यहां, हम चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उन्हें कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग करते हैं। चूहे अक्सर एक पसंदीदा प्रीक्लिनिकल मॉडल होते हैं, और मजबूत आंतों के ऑर्गेनॉइड सिस्टम विवो अध्ययनों में साथ देने के लिए इन विट्रो सिस्टम की आवश्यकता को पूरा करते हैं।
शरीर विज्ञान और सेल भाग्य निर्णयों का आकलन करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करते समय, एक मॉडल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो विवो संदर्भों में बारीकी से पुनरावृत्ति करता है। तदनुसार, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा की खोज और व्यक्तिगत उपचार स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है। माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आमतौर पर आंतों के कार्य / शरीर विज्ञान और स्टेम सेल गतिशीलता / भाग्य निर्णय दोनों के पहलुओं को समझने के लिए किया जाता है। हालांकि, कई रोग संदर्भों में, चूहों को अक्सर चूहों पर एक मॉडल के रूप में पसंद किया जाता है क्योंकि रोग पैथोफिज़ियोलॉजी के संदर्भ में मनुष्यों के लिए उनकी अधिक शारीरिक समानता होती है। चूहे के मॉडल को विवो में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की कमी से सीमित किया गया है, और चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड ्स नाजुक साबित हुए हैं और लंबे समय तक कल्चर करना मुश्किल है। यहां, हम ग्रहणी और जेजुनम से चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड को मजबूत रूप से उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर निर्माण करते हैं। हम चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों का अवलोकन प्रदान करते हैं, जिसमें कार्यात्मक सूजन परख, पूरे माउंट धुंधलापन, 2 डी एंटरोइड मोनोलेयर की पीढ़ी और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन शामिल हैं। चूहा ऑर्गनॉइड मॉडल एक इन विट्रो मॉडल के लिए क्षेत्र की आवश्यकता का एक व्यावहारिक समाधान प्रदान करता है जो मनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है, जल्दी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, और मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की खरीद में शामिल बाधाओं के बिना आसानी से प्राप्त किया जाता है।
मानव छोटी आंतों के उपकला वास्तुकला और सेलुलर संरचना जटिल हैं, जो उनके शारीरिक कार्यों को दर्शाती हैं। छोटी आंत की प्राथमिक भूमिका अपने लुमेन1 से गुजरने वाले भोजन से पोषक तत्वों को अवशोषित करना है। इस कार्य को अधिकतम करने के लिए, आंतों की सतह को विली नामक उंगली जैसे प्रोट्रूशियंस में व्यवस्थित किया जाता है, जो अवशोषक सतह क्षेत्र को बढ़ाता है, और कप जैसे इनवेजाइनेशन जिसे क्रिप्ट्स कहा जाता है, जो स्टेम कोशिकाओं को घर और इन्सुलेट करते हैं। एपिथेलियम के भीतर, विभिन्न विशेष अवशोषक और स्रावी सेल प्रकार अलग-अलगकार्य करने के लिए उत्पन्न होते हैं। इस जटिलता के कारण, उच्च मार्ग-रूपांतरित अमर कोशिका लाइनों में आंत जैसे ऊतकों को मॉडल करना मुश्किल हो गया है। हालांकि, स्टेम कोशिकाओं, विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं और उनके भेदभाव तंत्र के अध्ययन ने 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के विकास के लिए अनुमति दी है। ऑर्गनॉइड मॉडल के उपयोग ने क्षेत्र को बदल दिया है, कुछ वास्तुशिल्प घटकों और बरकरार आंत में पाए जाने वाले सेल प्रकार की विषमता के उनके पुनर्मूल्यांकन के कारण। सक्रिय स्टेम सेल आबादी2 के रखरखाव के कारण आंतों के ऑर्गेनोइड्स को लंबे समय तक इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है।
