)。
- 電気的危険を防ぐために、チューナブル電源がオフになっていることを確認してください。
- ペルチェの赤い線を正の出力に接続し、黒い線を電源に付属のワニ口クリップ付きのチューナブル電源の負の出力に接続します(図4B)。
- チューナブル電源をオンにし、電源の一番上の行にある電圧ノブと電流ノブの両方を変調して、約2Vに設定します。すぐに素指でペルチェの2つの表面を感じます。片方の表面は数秒以内に冷たくなります。
- どの表面が冷えているかを特定したら、すぐに電源を切り、ペルチェを外します。
- マーカーを使用して、将来の組み立てのために冷たい表面を示します。
4. 水冷アセンブリを用いてペルチェを冷却するアセンブリの構築
- 図4Aに示すように、スイッチオフした水冷アセンブリ、ペルチェ(冷たい表面がマークされています)、およびサーマルペースト(熱伝導を改善するため)を準備します。
- 水冷アセンブリ内の銅冷却ブロックのすべての表面を70%エタノール(またはその他のクリーナー溶液)で洗浄します。
- 銅水冷ブロックの一方の表面に約0.4 gのサーマルペーストを塗布し、この面の向きが下を向いたときにチューブが交差したり曲がったりするのを防ぎます。手袋を使用して皮膚を保護し、サーマルペーストを薄く均一に分散させます(図4C)。
- 同様に、ペルチェの高温の表面をきれいにしてから、サーマルペーストを表面に塗布します(図4D)。
- ペルチェ高温面をサーマルペーストで銅冷却ブロック面に接続します。それが安全であることを確認するために圧力をかけます。 図 4E に示すように、ペルチェのワイヤと銅冷却ブロックのチューブの向きに従います。余分なサーマルペーストをきれいにします。
- 12 V 電源機構とチューナブル電源機構の両方をオフにしてください。セクション3のように、ペルチェをチューナブル電源に接続します。
- 電気および水冷アセンブリー接続の両方を再確認してから、12 V 電源機構とチューナブル電源機構を順次オンにします。
- チューナブル電源を徐々に 12 V に切り替えます。推奨ペルチェを使用すると、電流は約7.3Aになります。
- 2分間待ちます。ペルチェ低温表面の温度は-35°Cより低くなるはずです。 赤外線温度計でこの温度を測定します(図4F)。手の怪我を防ぐために、冷たい表面に触れないでください。
- 温度が-30°C未満に到達できない場合は、すべての接続とコンポーネントを確認してください。 水冷アセンブリ内の気泡は、最適ではない冷却性能の考えられる理由です。
- 後の手順で安全を確保するには、チューナブル電源をオフにし、1 分間待ってから、12 V 電源をオフにします。
5.銅板とサファイアウィンドウアセンブリの構築
- 銅板、直径80 mmのサファイアウィンドウ、サーマルペースト、幅4インチのテープ、および切断用の鋭利な刃を準備します(図5A)。
- 銅板とサファイアウィンドウを70%エタノールで慎重に洗浄し、細かいサンドペーパーを使用して粗い表面を滑らかにします。
- 図5Bに示すように、3つの内面にサーマルペーストを塗布します。サーマルペーストが3つの表面積すべてを覆っているが、厚すぎず、約0.5mmであることを確認してください。
- プリンタ用紙で保護されたベンチトップに銅板を置きます。この紙は、後のクリーンアップを容易にします。
- サファイアウィンドウを銅板の穴に挿入します(図5C)。サーマルペーストが他の領域に移動するのを防ぐために、挿入中にサファイアが回転しないようにしてください。余分なサーマルペーストを取り除きます。
- 4インチ幅のテープを銅板サファイアウィンドウアセンブリの上面( 図5Dに示すように、正方形のくぼみ領域がある面)に接着します。貼り付け中は、接着を片側から反対側にゆっくりとガイドすることにより、テープと銅の表面の間に気泡が発生しないようにします。
- テープの指定された青い破線の領域を、鋭利な刃物を使用して切り取ります ( 図 5E を参照)。切断により、2つのねじ穴、正方形のくぼみ、およびサファイアウィンドウの直径70mmの領域が露出します。
- 銅板サファイアウィンドウアセンブリの底面をテープで固定し、 図5Fに示すように、この面で切断手順(サファイア領域のみ)を繰り返します。
注意: これで、サファイアウィンドウが銅板に固定され、銅の表面が錆から保護されます。
6.冷却段階の最終組み立て
- すべての重要なサブアセンブリとコンポーネントの準備ができていることを確認します。
- 銅板の四角いくぼみに約0.4gのサーマルペーストを塗布します(図6A)。