आंतों के ऑर्गेनोइड्स तेजी से स्टेम सेल जीव विज्ञान, सेल फिजियोलॉजी, आनुवंशिक रोग और पोषण3,4 का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलनीय मॉडल बन गए हैं, साथ ही साथ नई दवा वितरण विधियों को विकसित करने के लिए एक उपकरण5। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा की खोज और व्यक्तिगत उपचार स्क्रीनिंग के लिए किया जा रहा है, अन्य 6,7,8,9 के बीच। हालांकि, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड अभी भी चुनौतियां पेश करते हैं। ऊतक की उपलब्धता, संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी के लिए आवश्यकताएं, और नैतिक मुद्दे मानव नमूनों के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। इसके अतिरिक्त, आंतों के क्रिप्ट से उत्पन्न मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स को उदासीन स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव के लिए या परिपक्व सेल प्रकारों के भेदभाव को प्रेरित करनेके लिए दो अलग-अलग संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है। यह विवो के साथ विरोधाभास ी है, जहां स्टेम सेल और परिपक्व विभेदित सेल प्रकार एक साथ मौजूद होते हैं और लगातार उत्पन्न/ बनाए रखते हैं। दूसरी ओर, माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स, जो विकास कारकों के कम जटिल कॉकटेल में उगाए जाते हैं, को मीडिया संरचना में इस स्विच की आवश्यकता नहीं होती है और एक हीमीडिया संदर्भ 2,11 में स्टेम कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं को बनाए रख सकते हैं। हालांकि, मनुष्यों की तुलना में माउस आंत में महत्वपूर्ण अंतर माउस ऑर्गेनोइड्स को कई उदाहरणों में एक उप-मानक मॉडल बना सकते हैं। कुल मिलाकर, घोड़ों, सूअरों, भेड़, गायों, कुत्तों और बिल्लियों सहित बड़े स्तनधारियों से कई आंतों के ऑर्गेनोइड्स, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति स्थितियों की तुलना में माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स के साथ अधिक निकटता से संरेखित संस्कृति स्थितियों में सफलतापूर्वक उत्पन्न हुएहैं। माउस और मानव ऑर्गेनोइड्स के बीच विकास कारक स्थितियों में अंतर संभवतः स्टेम सेल आला संरचना में अंतर और स्टेम सेल अस्तित्व, प्रसार और रखरखाव के लिए अलग-अलग आवश्यकताओं को दर्शाता है। इसलिए, एक आसानी से सुलभ मॉडल ऑर्गनॉइड सिस्टम की आवश्यकता है जो 1) मानव आंतों की कोशिका संरचना से निकटता से मिलता-जुलता है, 2) मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स की तरह विकास कारक आवश्यकताओं के साथ स्टेम कोशिकाएं शामिल हैं, और 3) लगातार उदासीन और विभेदित डिब्बों को बनाए रखने में सक्षम है। आदर्श रूप से, प्रणाली आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल से होगी, जैसे कि विवो और इन विट्रो प्रयोगों में सहसंबद्ध किया जा सकता है और मिलकर उपयोग किया जा सकता है।
चूहे आंतों के शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी अध्ययन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रीक्लिनिकल मॉडल हैं क्योंकि उनके बहुत समान आंतों के शरीर विज्ञान और जैव रसायन13 हैं, विशेष रूप से आंतों की पारगम्यता14 के संबंध में। चूहों की तुलना में उनका अपेक्षाकृत बड़ा आकार उन्हें शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए अधिक उत्तरदायी बनाता है। जबकि सूअरों सहित बड़े पशु मॉडल कभी-कभी उपयोग किए जाते हैं, चूहे एक अधिक किफायती मॉडल हैं, पशुपालन के लिए कम जगह की आवश्यकता होती है, और आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानक उपभेद15 होते हैं। चूहे के मॉडल का उपयोग करने का एक दोष यह है कि विवो अध्ययनों में आनुवंशिक टूलकिट चूहों की तुलना में अच्छी तरह से विकसित नहीं है, और नॉकआउट, नॉक-इन और ट्रांसजेनिक सहित नई चूहे लाइनों की पीढ़ी अक्सर लागत-निषेधात्मक होती है। एक मजबूत चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल का विकास और अनुकूलन एक सुलभ मॉडल में आनुवंशिक हेरफेर, औषधीय उपचार और उच्च थ्रूपुट अध्ययन की अनुमति देगा जो मनुष्यों के लिए महत्वपूर्ण शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है। हालांकि, एक कृंतक ऑर्गनॉइड मॉडल बनाम दूसरे के फायदे अध्ययन की जा रही विशेष प्रक्रिया या जीन पर अत्यधिक निर्भर हैं; मनुष्यों में पाए जाने वाले कुछ जीन चूहों में स्यूडोजीन हो सकते हैं लेकिन चूहों16,17 नहीं। इसके अतिरिक्त, प्रजाति-विशिष्ट सेल उपप्रकारों का अनावरण तेजी से एकल-सेल आरएनएसेक 18,19,20 द्वारा किया जा रहा है। अंत में, चूहे और माउस आंतों के रोग मॉडल अक्सर फेनोटाइप्स21,22 में काफी भिन्नताएं प्रदर्शित करते हैं जैसे कि मनुष्यों में देखे गए लक्षणों और रोग प्रक्रिया को अधिक बारीकी से पुन: प्रस्तुत करने वाले मॉडल को डाउनस्ट्रीम काम के लिए चुना जाना चाहिए। चूहे के आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल की पीढ़ी शोधकर्ताओं को उनकी परिस्थितियों के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल प्रणाली का चयन करने में अतिरिक्त लचीलापन और विकल्प प्रदान करती है। यहां, चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल23,24 का विस्तार किया गया है और ग्रहणी या जेजुनम से चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड ्स की पीढ़ी और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार की गई है। इसके अलावा, लेंटिवायरल संक्रमण, पूरे माउंट स्टेनिंग और फोर्सकोलिन सूजन परख सहित कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों का वर्णन किया गया है।
चूहे की आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल का विकास विवो में अंग में पाए जाने वाले महत्वपूर्ण कार्यात्मक विशेषताओं को संरक्षित करता है और प्रीक्लिनिकल परीक्षण, दवा स्क्रीनिंग और कार्यात्मक परख के लिए एक आशाजनक उपकरण है। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग विवो प्रीक्लिनिकल गैस्ट्रोएंटरोलॉजी अध्ययनों के समानांतर किया जा सकता है, जिसके लिए चूहे अक्सर अपने बड़े आंतों के आकार, मनुष्यों के साथ साझा शारीरिक पहलुओं और कुछ मामलों में बेहतर रोग मॉडल38 होने के कारण एक पसंदीदा मॉडल होते हैं। यहां, चूहे की आंतों के क्रिप्ट्स के अलगाव, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और दीर्घकालिक संस्कृति के साथ-साथ कार्यात्मक फोर्स्कोलिन सूजन परख, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, 2 डी मोनोलेयर कल्चर और लेंटिवायरल आनुवंशिक हेरफेर सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक मजबूत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स कई रोग संदर्भों में प्रासंगिक होने की संभावना है जहां माउस मॉडल का पैथोफिज़ियोलॉजी अनुचित है और माउस आंतों के ऑर्गेनोइड की तुलना में मानव आंतों के शरीर विज्ञान के लिए एक बेहतर मॉडल प्रदान कर सकता है।
लंबे समय तक रहने वाले ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए जिन्हें पारित और विस्तारित किया जा सकता है, आंतों के उपकला प्रसार को बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रमुख विकास कारकों की पहचान करना आवश्यक है। माउस ऑर्गेनोइड्स को अक्सर ईजीएफ, आर-स्पोंडिन और नोगिन के एक साधारण कॉकटेल में उगाया जाता है, हालांकि यह बताया गया है कि आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर39 के लिए नोगिन आवश्यक नहीं है। वातानुकूलित मीडिया पुनः संयोजक विकास कारकों को प्रतिस्थापित कर सकता है और सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें एल-डब्ल्यूआरएन हैं, जो डब्ल्यूएनटी 3 ए, आरएसपोंडिन -3, और नोगिन39, एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए और एचए-आरएसपोंडिन 1-एफसी 293 टी कोशिकाओं40 को स्रावित करती हैं। एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया न केवल माउस आंतों के39 ऑर्गेनॉइड विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है, बल्कि कुत्तों, बिल्लियों, मुर्गियों, घोड़ों, गायों, भेड़ और सूअरों सहित कई खेत जानवरों और साथी जानवरों से आंतों के ऑर्गेनोइड ्स की वृद्धि का समर्थन करताहै। हालांकि, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड ्स उनकी विकास कारक आवश्यकताओं में बहुत अलग हैं, क्योंकि उन्हें अपने विस्तार विकास चरण (यानी, छोटे से बड़े स्फेरॉइड तक प्रगति) बनाम उनके भेदभाव चरण (यानी, विभेदित सेल प्रकारों की पीढ़ी और परिपक्वता) के लिए अलग-अलग मीडिया फॉर्मूलेशन की आवश्यकता होती है। चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की मीडिया आवश्यकताएं मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए विस्तार विकास मीडिया को बारीकी से प्रतिबिंबित करती हैं, फिर भी, विशेष रूप से, चूहे के ऑर्गेनोइड इस मीडिया वातावरण में विकास और भेदभाव दोनों में सक्षम हैं, जो उनकी संस्कृति आवश्यकताओं को काफी सरल बनाते हैं। जबकि हमारे शुरुआती प्रयासों ने एल-डब्ल्यूआरएन-वातानुकूलित मीडिया में चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने और बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित किया, दीर्घकालिक संस्कृति कमजोर थी, और चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड लाइनों को मजबूती की कमी का सामना करना पड़ा (डेटा नहीं दिखाया गया)। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि एल-डब्ल्यूआरएन सेल लाइनों को आर-स्पोंडिन 3 को स्रावित करने के लिए इंजीनियर किया जाता है, जबकि यहां अनुशंसित 293 टी-आरएसपीओ 1 सेल लाइन को आर-स्पोंडिन 1 को स्रावित करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। यह संभव है कि चूहे और मानव ऑर्गेनोइड आर-स्पोंडिन 1 पसंद करते हैं, जो संभावित रूप से एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया में चूहे के ऑर्गेनोइड लाइनों की विफलता के लिए जिम्मेदार है।
विवो सेटिंग में सबसे बारीकी से पुन: उत्पन्न करने के लिए, ऑर्गेनॉइड कल्चर स्थितियों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो स्टेम सेल अस्तित्व, रखरखाव और प्रसार की अनुमति देते हैं, और जो सेलुलर टर्नओवर और असतत सेल प्रकारों में एक साथ भेदभाव की घटनाओं को बनाए रख सकते हैं। इसलिए, वातानुकूलित मीडिया में पुनः संयोजक प्रोटीन और / या प्रोटीन की सांद्रता को इस सही संतुलन को बनाने के लिए कसकर टाइट और नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के नुकसान से बचने के लिए इष्टतम डब्ल्यूएनटी स्तर आवश्यक हैं। वातानुकूलित मीडिया में बहुत कम डब्ल्यूएनटी विकास का समर्थन करने में असमर्थ होगा, जिससे स्टेम कोशिकाओं का नुकसान होगा और बाद में ऑर्गेनॉइड की मृत्यु हो जाएगी; डब्ल्यूएनटी के अतिसक्रियण से ऑर्गेनोइड्स सिस्टिक और उदासीन10 हो जाएंगे। जबकि यहां विस्तृत नहीं है, एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए और 293 टी-आरएसपीओ 1 वातानुकूलित मीडिया के प्रत्येक बैच का परीक्षण करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, जिसमें डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर ल्यूसिफेरस परख का उपयोग किया जाता है, जैसे कि टॉपफ्लैश सेल लाइन41। पिछले अध्ययनों ने वर्णन किया है कि एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए मीडिया के एक इष्टतम बैच के परिणामस्वरूप 12.5% पर 15 गुना सिग्नल वृद्धि और 1% एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए 10 की तुलना में50% पर 300 गुना सिग्नल वृद्धि होनी चाहिए। चूंकि चूहे के ऑर्गेनोइड ्स संस्कृति आवश्यकताओं, विशेष रूप से डब्ल्यूएनटी सक्रियण स्तरों के लिए माउस ऑर्गेनोइड्स