- ペルチェの冷たい表面に約0.4 gのサーマルペーストを塗布します。ペルチェはすでに銅製の冷却ブロックに取り付けられていることに注意してください(図6B)。
- ペルチェの冷たい表面を下向きの圧力で銅板のくぼみに接続します。余分なサーマルペーストをすべて取り除きます(図6C)。
- 3Dプリントされたブラケットを銅製の冷却ブロックの上部に取り付け、六角レンチを使用して2本の8-32、0.5インチの長さのネジを締めてブラケットを銅板に固定します(図6D)。ペルチェから銅への適切な熱伝導を確保するために、印刷されたブラケットが壊れたり変形したりしないように、低トルクの締め付けを使用してください。
- 銅板を3Dプリントされた絶縁ベースに配置して、操作中にベンチトップまたは顕微鏡ベースから熱絶縁します(図6D)。
- 冷却ステージが組み立てられ、すぐに使用できます(図6E)。
- 顕微鏡の場合は、完成した冷却ステージを正立顕微鏡プラットフォームに置きます(図7A)。
- 冷却ステージの組み立てが完了しました。さらなる詳細は、詳細な戦略と動物の動きを完全に特徴付けるChung Laboratoryのコンパニオン出版物から入手できます20。
メモ: 以下の項では、低速、高速、および急な冷却プロトコルについて説明します。L4または若年成人年齢のN2雌雄同体を使用して、以下のデータを作成しました。徐冷戦略は、20°Cで培養したN2動物を6°Cで固定化するのに役立ちます。15°Cで培養したN2動物は、1°C20で最も強く固定化される。これら3つの冷却プロトコルの簡単な比較を 表1に示します。
7.徐冷固定化プロトコル
- 蓋をした栽培プレートを4°Cの冷蔵庫に移します。
- 栽培プレートを冷蔵庫に移動した後、冷却ステージの12 V電源をオンにし、調整可能な電源電圧を5.5 Vに設定します。
- 蓋付き培養プレートを4°Cの冷蔵庫に1時間置いた後、すぐにプレートを冷却段階に移し、蓋を外します(図7A)。このような栽培プレートは、通常6°C前後である。 予冷されたステージは安定しており、寒天表面を6°Cに維持するのに十分な低温です。
- 寒天の表面温度が測定または動物の動きに注意して変化した場合は、6°Cで安定するまで電圧をわずかに調整します。
- 動物は移管時に適切に固定されています。
8.高速冷却固定プロトコル
注意: 急速冷却戦略は、最も基本的な固定方法です(ムービー1を参照)。ただし、寒天プレートは、Tセットに到達している間、長時間ステージをアイドル状態で占有します。また、強力な固定化が必要で、Tセット が6°Cの場合、アイドル時間は約1時間20に延長されます。
- 冷却ステージの12V電源をオンにし、チューナブル電源電圧を約12Vに設定します。 10分待ちます。
- 栽培プレートをインキュベーターから直接冷却段階に持ち込み、蓋を外します。
- 寒天表面温度が(Tセット+ ΔT)°Cに下がったら、チューナブル電源をVセットに調整し、寒天がTセットに達するまで待ちます。Vセットは、Tセットで寒天を安定させるのに適した電圧です。ΔTは過冷却を防ぐ変数です。Tセット、ΔT、およびVセットの組み合わせについては、表2を参照してください。
注: 表2 に示されているデータは、特にChung研究所に関するものであるため、実験パラメータは、個々の実験の固有の環境および使用条件に基づいて異なる場合があることに注意してください。 - 寒天がTセットに達すると動物は固定化されます。固定化は、冷却開始後~50分までの時間とともに改善されます。
9.突然の冷却固定プロトコル
注:突然の冷却戦略は、最も多くのユーザー時間を消費しますが、培養温度から動物を最も急速に固定します。
- 冷却ステージの12V電源をオンにし、チューナブル電源電圧を約12Vに回します。 10分間保持します。
- 空いている寒天プレートを冷却ステージに持ち込みます。急速冷却固定化プロトコルのステップ8.3を使用して、Tセットで寒天表面温度を安定させます。
- 動物を元の栽培プレートから冷却ステージに座っている冷却プレートに移動します。
- 小動物のサイズに基づいて、動物は数秒で設定された Tまで冷却され、固定されることが期待されます。固定化は、冷却開始後~50分までの時間とともに改善されます。
10.冷却固定化後の動物の復活
- 冷却した培養プレートを元のインキュベーターまたは室温に戻します。
- プレート上のすべてのワームが通常のクロールと摂食動作に復活するまで、20分から1時間待ちます。
Representative Results
冷却温度測定
初期の冷却固定化実験では、寒天表面温度を追跡して、動物が適切に固定化できることを確認することが重要です。最初の実験から複製される将来の実験では、通常は頻繁な温度追跡なしで、同じパラメータを利用できます。温度測定のために、温度計の熱電対の先端は70%エタノール溶液を使用して滅菌され、エタノールが完全に蒸発するまで待ってから使用します。次に、熱電対の先端をNGM寒天に1 mm挿入して、正確な温度読み取りを確保します。温度計の先端は、クランプホルダーまたは他のホルダーを使用して保持されます(図7B)。
赤外線カメラによる温度測定
冷却ステージは、プレートの中央直径40mm領域の温度分布が均一になるように設計されています。前方赤外線(FLIR)カメラを使用して、寒天表面の温度分布を画像化します。Tセット が1、3、または6°Cの場合、最大温度差は約1°Cです(図8A)。
高速冷却戦略による冷却速度の評価
高速冷却戦略は、12Vでのステージの冷却速度を特徴付けるために使用されます。20°Cのプレートを冷却ステージに置き、熱電対温度計を使用して表面温度を追跡します。ステージは、20°Cのプレートを6分で6°Cに冷却し、10分で1°Cに冷却し、最終的に約40分で-7°C未満に安定します(図8B)。
正立顕微鏡プラットフォームでの冷却ステージの使用
正立顕微鏡は通常、イメージング用の対物レンズ、サンプルを保持するためのステージ、および照明で構成されます。この冷却ステージは、挿入と取り外しが容易な一般的な正立顕微鏡ステージで使用するように設計されています(図8C)。イメージングやスクリーニングのために冷却固定化が必要な場合は、冷却ステージを顕微鏡ステージに置くだけで分割払いが終了し、その逆も可能です。
冷却プレートへのワームの固定化は、 動画1に示されています。
図1:冷却ステージ装置の3Dモデル。 わかりやすくするために、電子接続は示されていません。タンクは冷却ブロックを通して水を送り込み、ステージに埋め込まれたペルチェによって伝達される熱を取り除きます。典型的な60mmのポリスチレン栽培プレートは、透明なサファイア窓の上に置き、段階的に冷却することができます。ソリッドワークスで生成されたモデル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:製造する部品の3Dモデル。 (A)銅板。(B)3Dプリントされた保持ブラケット。(C)3Dプリントされたアイソレーションプレート。ソリッドワークスで生成されたモデル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:水冷アセンブリ 。 (A)個々のコンポーネント。チューブは指定された長さにカットされます。(B)水冷部品が接続されています。(C)ポンプタンクとラジエーターを12V電源に接続するワイヤー。一般に、赤い線はプラスの端に接続し、黒いワイヤーはマイナスの端に接続します。(D)精製水をポンプに注いだ。(E)最適なポンプ効率のためにタンクが3分の2以上満たされている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ペルチェと水冷アセンブリの接続 。 (A)ペルチェを操作するためのコンポーネント。(B)調整可能な電源を使用して、ペルチェの高温側と低温側を決定します。安全のため、2V以下を使用します。(C)銅ブロックの表面にサーマルペーストを塗布することもできます。(D)ペルチェ高温表面へのサーマルペーストの塗布も。(E)ペルチェの高温側をサーマルペーストで銅ブロックに押し付けます。(F)ペルチェ低温表面温度を測定するために使用される赤外線温度計。理想的には、低温は-35°C近くに達することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:銅板とサファイア窓の組み立て 。 (A)必要なコンポーネント。(B)サファイア窓が接触する銅板の3つの内面にサーマルペーストを塗布します。3つの表面の位置を示す銅板の2つの下向きのビュー。(C)銅板の穴にあるサファイア窓。(D)アセンブリの上面にテープを貼る。(E)上面:青い破線は、テープを切断および除去する場所を示します:正方形のくぼみ、2つの穴、および直径70mmのサファイア領域。(F)底面:図のようにテープを切断して剥がします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:冷却段階の最終組み立て 。 (A)銅板のくぼみにサーマルペーストを塗布。(B)ペルチェの低温側に塗布されたサーマルペースト。(C)窪みに接続されたペルチェの冷たい表面。