की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं, ये अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम चूहे के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की मजबूती और विश्वसनीयता को सुविधाजनक बनाने में बहुत सहायता करते हैं। चूंकि नोगिन वातानुकूलित मीडिया में बीएमपी गतिविधि और सापेक्ष नोगिन सांद्रता के परीक्षण के लिए एक समान रिपोर्टर लाइन उपलब्ध नहीं है, इसलिए नोगिन स्तरों को ठीक से नियंत्रित करने के लिए संभव होने पर पुनः संयोजक नोगिन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। जबकि माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स को नोगिन39 की अनुपस्थिति में उगाया और बनाए रखा जा सकता है, यह चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए प्रयास नहीं किया गया है।
सेल कल्चर आवश्यकताओं से परे, एक चूहे के ऑर्गनॉइड लाइन की सफल प्रारंभिक स्थापना क्रिप्ट अलगाव के दौरान विभेदित विली की कुशल कमी पर गंभीर रूप से निर्भर करती है। विल्लर संदूषण के उच्च स्तर क्रिप्ट मृत्यु का कारण बनते हैं, संभवतः मरने वाली कोशिकाओं से संकेत या आवश्यक कारकों के अनुक्रम के कारण। उपकला तैयारी से इन विभेदित विली को ठीक से और लगातार कम करने के लिए, स्टीरियोस्कोप की सहायता से उपकला अलगाव करने की सिफारिश की जाती है। जारी किए जा रहे एपिथेलियम की दृश्य परीक्षा एक स्पष्ट संकेत प्रदान करती है कि पीबीएस को कब त्यागना है और इसे बदलना है (चित्रा 1)। क्रिप्ट ्स को तब तक एकत्र नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि विली की पर्याप्त कमी न हो। विलर कोशिकाएं टर्मिनल रूप से विभेदित होती हैं और संस्कृति में ऑर्गेनोइड उत्पन्न नहीं कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स के बाद के पासिंग और किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए उनके उपयोग के लिए नाजुक देखभाल की आवश्यकता होती है। लंबे समय तक (10 मिनट) के लिए पृथक्करण अभिकर्मकों में इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु और ऑर्गेनॉइड लाइन का नुकसान होता है।
यहां, चूहे के ऑर्गेनोइड्स से आंतों के मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक सरल और तेज़ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। ईएमई और कोलेजन आई सब्सट्रेट्स का एपिथेलियम पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है, जिसे अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर लाभ उठाया जा सकता है। ईएमई एकल कोशिकाओं के तेजी से और कुशल आसंजन और सेल अनुमानों के गठन की अनुमति देता है। इसके विपरीत, कोलेजन I के साथ सतह को कोटिंग करने से इन प्रक्रियाओं में देरी होती है। एक बार जब मोनोलेयर लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो ईएमई पर विकसित कोशिकाएं फिर से 3 डी ऑर्गेनॉइड संरचनाएं उत्पन्न करना शुरू कर देती हैं। हालांकि, उनके पास निरंतर विकास के लिए पर्याप्त भौतिक और रासायनिक समर्थन की कमी है। 50% -80% की स्थिरता पर ईएमई में मोनोलेयर को बनाए रखकर ऑर्गनॉइड अवस्था में इस पुनरावृत्ति को रोका जा सकता है। मोनोलेयर की एपिकल सतह पर पतला ईएमई जोड़ने से डी नोवो ऑर्गेनोइड्स की तेजी से वसूली और गठन को बढ़ावा मिलता है, जिससे अभिसरण के क्षेत्र अधिक तेज़ी से और आसानी से उत्पन्न होते हैं। कोलेजन I सतह पर, कोशिकाएं एक समान मोनोलेयर बना सकती हैं और छोटे क्लस्टर उत्पन्न कर सकती हैं। हालांकि, मोनोलेयर के शीर्ष पर कोलेजन आई का जोड़ ऑर्गनॉइड गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं है। मोनोलेयर सतह में जोड़ते समय ईएमई को पतला किया जाना चाहिए, क्योंकि नवजात ऑर्गेनॉइड को दूर करने के लिए एक मजबूत यांत्रिक प्रतिरोध होगा। हालांकि, यह पतला ईएमई बड़े ऑर्गेनोइड के मजबूत गठन की अनुमति नहीं देता है। किसी