(D)ネジを使用して銅板に固定された銅冷却ブロック。アイソレーションベースの冷却ステージ。(E)冷却段階が完了しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:顕微鏡の冷却ステージと熱電対測定 。 (A)イメージングのために顕微鏡ベースに配置された冷却ステージ。サファイアウィンドウは透明で、透過照明が可能です。(B)NGM寒天表面温度の測定に使用した熱電対温度計。先端をNGM寒天培地に約1mm挿入した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:冷却ステージの特性と使用法 。 (A)1、3、6°Cに冷却した寒天表面を示す熱画像。 中央40mm以内の均一な温度分布(白い破線の円)。(b)12Vでの冷却ステージでのNGM寒天表面の経時的な温度。NGM寒天表面は-7°C以下に冷却することができます。 当該方法で測定した温度を 図7Bに示す。(C)一般的な正立顕微鏡で使用されている冷却ステージ。冷却ステージは簡単に取り付けまたは取り外すことができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 徐冷 | 急速冷却 | 急激な冷却 | |
| 舞台職業 | 最低限 | 長い | 中程度 |
| 動物が動けなくなるまでの時間 | 長い | 中程度 | 非常に短い |
| 固定化強度 | 強い | 中程度 | 中程度 |
| ユーザーの努力 | 最低限 | 最小値よりわずかに大きい | 最大 |
表1:冷却戦略の比較。
| Tセット (°C) | ΔT (°C) | Vセット (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
表2:急速冷却戦略で目的の温度を達成するためのパラメータ。
補足ファイル1:メートル法の銅板。銅板を加工するためのA2D図面。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:保持ブラケット。 保持ブラケットの 3D 図面で、Solidworks で開いたり修正したり、3D プリント ソフトウェアにエクスポートしたりできます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:アイソレーションプレート。 Solidworksで開いたり修正したりして、3Dプリント ソフトウェアにエクスポートできるアイソレーション プレートの 3D 図面。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画1:冷却ビデオ。 2°CのNGM寒天プレート上の固定化ワーム。 プレートを室温から2°Cまで冷却し、2°Cで数分間滞在した。その後、冷却ステージをオフにし、プレートを自然に室温まで温め始めました。ビデオは10分で1時間のビデオに合うように6倍高速化 されています。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:価格の見積もり このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
冷却段階の製造、組み立て、および使用法は、この原稿に示されています。ほとんどのコンポーネントは、オンラインで購入できる既製のアイテムです。銅板やサファイアウィンドウなどの一部のコンポーネントは、カスタムオーダーが必要であり、製造に最大1か月かかる場合があります。3Dプリントできる他のコンポーネントは、ほとんどの研究機関で簡単に製造できます(補足表1)。組み立てプロセスはほんの数個のツールしか必要とせず、専門家でなくても数時間で迅速に行うことができます。したがって、ほとんどの生物学研究所はこの装置を容易に実装することができるはずである。
冷却段階および冷却固定化アプローチは、既存の固定化方法に比べていくつかの重要な改善を有しており、元の刊行物20に注意深く詳述されている。簡単に言うと、冷却段階は、標準的な顕微鏡ワークフローの下で、胚やダウアーを含むすべての年齢の C.エレガンスの 大規模な集団を典型的な培養プレートに強力に固定化することができます。マイクロフルイディクスのような複雑なハードウェアセットアップが不要になり、より強力な固定化効果が得られます。さらに、化学物質を使用しないため、動物や研究者への有毒化学物質への曝露の可能性を最小限に抑えながら、同様の固定化効果を提供します。これらの技術的能力により、このデバイスの幅広いアプリケーションと、多数の動物に対する高解像度 のin vivo 顕微鏡を必要とする多くの実験へのアプローチが可能になります。
デバイスの構築中には、すべてのサーマルペースト塗布やサファイアウィンドウをクーパープレートに固定するための幅広のテープなど、いくつかの重要な手順があります。サーマルペーストは、ギャップを低熱抵抗材料に置き換えることにより、強力な熱伝導率を保証します。望ましい冷却性能を実現するには、ペルチェ低温表面と銅板、ペルチェ高温表面と銅冷却ブロック、銅板とサファイアウィンドウなど、すべての隣接/接触面の間にペーストを適切に導入する必要があります。ステージに貼られた幅広のテープが銅板を隔離し、空気による加熱や結露による錆の発生を防ぎます。また、サファイアウィンドウと銅板の間の接続を強化します。したがって、サーマルペーストと幅広のテープの塗布の両方に特別な注意が必要です。
実際の冷却固定化実験では、この原稿で提供される電圧や時間などのパラメータは、プレート内の寒天の量、ステージの効率、周囲の温度と湿度など、栽培プレートとステージの特定の特性に依存します。将来の変更では、比例積分微分(PID)などのフィードバックコントローラーをインストールして、冷却ステージへの電圧入力をアクティブに調整して、目的の温度を達成し、安定させることができます。
この冷却段階固定化にはいくつかの制限があり、元の公報20に注意深く詳述されている。簡単に言えば、異なる温度で飼育された動物は異なる程度に固定されており、特別な微調整が必要な場合があります。また、この現在の冷却ステージは倒立顕微鏡用に設計されていません。さらに、栽培プレート上での画像化またはスクリーニングは、プレートに直接汚染をもたらす可能性がある。
複合正立顕微鏡や倒立顕微鏡など、さまざまなイメージングプラットフォームに適した新しいバージョンの冷却ステージを設計しています。これらの新しい設計により、これらのプラットフォームでのイメージング中に、培養プレートへの動物の直接冷却固定が可能になります。これらの冷却ステージでのイメージングでは、直立構成と同様に、長作動距離の空気浸漬対物レンズを使用します。現在、空気浸対物レンズの開口数は最大0.9で、緑色蛍光タンパク質イメージングに約300 nmの分解能を提供します。したがって、新しい冷却ステージと顕微鏡の組み合わせにより、サブミクロン分解能の蛍光イメージングを日常的に可能にすることができます。
また、経験に応じて冷却ステージを使用するための役立つヒントもいくつか提供します。たとえば、個人は水冷アセンブリ内に気泡があるかどうかを確認する必要があります。気泡はペルチェ高温面への冷却を低下させ、したがって冷却段階の冷却効果を低下させる。気泡が存在する場合は、12 V電源をオンにして水を流し、水流のすべてのコンポーネントを振る必要があります。気泡は閉じ込められた領域から洗い流され、ポンプタンクによって排出されます。研究者は、水冷アセンブリを組み立てるときに、水流チューブが曲がったり交差したりしないようにする必要があります。チューブが曲がったり交差したりすると、適切な水の流れが妨げられ、冷却効果が低下する可能性があります。チューブ接続は適切にフィットし、しっかりと締まっている必要があります。必要に応じて、気密性を確保するために、代わりに直径の異なる柔らかいチューブを使用できます。ペーストは、接続が十分に締まっていなくても、将来の使用中に詰まりを引き起こす可能性があるため、貼り付けないでください。部屋の湿度は冷却性能に影響を与え、冷却ステージに結露と氷を発生させます。栽培プレートを冷却段階に置く前に、紙ティッシュを使用して結露を除去するか、ヒートシンクを使用してサファイアウィンドウに形成された氷をすばやく除去することをお勧めします。ポンプタンクとラジエーターファンは、同じテーブルで作業すると顕微鏡に小さな振動を引き起こす可能性があります。顕微鏡の振動は取得した画像をぼかすため、避ける必要があります。クッションを使用してタンクとラジエーターを機械的に断熱することも、近くの別のテーブルに置くこともできます。冷却ステージは、ペルチェへの電気的接続を逆にすることで加熱ステージになることができます。
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益またはその他の利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
銅板加工のノア・ジョセフ(北東バイオエンジニアリング部門)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