भी नए उत्पन्न चूहे के ऑर्गेनोइड्स जो स्वाभाविक रूप से सतह से अलग हो जाते हैं, उन्हें तुरंत हटा दिया जाना चाहिए और बिना पतला ईएमई में स्थानांतरित किया जाना चाहिए ताकि संरचनात्मक समर्थन और विकास को बहाल किया जा सके। इस चरण में ऑर्गेनोइड्स के छोटे आकार के कारण, मजबूत विकास स्थापित होने तक ऑर्गेनोइड्स के पारित होने की सिफारिश नहीं की जाती है। ईएमई ऑर्गेनोइड्स के सुधार का समर्थन क्यों कर सकता है, इसका अंतर्निहित जैविक महत्व, लेकिन क्या कोलेजन मैं ऐसा कर सकता हूं या नहीं, स्पष्ट नहीं है। हालांकि, ऐसी रिपोर्टें हैं कि 3 डी कोलेजन में विकसित कोशिकाएं बुड्ड ऑर्गेनोइड42,43 नहीं बना सकती हैं या दीर्घकालिक रखरखाव का समर्थन नहीं कर सकती हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईएमई उत्पाद बाह्य प्रोटीन, मुख्य रूप से लैमिनिन और कोलेजन IV44 के विषम मिश्रण हैं। इसलिए, प्रोटीन की विशिष्ट संरचना और विभिन्न सेलुलर परिसरों का उपयोग करके बाह्य मैट्रिक्स के साथ जुड़ने के लिए एक उपकला कोशिका की क्षमता ईएमई में रीमॉडेलिंग की अनुमति दे सकती है लेकिन कोलेजन आई नहीं। क्या कोलेजन आई-व्युत्पन्न मोनोलेयर को ऑर्गेनॉइड गठन और विकास का समर्थन करने के लिए ईएमई में रखा जा सकता है, इसका परीक्षण नहीं किया गया है।
चूहे की आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल के आनुवंशिक हेरफेर को यहां वर्णित किया गया है, और 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन और 2 डी मोनोलेयर के क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। लेंटिवायरल ऑर्गनॉइड ट्रांसडक्शन की कम दक्षता को दूर करने के लिए, 2 डी मोनोलेयर के क्षणिक अभिकर्मक के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। मोनोलेयर के फ्लैट आकृति विज्ञान और उजागर एपिकल डोमेन वायरस और डीएनए युक्त परिसरों तक आसान पहुंच प्रदान करते हैं। इस तकनीक के सत्यापन के लिए पीएलजेएम 1-ईजीएफपी वेक्टर का उपयोग करने वाले ईजीएफपी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का उपयोग किया गया था। जीएफपी रिपोर्टर अभिव्यक्ति 24 घंटे के बाद देखी गई थी, और मोनोलेयर में 5-6 दिनों तक बनाए रखी गई थी। मोनोलेयर के लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन पर ध्यान केंद्रित करने वाले भविष्य के अध्ययनों में 3 डी ऑर्गनॉइड ट्रांसडक्शन की तुलना में उच्च दक्षता होने की संभावना है। उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, स्थिर लाइनों के निर्माण की सुविधा के लिए संक्रमित 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड्स में सुधार किया जा सकता है। देखभाल के साथ, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड लाइनों को एक वर्ष से अधिक समय तक सफलतापूर्वक बनाए रखा जा सकता है, कई मार्गों पर स्थिर रहना, क्रायोप्रिजर्व, सफलतापूर्वक पिघलाना, और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है, जिससे एक सुलभ और ट्रैक्टेबल इन विट्रो आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल की आवश्यकता को संबोधित किया जा सकता है जो मनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है।
The authors have nothing to disclose.
हम सुमिग्रे और अमीन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी विचारशील चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन चाइल्ड हेल्थ ग्रांट और केएस को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन अनुदान (004741पी 222) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज द्वारा एनए को पुरस्कार संख्या 2आर01डीके077065-12 के तहत समर्थित किया गया था।
3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
Puromycin | VWR | J593-25mg | |
Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |