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Biology

चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और हेरफेर

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65343
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 1,5,6
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उन्हें कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग करते हैं। चूहे अक्सर एक पसंदीदा प्रीक्लिनिकल मॉडल होते हैं, और मजबूत आंतों के ऑर्गेनॉइड सिस्टम विवो अध्ययनों में साथ देने के लिए इन विट्रो सिस्टम की आवश्यकता को पूरा करते हैं।

Abstract

शरीर विज्ञान और सेल भाग्य निर्णयों का आकलन करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करते समय, एक मॉडल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो विवो संदर्भों में बारीकी से पुनरावृत्ति करता है। तदनुसार, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा की खोज और व्यक्तिगत उपचार स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है। माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आमतौर पर आंतों के कार्य / शरीर विज्ञान और स्टेम सेल गतिशीलता / भाग्य निर्णय दोनों के पहलुओं को समझने के लिए किया जाता है। हालांकि, कई रोग संदर्भों में, चूहों को अक्सर चूहों पर एक मॉडल के रूप में पसंद किया जाता है क्योंकि रोग पैथोफिज़ियोलॉजी के संदर्भ में मनुष्यों के लिए उनकी अधिक शारीरिक समानता होती है। चूहे के मॉडल को विवो में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की कमी से सीमित किया गया है, और चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड ्स नाजुक साबित हुए हैं और लंबे समय तक कल्चर करना मुश्किल है। यहां, हम ग्रहणी और जेजुनम से चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड को मजबूत रूप से उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर निर्माण करते हैं। हम चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों का अवलोकन प्रदान करते हैं, जिसमें कार्यात्मक सूजन परख, पूरे माउंट धुंधलापन, 2 डी एंटरोइड मोनोलेयर की पीढ़ी और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन शामिल हैं। चूहा ऑर्गनॉइड मॉडल एक इन विट्रो मॉडल के लिए क्षेत्र की आवश्यकता का एक व्यावहारिक समाधान प्रदान करता है जो मनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है, जल्दी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, और मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की खरीद में शामिल बाधाओं के बिना आसानी से प्राप्त किया जाता है।

Introduction

मानव छोटी आंतों के उपकला वास्तुकला और सेलुलर संरचना जटिल हैं, जो उनके शारीरिक कार्यों को दर्शाती हैं। छोटी आंत की प्राथमिक भूमिका अपने लुमेन1 से गुजरने वाले भोजन से पोषक तत्वों को अवशोषित करना है। इस कार्य को अधिकतम करने के लिए, आंतों की सतह को विली नामक उंगली जैसे प्रोट्रूशियंस में व्यवस्थित किया जाता है, जो अवशोषक सतह क्षेत्र को बढ़ाता है, और कप जैसे इनवेजाइनेशन जिसे क्रिप्ट्स कहा जाता है, जो स्टेम कोशिकाओं को घर और इन्सुलेट करते हैं। एपिथेलियम के भीतर, विभिन्न विशेष अवशोषक और स्रावी सेल प्रकार अलग-अलगकार्य करने के लिए उत्पन्न होते हैं। इस जटिलता के कारण, उच्च मार्ग-रूपांतरित अमर कोशिका लाइनों में आंत जैसे ऊतकों को मॉडल करना मुश्किल हो गया है। हालांकि, स्टेम कोशिकाओं, विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं और उनके भेदभाव तंत्र के अध्ययन ने 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के विकास के लिए अनुमति दी है। ऑर्गनॉइड मॉडल के उपयोग ने क्षेत्र को बदल दिया है, कुछ वास्तुशिल्प घटकों और बरकरार आंत में पाए जाने वाले सेल प्रकार की विषमता के उनके पुनर्मूल्यांकन के कारण। सक्रिय स्टेम सेल आबादी2 के रखरखाव के कारण आंतों के ऑर्गेनोइड्स को लंबे समय तक इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है।

आंतों के ऑर्गेनोइड्स तेजी से स्टेम सेल जीव विज्ञान, सेल फिजियोलॉजी, आनुवंशिक रोग और पोषण3,4 का अध्ययन करने के लिए एक अनुकूलनीय मॉडल बन गए हैं, साथ ही साथ नई दवा वितरण विधियों को विकसित करने के लिए एक उपकरण5। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा की खोज और व्यक्तिगत उपचार स्क्रीनिंग के लिए किया जा रहा है, अन्य 6,7,8,9 के बीच। हालांकि, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड अभी भी चुनौतियां पेश करते हैं। ऊतक की उपलब्धता, संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी के लिए आवश्यकताएं, और नैतिक मुद्दे मानव नमूनों के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। इसके अतिरिक्त, आंतों के क्रिप्ट से उत्पन्न मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स को उदासीन स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव के लिए या परिपक्व सेल प्रकारों के भेदभाव को प्रेरित करनेके लिए दो अलग-अलग संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है। यह विवो के साथ विरोधाभास ी है, जहां स्टेम सेल और परिपक्व विभेदित सेल प्रकार एक साथ मौजूद होते हैं और लगातार उत्पन्न/ बनाए रखते हैं। दूसरी ओर, माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स, जो विकास कारकों के कम जटिल कॉकटेल में उगाए जाते हैं, को मीडिया संरचना में इस स्विच की आवश्यकता नहीं होती है और एक हीमीडिया संदर्भ 2,11 में स्टेम कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं को बनाए रख सकते हैं। हालांकि, मनुष्यों की तुलना में माउस आंत में महत्वपूर्ण अंतर माउस ऑर्गेनोइड्स को कई उदाहरणों में एक उप-मानक मॉडल बना सकते हैं। कुल मिलाकर, घोड़ों, सूअरों, भेड़, गायों, कुत्तों और बिल्लियों सहित बड़े स्तनधारियों से कई आंतों के ऑर्गेनोइड्स, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति स्थितियों की तुलना में माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स के साथ अधिक निकटता से संरेखित संस्कृति स्थितियों में सफलतापूर्वक उत्पन्न हुएहैं। माउस और मानव ऑर्गेनोइड्स के बीच विकास कारक स्थितियों में अंतर संभवतः स्टेम सेल आला संरचना में अंतर और स्टेम सेल अस्तित्व, प्रसार और रखरखाव के लिए अलग-अलग आवश्यकताओं को दर्शाता है। इसलिए, एक आसानी से सुलभ मॉडल ऑर्गनॉइड सिस्टम की आवश्यकता है जो 1) मानव आंतों की कोशिका संरचना से निकटता से मिलता-जुलता है, 2) मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स की तरह विकास कारक आवश्यकताओं के साथ स्टेम कोशिकाएं शामिल हैं, और 3) लगातार उदासीन और विभेदित डिब्बों को बनाए रखने में सक्षम है। आदर्श रूप से, प्रणाली आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल से होगी, जैसे कि विवो और इन विट्रो प्रयोगों में सहसंबद्ध किया जा सकता है और मिलकर उपयोग किया जा सकता है।

चूहे आंतों के शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी अध्ययन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रीक्लिनिकल मॉडल हैं क्योंकि उनके बहुत समान आंतों के शरीर विज्ञान और जैव रसायन13 हैं, विशेष रूप से आंतों की पारगम्यता14 के संबंध में। चूहों की तुलना में उनका अपेक्षाकृत बड़ा आकार उन्हें शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए अधिक उत्तरदायी बनाता है। जबकि सूअरों सहित बड़े पशु मॉडल कभी-कभी उपयोग किए जाते हैं, चूहे एक अधिक किफायती मॉडल हैं, पशुपालन के लिए कम जगह की आवश्यकता होती है, और आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानक उपभेद15 होते हैं। चूहे के मॉडल का उपयोग करने का एक दोष यह है कि विवो अध्ययनों में आनुवंशिक टूलकिट चूहों की तुलना में अच्छी तरह से विकसित नहीं है, और नॉकआउट, नॉक-इन और ट्रांसजेनिक सहित नई चूहे लाइनों की पीढ़ी अक्सर लागत-निषेधात्मक होती है। एक मजबूत चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल का विकास और अनुकूलन एक सुलभ मॉडल में आनुवंशिक हेरफेर, औषधीय उपचार और उच्च थ्रूपुट अध्ययन की अनुमति देगा जो मनुष्यों के लिए महत्वपूर्ण शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है। हालांकि, एक कृंतक ऑर्गनॉइड मॉडल बनाम दूसरे के फायदे अध्ययन की जा रही विशेष प्रक्रिया या जीन पर अत्यधिक निर्भर हैं; मनुष्यों में पाए जाने वाले कुछ जीन चूहों में स्यूडोजीन हो सकते हैं लेकिन चूहों16,17 नहीं। इसके अतिरिक्त, प्रजाति-विशिष्ट सेल उपप्रकारों का अनावरण तेजी से एकल-सेल आरएनएसेक 18,19,20 द्वारा किया जा रहा है। अंत में, चूहे और माउस आंतों के रोग मॉडल अक्सर फेनोटाइप्स21,22 में काफी भिन्नताएं प्रदर्शित करते हैं जैसे कि मनुष्यों में देखे गए लक्षणों और रोग प्रक्रिया को अधिक बारीकी से पुन: प्रस्तुत करने वाले मॉडल को डाउनस्ट्रीम काम के लिए चुना जाना चाहिए। चूहे के आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल की पीढ़ी शोधकर्ताओं को उनकी परिस्थितियों के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल प्रणाली का चयन करने में अतिरिक्त लचीलापन और विकल्प प्रदान करती है। यहां, चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल23,24 का विस्तार किया गया है और ग्रहणी या जेजुनम से चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड ्स की पीढ़ी और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार की गई है। इसके अलावा, लेंटिवायरल संक्रमण, पूरे माउंट स्टेनिंग और फोर्सकोलिन सूजन परख सहित कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों का वर्णन किया गया है।

Protocol

नोट: सभी सेल कल्चर को एक ऊतक संस्कृति हुड में उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके नियंत्रित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में सभी जानवरों के काम को येल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सेल कल्चर अभिकर्मकों की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए आर-स्पोंडिन 1 वातानुकूलित मीडिया तैयार करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए डब्ल्यूएनटी 3 ए वातानुकूलित मीडिया तैयार करें। तालिका 1 में वर्णित ADDMEM + तैयार करें।
  2. 100 μM स्टॉक तैयार करने के लिए बाँझ dH2O में गैस्ट्रिन को पुन: निलंबित करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 100 एमएम स्टॉक तैयार करने के लिए बाँझ पानी में एन-एसिटाइलसिस्टीन को पुन: निलंबित करें। एलिकोट और 1 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 250 μg / mL स्टॉक तैयार करने के लिए फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) + 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) में पुनः संयोजक मानव नोगिन को पुन: निलंबित करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 100 μg / mL स्टॉक तैयार करने के लिए पीबीएस + 0.1% बीएसए में पुनः संयोजक माउस एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) को पुन: निलंबित करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 100 μg / mL स्टॉक तैयार करने के लिए PBS + 0.1% BSA में पुनः संयोजक मानव IGF-1 को पतला करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 100 μg / mL स्टॉक तैयार करने के लिए 5 mM Tris, pH 7.6 में पुनः संयोजक मानव FGF-2 को पुन: निलंबित करें। एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सभी विकास कारकों के लिए, पीबीएस + 0.1% बीएसए में एक मध्यवर्ती कमजोर पड़ने का उपयोग करें जो संस्कृति मीडिया में अंतिम एकाग्रता को 100 गुना तक पहुंचाता है। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. चूहे की छोटी आंत के ऑर्गेनोइड्स की स्थापना

नोट: इस प्रोटोकॉल को चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स23,24 के लिए दो पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था।

  1. तालिका 2 के अनुसार चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड मीडिया (आरआईओएम) तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी का स्नान निर्धारित करें। यह पूर्ण माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए स्थिर है।
  2. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पीबीएस में 3 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 10 एमएल तैयार करें और बर्फ पर रखें। बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स अर्क (ईएमई) के 250 μL पिघलाएं।
  3. पानी के एड लिबिटम तक पहुंच के साथ रात भर एक चूहे का उपवास करें।आईएसीयूसी-अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहे को इच्छामृत्यु दें। इस प्रोटोकॉल में, वयस्क पुरुष स्प्राग डॉवले चूहों (वजन ~ 200 ग्राम) को सीओ2 इनहेलेशन (सामग्री की तालिका) के माध्यम से इच्छामृत्यु दी गई थी। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग इच्छामृत्यु की द्वितीयक विधि के रूप में किया गया था।
  4. विच्छेदन के लिए बाँझ आटोक्लेव बल और विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। इच्छामृत्यु वाले चूहे को विच्छेदन सतह उदर पक्ष पर रखें। बल के साथ त्वचा की परत को पिंच करें; सतह के स्तर पर निम्नलिखित कट किए जाने चाहिए, इसलिए वे केवल इस त्वचा की परत के माध्यम से काट रहे हैं और आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचाने के लिए पर्याप्त गहरे नहीं हैं।
  5. पेट की गुहा को खोलने के लिए, बड़ी, तेज विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, पेट के केंद्र में एक बड़े, अनुदैर्ध्य, सतह-स्तर के कट में त्वचा की परत के माध्यम से काट दें। इसके बाद, उस कट से उपजी, दो छोटे क्षैतिज कट बनाएं, प्रत्येक तरफ एक। पेट की गुहा को उजागर करने के लिए त्वचा को छीलने के लिए बल का उपयोग करें। आंत तक तैयार पहुंच के साथ पेट की गुहा में आंतरिक अंगों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए पेरिटोनियल झिल्ली के माध्यम से काटें।
  6. कैंची और बल का उपयोग करके, पेट का पता लगाएं और ग्रहणी को लगभग 2-3 सेमी दूर की पहचान करें, जो पीले रंग के खंड के रूप में दिखाई देता है। समीपस्थ जेजुनम ट्रेइट्ज़ के लिगामेंट से लगभग 4-5 सेमी दूर स्थित है, जो ग्रहणी और जेजुनम के बीच एक मील का पत्थर के रूप में कार्य करता है।
  7. पृथक आंतों के टुकड़े को 10 सेमी पेट्री डिश में रखें। जितना संभव हो सके मेसेन्ट्री के वांछित आंतों के खंड को साफ करें। ल्यूमिनल सामग्री से साफ होने तक 10 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ फ्लश करें। एक पेपर टॉवल पर, आंतों के खंड को ~ 2 सेमी लंबे टुकड़ों में काटें। एपिथेलियम को उजागर करने के लिए प्रत्येक आंतों के टुकड़े को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें।
  8. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके, विली को हटाने के लिए उजागर ल्यूमिनल सतह को खुरचें। बर्फ पर तैयार ईडीटीए समाधान में आंतों के टुकड़े रखें। 10 आरपीएम पर सेट ट्यूब रिवॉल्वर पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
  9. विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर, शंक्वाकार ट्यूब की सामग्री को 10 सेमी पेट्री डिश में डालें। बर्फ-ठंडा पीबीएस के अतिरिक्त ~ 5 एमएल में जोड़ें।
  10. बारीक बल का उपयोग करके, आंतों के खंड को पकड़ें और जोर से हिलाएं। पीबीएस में एपिथेलियम रिलीज देखना संभव होगा। सबसे पहले, पीबीएस में मुख्य रूप से विली शामिल होगा।
  11. हिलाना जारी रखें। समय-समय पर विली युक्त पीबीएस को छोड़ दें और आंतों के टुकड़ों में 10 मिलीलीटर ताजा बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें। टुकड़ों को हिलाना जारी रखें और इस धोने के चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि विली अब पीबीएस में जारी नहीं किया जाता है, लेकिन इसके बजाय पीबीएस में मुख्य रूप से क्रिप्ट होते हैं। क्रिप्ट अलगाव के लिए 15 मिनट से अधिक न करें, ताकि सेल व्यवहार्यता से समझौता न हो।
  12. शेष आंतों के टुकड़ों को फेंक दें। आंतों के क्रिप्ट के लिए पेट्री डिश में शेष पीबीएस को समृद्ध करें। एक ऊतक संस्कृति हुड में, पीबीएस युक्त क्रिप्ट एकत्र करें और 70 μm सेल स्ट्रेनर (सामग्री की तालिका) के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  13. 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और एडीडीएमईएम + के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज फिर से 5 मिनट के लिए 250 x g पर।
    नोट: स्विंग बकेट रोटर के साथ सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  14. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, गोली के साथ ~ 50 μL मीडिया छोड़ दें। शेष मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर ईएमई के एलिकोट में जोड़ें। पूरे ईएमई में क्रिप्ट को समान रूप से निलंबित करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें। बुलबुले पेश करने से बचें।
  15. ईएमई गुंबद के प्लेट 50 μL को 35 मिमी ऊतक संवर्धन डिश में डालें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  16. 10 μM Y27632 और 10 μM CHIR99021 (तालिका 3) युक्त rIOM (तालिका 2) के 2 mL जोड़ें। पासिंग के बाद वाई27632 और CHIR99021 को बंद किया जा सकता है।
  17. हर 2-3 दिनों में आरआईओएम बदलें। आवश्यकतानुसार मार्ग, आमतौर पर 3-7 दिनों के बीच, ऑर्गेनोइड्स की प्रारंभिक संख्या, आकार और विकास दर के आधार पर।

3. चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स को पासिंग करना।

  1. बर्फ पर ईएमई के 250 μL एलिकोट को पिघलाएं और आरआईओएम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. ऑर्गेनोइड्स युक्त 35 मिमी प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें और ईएमई गुंबदों से ऑर्गेनोइड्स को तुरंत छोड़ने के लिए 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें।
  3. खंडित ऑर्गेनोइड्स के साथ पृथक्करण अभिकर्मक को तुरंत 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कल्चर प्लेट को AdDMEM + के 2 मिलीलीटर के साथ धोएं और खंडित ऑर्गेनोइड युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें।
  4. एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ, ऑर्गेनोइड्स को टुकड़े करने के लिए धीरे से 15-20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। 2 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  5. ईएमई में शंक्वाकार ट्यूब के तल से ~ 50 μL घोल जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करें। बुलबुले बनाने से बचें।
  6. ईएमई गुंबद के प्लेट 50 μL को 35 मिमी डिश में और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 10 μM Y27632 और 10 μM CHIR99021 के साथ 2 mL rIOM जोड़ें। हर 2-3 दिनों में विकास मीडिया बदलें। मीडिया बदलते समय, Y27632 और CHIR99021 को छोड़ा जा सकता है।

4. चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का क्रायोप्रिजर्वेशन और पिघलना।

  1. क्रायोसंरक्षित चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स।
    नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल मानव और माउस ऑर्गेनोइड्स25 के लिए पिछले प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था। ठंड से पहले, ऑर्गेनोइड्स में प्राथमिक संस्कृति में कम से कम दो मार्ग होने चाहिए। क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले बड़े स्फेरॉइड या थोड़ा बुडेड ऑर्गेनोइड्स के बिंदु तक ऑर्गेनोइड्स विकसित करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप पिघलने के बाद व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स की उच्च उपज होगी। यह आर-स्पोंडिन वातानुकूलित मीडिया को 15% तक बढ़ाकर और / या ऑर्गेनॉइड संस्कृति में 10 एमएम निकोटिनामाइड (तालिका 3) जोड़कर पूरा किया जा सकता है।
    1. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 35 मिमी डिश पर ऑर्गेनोइड की संख्या की गणना करें। क्रायोवियल को इस तरह लेबल करें कि प्रत्येक क्रायोवियल में 200 ऑर्गेनोइड्स को एलिकोट किया जाएगा।
    2. 35 मिमी डिश से आरआईओएम को हटा दें। ठंडे ऊतक संवर्धन ग्रेड पीबीएस के 2 एमएल के साथ बदलें।
    3. पी 1000 टिप का उपयोग करके, ईएमई गुंबदों को संस्कृति डिश के नीचे से पीबीएस में ऊपर और नीचे पाइप करके छोड़ दें। ईएमई को तोड़ने और ऑर्गेनोइड्स को जारी करने के लिए ~ 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करना जारी रखें। ऑर्गेनोइड्स और पीबीएस को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. पीबीएस में किसी भी शेष ऑर्गेनोइड को छोड़ने के लिए कल्चर डिश और पिपेट में 2 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें। पीबीएस को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 5 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करें। ऑर्गनॉइड गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और फेंक दें।
    6. 5 मिलीलीटर ठंडे AdDMEM + में धीरे से निलंबित करके गोली को धो लें। 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को सावधानी से निकालें और छोड़ दें।
    7. प्रति 200 ऑर्गेनोइड्स में 1 मिलीलीटर कोल्ड फ्रीजिंग माध्यम में ऑर्गनॉइड गोली को फिर से निलंबित करें। प्रति लेबल क्रायोवियल में फ्रीजिंग माध्यम में 1 एमएल ऑर्गेनोइड्स का एलिकोट। क्रायोवियल को एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।
    8. ऑर्गेनोइड्स को 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें, फिर क्रायोवियल को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  2. चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स को पिघलाना।
    नोट: यह प्रोटोकॉल मानव और माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स26 को पिघलाने के लिए पिछले प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था।
    1. बर्फ पर ईएमई के 250 μL एलिकोट को पिघलाएं। 15% आर-स्पोंडिन वातानुकूलित मीडिया, 10 μM Y27632, और 10 μM CHIR99021 के साथ पूरक rIOM तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    2. कमरे के तापमान पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2 एमएल डीफ्रॉस्टिंग माध्यम (तालिका 3) जोड़ें।
    3. शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर तरल नाइट्रोजन से ऑर्गेनोइड ्स की एक शीशी को पुनः प्राप्त करें और पिघलाएं जब तक कि शीशी लगभग पूरी तरह से पिघल न जाए।
    4. शीशी में 1 एमएल डीफ्रॉस्टिंग माध्यम जोड़ें और सभी सामग्री को डीफ्रॉस्टिंग माध्यम युक्त शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। शीशी को 1 मिलीलीटर डीफ्रॉस्टिंग माध्यम से दो बार धोएं और शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। मीडिया को एस्पिरेट करें, ऑर्गेनोइड्स के साथ ~ 50 μL माध्यम छोड़ दें। ऑर्गेनोइड्स युक्त मीडिया को ईएमई के 250 μL में स्थानांतरित करें।
    6. बुलबुले से बचते हुए, ऊपर और नीचे पाइप करके ईएमई के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स को समान रूप से वितरित करें। पिपेट छह 50 μL गुंबद ों को 35 मिमी ऊतक संस्कृति डिश में विभाजित करता है।
    7. ईएमई को पॉलीमराइज करने की अनुमति देने के लिए 15-20 मिनट के लिए ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। पकवान में तैयार आरआईओएम के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. 2 दिनों के बाद, मीडिया को आरआईओएम के साथ बदलें। Y27632 और CHIR99021 का उपयोग निलंबित किया जा सकता है। पिघलने के बाद पहले मार्ग में ऑर्गेनॉइड विकास धीमा हो सकता है। प्रयोगों को शुरू करने से पहले पिघलने के बाद ऑर्गेनोइड्स को दो बार पारित करने की सलाह दी जाती है।

5. 3 डी ऑर्गेनोइड्स से चूहे की आंतों के 2 डी मोनोलेयर का उत्पादन।

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईएमई के साथ लेपित 48-वेल प्लेट के 24 कुओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक मात्रा का वर्णन करता है, जो 50 μL (35 मिमी डिश) के छह गुंबदों से शुरू होता है जिसमें ~ 300 आंतों के ऑर्गेनोइड / गुंबद होते हैं (स्केल: एक गुंबद चार कुएं उत्पन्न करता है), लेकिन आवश्यकतानुसार ऊपर या नीचे किया जा सकता है। जैसा कि लिखा गया है, यह प्रोटोकॉल 4-5 दिनों में ~ 80% संगम प्राप्त करता है। उच्च प्रवाह पर, कोशिकाएं फिर से 3 डी ऑर्गेनॉइड संरचनाओं का अधिग्रहण करना शुरू कर देती हैं। कम संगम (≤40%) पर, कोशिकाएं मोनोलेयर के रूप में रहती हैं और ~ 14 दिनों के लिए व्यवहार्य होती हैं। यदि अध्ययन का उद्देश्य 2 डी मोनोलेयर का उपयोग करना है, तो इसे कम करें ताकि एक गुंबद 24-वेल प्लेट के आठ कुएं उत्पन्न करे। कुओं को मोनोलेयर बनाने के लिए कोलेजन I के साथ लेपित भी किया जा सकता है।

  1. लेपित सतहों की तैयारी
    1. ईएमई के साथ प्लेट को कोट करने के लिए, ईएमई 1: 20 को ठंडे एडीडीएमईएम + (तालिका 1) में पतला करें। कोलेजन के साथ कोटिंग के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोलेजन I तैयार करें। AdDMEM + में 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन I को 100 μg / mL (इस मामले में 1: 50) तक पतला करें।
    2. अच्छी तरह से सतह को कवर करने के लिए प्लेट को 200 μL पतला ईएमई या कोलेजन के साथ कोट करें। एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। तालिका 4 के अनुसार 2 डी मोनोलेयर कल्चर (आरआईओएम 2 डी) के लिए चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड माध्यम तैयार करें।
  2. मोनोलेयर की पीढ़ी
    1. ऑर्गेनोइड्स युक्त 35 मिमी प्लेट से मीडिया को एस्पिरेट करें। पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    2. पी 1000 टिप के साथ खरोंच करके कुओं में ईएमई को बाधित करें। सभी ईएमई को ढीला करने के लिए लगभग 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। सब कुछ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. किसी भी अतिरिक्त ऑर्गेनोइड को पुनर्प्राप्त करने और उसी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 35 मिमी प्लेट में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    4. 2 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और ईएमई अवशेषों सहित सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें। ऑर्गनॉइड गोली में 1 मिलीलीटर ट्रिप्सिन घोल जोड़ें और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. पी 1000 टिप का उपयोग करके 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें और ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए 2 एमएल एडीडीएमईएम + जोड़ें।
    6. 5 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाला पदार्थ डालें और 4.8 मिलीलीटर आरआईओएम 2 डी जोड़ें (तालिका 4)। सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
    7. ऑर्गेनोइड्स रखने से पहले, कुओं से एडीडीएमईएम + में किसी भी अतिरिक्त ईएमई या कोलेजन को बाहर निकालें। फिर, rIOM2D में 200 μL ऑर्गेनोइड ्स और प्रत्येक प्रीकोटेड में 10 μM Y27632 अच्छी तरह से जोड़ें।
    8. 4-16 घंटे के बाद, मीडिया इकट्ठा करें और 1 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को एक नई 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली को छोड़ दें।
    9. प्रत्येक को 300 μL PBS के साथ अच्छी तरह से धोएं और प्रत्येक कुएं में 200 μL सेंट्रीफ्यूज rIOM2D जोड़ें। हर 2-3 दिनों में आरआईओएम 2 डी बदलें, वाई 27632 के उपयोग को निलंबित करें।
  3. 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड्स में सुधार
    नोट: ईएमई पर उगाए गए मोनोलेयर को 3 डी ऑर्गेनोइड्स में सुधार के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जबकि कोलेजन पर उगाए गए मोनोलेयर मैं कुशलता पूर्वक 3 डी ऑर्गेनोइड्स पर वापस नहीं आते हैं। आमतौर पर, मोनोलेयर से उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के 2-3 कुओं का उपयोग दिन 5 पर ईएमई के 50 μL के एक गुंबद को बनाने के लिए किया जा सकता है।
    1. आरआईओएम 2 डी में ईएमई 1: 4 को पतला करें। जब मोनोलेयर ~ 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो मीडिया को ध्यान से एस्पिरेट करें और मोनोलेयर वाले कुओं में 100 μL पतला ईएमई जोड़ें।
    2. 20 मिनट के लिए एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। बाद में, आरआईओएम 2 डी के 100 μL जोड़ें और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर पर लौटें। पतला ईएमई जोड़ने के 5 दिनों के भीतर 3 डी ऑर्गेनोइड उत्पन्न होंगे।
    3. छोटे ऑर्गेनोइड्स में सुधार (~ दिन 5) के बाद, आरआईओएम तैयार करें। ईएमई को बाधित करने के लिए सभी अच्छी सामग्री एकत्र करें, ऊपर और नीचे पाइप करें, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. 2 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला और ईएमई अवशेषों को एस्पिरेट करें।
    5. 1 मिलीलीटर ठंडा AdDMEM + जोड़ें और 2 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को हटा दें, ~ 50 μL मीडिया छोड़ दें।
    6. 50 μL मीडिया और ऑर्गेनोइड्स को 250 μL EME एलिकोट में स्थानांतरित करें। पूरे ईएमई में ऑर्गेनोइड ्स वितरित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट।
    7. ईएमई गुंबद के पिपेट 50 μL को 35 मिमी डिश में डालें और एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. 2 एमएल rIOM प्लस 10 μM Y27632 जोड़ें। हर 2-3 दिनों में विकास मीडिया बदलें। मीडिया बदलते समय, Y27632 को छोड़ा जा सकता है।

6. आनुवंशिक हेरफेर

  1. 2 डी मोनोलेयर का क्षणिक अभिकर्मक।
    सावधानी: 48-वेल प्लेट में खंड 5.1 का पालन करते हुए चूहे की आंतों के उपकला मोनोलेयर तैयार करें। अभिकर्मक 70% -80% सामंजस्य पर किया जाना चाहिए। ट्रांसमिट करने से पहले हमेशा कुओं में मीडिया को 200 μL ताजा riOM2D के साथ बदलें। प्लास्मिड डीएनए के 260/280 एनएम और 260/230 एनएम अवशोषण अनुपात की गणना करें; अच्छे अभिकर्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए ये 1.8 से ऊपर होना चाहिए।
    नोट: अभिकर्मक की दक्षता की गणना करने के लिए एक प्लास्मिड नियंत्रण का उपयोग करें। एक प्लास्मिड जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है, आसानी के लिए अनुशंसित है। इस प्रोटोकॉल में, pLJM1-EGFP27 का उपयोग किया गया था।
    1. 20 केडीए पॉलीथाइलेनिमाइन (पीईआई) के 1 मिलीग्राम / एमएल तैयार करें; तालिका 3)। प्रत्येक कुएं के लिए, ट्यूब ए (प्लास्मिड का 0.6 μg + कम सीरम माध्यम का 50 μL) और ट्यूब B (पीईआई का 1.8 μL + कम सीरम माध्यम का 50 μL) तैयार करें। 1: 3 के डीएनए: पीईआई अनुपात को बनाए रखें।
    2. भंवर 30 सेकंड के लिए दोनों ट्यूब। ट्यूब ए और ट्यूब बी को मिलाएं, और भंवर को फिर से 30 सेकंड के लिए मिलाएं। यदि आवश्यक हो, तो नीचे घूमने के लिए एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. धीरे से डीएनए / पीईआई कॉम्प्लेक्स ड्रॉप-वाइज को 2 डी मोनोलेयर में जोड़ें। धीरे से मिश्रण करने के लिए प्लेट को घुमाएं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटकरें। अभिव्यक्ति आमतौर पर 24 घंटे के बाद पता लगाया जा सकता है।
      नोट: यदि 3 डी ऑर्गनॉइड संरचनाओं पर लौटना आवश्यक है, तो पतला ईएमई जोड़ने के लिए अभिकर्मक के बाद 48 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  2. चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन
    नोट: लेंटिवायरस के साथ काम करने से पहले, संस्थान से उचित प्राधिकरण और विशेष प्रशिक्षण प्राप्त करें। लेंटिवायरस को संभालते समय हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें। जबकि यहां उल्लिखित नहीं है, ऑर्गेनोइड्स के सफल संक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता वाला, केंद्रित लेंटिवायरस आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल ने खाली pLJM1-EGFP वेक्टर का उपयोग किया।27 घुलनशील जीएफपी को व्यक्त करने के लिए। यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है28. पारगमन दक्षता वायरल कणों की गुणवत्ता और एकाग्रता, छोटे सेल समूहों में ऑर्गेनोइड्स के कुशल पृथक्करण और व्यक्त किए जा रहे जीन पर निर्भर करती है। जब संक्रमण के 5 दिन बाद गणना की जाती है, तो चयन से पहले औसत पारगमन दक्षता 19.4% (± 6.5% मानक विचलन) थी।
    1. लेंटिवायरल संक्रमण से 2 दिन पहले, प्रत्येक लेंटिवायरस के लिए 24-वेल प्लेट के दो घने कुओं को पारित करने की योजना (खंड 3) बनाएं जिन्हें ट्रांसड्यूस किया जाएगा। 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में ईएमई के एक 50 μL गुंबद को समायोजित किया जा सकता है।
    2. एक बार ईएमई जम जाने के बाद, 10 एमएम निकोटिनामाइड, 10 μM Y27632, और 2.5 μM CHIR99021 के साथ पूरक 0.5 मिलीलीटर riom जोड़ें। यह बड़े स्फेरॉइड आकृति विज्ञान को प्रेरित करता है, जो लेंटिवायरल पारगमन की दक्षता के लिए अनुकूल है। चढ़ाना के 2 दिनों के भीतर, चूहे के ऑर्गेनोइड बड़े स्फेरॉइड होने चाहिए। यदि महत्वपूर्ण भेदभाव (यानी, नवोदित) देखा जाता है, तो ऑर्गेनोइड्स को पुन: पारित करें।
    3. बर्फ पर केंद्रित वायरस को पिघलाएं। तालिका 3 के अनुसार, ताजा पारगमन मीडिया तैयार करें।
    4. पी 1000 टिप का उपयोग करके, सेल कल्चर डिश के नीचे से ईएमई गुंबदों को ऊपर और नीचे पाइप करके मीडिया में छोड़ दें। ईएमई को तोड़ने और ऑर्गेनोइड ्स को जारी करने के लिए 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करना जारी रखें।
    5. ऑर्गेनोइड्स और मीडिया को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पिपेट करें। सभी कुओं को एक साथ पूल किया जा सकता है, बशर्ते ऑर्गेनोइड्स में एक ही जीनोटाइप हो और वे एक ही लाइन से हों।
    6. प्रत्येक को 1 मिलीलीटर ठंडे AdDMEM + के साथ दो बार अच्छी तरह से धो लें। AdDMEM + एकत्र करें और इसे उसी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, यांत्रिक रूप से चूहे के ऑर्गेनोइड को बाधित करें। यह एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि इसका उद्देश्य कोशिकाओं के छोटे बहुकोशिकीय समूह हैं। पिपेट ऊपर और नीचे ~ 30 बार। 4x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत व्यवधान की दक्षता की जांच करें। इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि सेल निलंबन मुख्य रूप से सेल क्लस्टर से युक्त न हो जिसमें कुछ ऑर्गेनोइड शेष हों।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ऑर्गेनोइड्स को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है, सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है, और पारंपरिक ट्रिप्सिन / ईडीटीए की जगह पुनः संयोजक एंजाइम के 1 मिलीलीटर में पुन: निलंबित किया जा सकता है, ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्वावलोकन। पृथक्करण को बढ़ावा देने के लिए नियमित भंवर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें। ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन से बचें, क्योंकि यह कोशिका मृत्यु को बढ़ावा दे सकता है। नियमित रूप से 4x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत व्यवधान की दक्षता की जांच करें। जब निलंबन मुख्य रूप से कुछ सेल संस्कृतियों के साथ एकल कोशिकाओं से बना होता है, तो एडीडीएमईएम + के 4 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन को पतला करें और निम्नलिखित चरण के साथ आगे बढ़ें।
    8. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 200 x g पर सेल क्लस्टर वाले 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। सतह पर तैरने वाले को सावधानी पूर्वक निकालें और छोड़ दें, सावधान रहें कि सेल गोली को परेशान न करें।
    9. संक्रमित होने के लिए प्रति कुएं में पारगमन माध्यम के 230 μL में सेल समूहों को फिर से निलंबित करें। संक्रमण के लिए, प्रत्येक लेंटीवायरस के लिए 48-वेल प्लेट के एक कुएं का उपयोग करें।
    10. 48-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन की प्लेट 230 μL। प्रत्येक कुएं में 20 μL केंद्रित वायरस जोड़ें। प्रत्येक कुएं में वायरस / सेल समाधान को मिलाने के लिए पी 1000 टिप का उपयोग करें और प्लेट को पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें।
    11. स्पिनोक्यूलेशन करें: प्लेट को 32 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेट को अनसील करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 6 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
    12. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24-वेल प्लेट को प्रीहीट करें।
    13. इनक्यूबेशन बाद, पिपेट प्रत्येक को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे करते हैं और सामग्री को 1.5 एमएल ट्यूब लेबल में स्थानांतरित करते हैं। प्रत्येक को AdDMEM + के 750 μL के साथ अच्छी तरह से धोएं और ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूबों को 600 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
    14. सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को निकालें और बर्फ पर स्टोर करें। सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटाने और ठीक से निपटाने के लिए पी 1000 टिप का उपयोग करें।
    15. ईएमई में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और प्लेट 50 μL गुंबदों को पहले से गर्म 24-वेल प्लेट में डालें। ईएमई को पॉलीमराइज्ड होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    16. प्रत्येक कुएं में, 10 mM निकोटिनामाइड, 10 μM Y27632, और 2.5 μM CHIR99021 के साथ पूरक 500 μL riom जोड़ें।
    17. संक्रमण के 1 दिन बाद मीडिया को आरआईओएम प्लस 10 μM Y27632 के साथ बदलें। हर 2-3 दिन में मीडिया बदलें। यदि चयन किया जाएगा, तो संक्रमण के 48-72 घंटे बाद चयन जोड़ें। प्यूरोमाइसिन चयन के लिए, 2 μg / mL puromycin का उपयोग करें।

7. ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस पूरे माउंट धुंधलापन

  1. मीडिया को एस्पिरेट करें और पीबीएस-ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) (तालिका 3) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को सेल कल्चर डिश में ऑर्गेनोइड्स में जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. ऊपर और नीचे पाइप करके ईएमई से ऑर्गेनोइड ्स जारी करें। ऑर्गेनोइड्स को 0.75 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। ऑर्गेनोइड कुछ ही मिनटों में गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बस जाएंगे। यदि आवश्यक हो, तो 1 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, पीएफए को हटा दें और पीबीएस-टी में ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करें। ऑर्गेनोइड्स को ट्यूब के नीचे तक बसने दें। पीबीएस-टी को निकालें और ब्लॉक समाधान के 200 μL में पुन: निलंबित करें (तालिका 3)।
  4. 45 मिनट के लिए एक रॉकर या न्यूटेटर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। ऑर्गेनोइड ्स ट्यूब के नीचे तक टकरा सकते हैं और बस सकते हैं। समय-समय पर ट्यूब को फिर से दबाने और पूरे समाधान में फैलाने के लिए उंगली फ्लिक करें।
  5. ऑर्गेनोइड्स को ट्यूब के निचले हिस्से में बसने दें। यदि आवश्यक हो, तो 1 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। ब्लॉक समाधान निकालें।
  6. ब्लॉक समाधान के 100 μL में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 24 आरपीएम पर 45 मिनट के लिए एक पौष्टिक मिक्सर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी सांद्रता उपयोग किए गए एंटीबॉडी के आधार पर भिन्न होती है।
    नोट: इस चरण को प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ाया जा सकता है।
  7. ऑर्गेनोइड्स को ट्यूब के निचले हिस्से में बसने दें। यदि आवश्यक हो, तो 1 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस-टी में पांच बार धोएं। 24 आरपीएम पर न्यूट्रेटिंग मिक्सर पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  9. ब्लॉक घोल के 100 μL में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी 1: 200 और 50 μg / mL 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिललिंडोल (DAPI) जोड़ें। 24 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए एक पौष्टिक मिक्सर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  10. ऑर्गेनोइड्स को ट्यूब के निचले हिस्से में बसने दें। यदि आवश्यक हो, तो 1 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें। ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस-टी में पांच बार धोएं।
  11. 24 आरपीएम पर एक पौष्टिक मिक्सर पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं।
  12. जब ऑर्गेनोइड धो रहे हों, तो 40-50 डिग्री सेल्सियस पर वैलाप सीलेंट (तालिका 3) का एक एलिकोट गर्म करें। पेंटब्रश का उपयोग करके, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वीएएलएपी के एक पतले वर्ग को लगभग कवरस्लिप के आकार में पेंट करें। 22 मिमी x 22 मिमी नंबर 1.5 कवरस्लिप का उपयोग करें।
  13. कैंची का उपयोग करके, पी 200 पिपेट टिप के अंत को काट लें। स्लाइड पर वेलप में ऑर्गेनोइड ्स को अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। एक ऊतक पोंछे का उपयोग करके, पीबीएस-टी को सावधानीपूर्वक दूर करें। ऑर्गेनोइड्स को सूखने न दें।
  14. वैलाप को एक एंटीफैड माउंटिंग माध्यम से अच्छी तरह से भर दें (तालिका 3)। ~ 22 मिमी x 22 मिमी वर्ग के लिए, इसके लिए 100-150 μL एंटीफैड की आवश्यकता होगी।
  15. ऑर्गेनोइड क्लस्टर कर सकते हैं; यदि आवश्यक हो, तो ऑर्गेनोइड्स को फिर से वितरित करने के लिए पिपेट टिप के साथ एंटीफैड को घुमाएं। हवा के बुलबुले से बचते हुए, 22 मिमी x 22 मिमी नंबर 1.5 कवरस्लिप के साथ माउंट करें। किनारों पर वीएएलएपी की एक पतली परत को चित्रित करके कवरस्लिप को सील करें।
    नोट: उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए, ऑर्गेनोइड्स को 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश में भी रखा जा सकता है।

8. चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स की फोर्स्कोलिन-प्रेरित सूजन

  1. आरआईओएम में पासिंग के बाद 3-5 दिनों के लिए ऑर्गेनोइड ्स उगाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए 24-अच्छी प्लेट में ऑर्गेनोइड्स उगाने की सलाह दी जाती है कि एक ही क्षेत्र को आसानी से पुन: चित्रित किया जा सके। फोर्सकोलिन (टी 0) को जोड़ने से पहले छवियों को कैप्चर करें।
  2. फोर्सकोलिन (तालिका 3) को सीधे ऑर्गनॉइड मीडिया में 10 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। नियंत्रण कुओं में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की समान मात्रा जोड़ें।
  3. हर 15-30 मिनट में नियमित अंतराल पर नियंत्रण और फोर्सकोलिन-उपचारित कुओं की छवि बनाएं। जब इमेजिंग नहीं होती है, तो इनक्यूबेटर में ऑर्गेनोइड ्स रखें या इनक्यूबेशन के साथ नियंत्रित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करें। अधिकतम सूजन 120 मिनट तक देखी जानी चाहिए।
  4. अधिग्रहितछवियों से सापेक्ष सूजन की गणना करने के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।

Representative Results

धारा 2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहे ग्रहणी और जेजुनल ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए गए थे। क्रिप्ट अलगाव चरणों के दौरान यह बहुत महत्वपूर्ण है कि विली पीबीएस से कुशलतापूर्वक समाप्त हो जाएं। यदि क्रिप्ट्स के साथ ईएमई में बहुत अधिक विली चढ़ाया जाता है, तो यह पूरी संस्कृति की मृत्यु और ऑर्गेनॉइड लाइन स्थापित करने में विफलता का कारण बन सकता है। इस वजह से, क्रिप्ट्स को विच्छेदन दायरे के तहत अलग करना उपयोगी है, जिससे विलार की कमी की दृश्य पुष्टि की अनुमति मिलती है। चित्रा 1 प्रतिनिधि विलार टुकड़े और क्रिप्ट (चित्रा 1 ए) को दर्शाता है। विली की तुलना में क्रिप्ट ्स के काफी छोटे आकार पर ध्यान दें (चित्रा 1 बी)। चढ़ाना के बाद, क्रिप्ट ्स अगले कुछ दिनों में स्फेरॉइड में फैल जाएंगे और दिन 4-7 (चित्रा 2) तक कली और अंतर करना शुरू कर देंगे। एक बार जब ऑर्गेनोइड ्स बड़े पैमाने पर बुड चरण तक पहुंच जाते हैं, तो उन्हें पारित किया जाना चाहिए। पासिंग के दौरान, क्रिप्ट कलियों को अलग करने के लिए ऑर्गेनोइड्स को बाधित करना महत्वपूर्ण है, ताकि ऑर्गनॉइड संख्याओं का विस्तार किया जा सके (चित्रा 3 बी)।

ठंड के बाद ऑर्गेनोइड्स की सफल वसूली उस स्थिति पर अत्यधिक निर्भर करती है जिस पर वे जमे हुए हैं। अत्यधिक प्रोलिफ़ेरेटिव उदासीन अवस्था में ऑर्गेनोइड उच्चतम दक्षता के साथ ठीक हो जाते हैं। इसलिए, हम उन्हें बुड्ड और विभेदित होने के बजाय गोलाकार और सिस्टिक होने के लिए प्रेरित करने की सलाह देते हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, मीडिया में डब्ल्यूएनटी लिगैंड आर-स्पोंडिन की मात्रा बढ़ाकर और मीडिया में निकोटिनामाइड को शामिल करके डब्ल्यूएनटी को अतिसक्रिय किया जा सकता है, जिसे कई संस्कृति प्रणालियों30,31 में ऑर्गेनॉइड गठन और सेल अस्तित्व का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है। चित्रा 3 ए पिघलने के 2 दिन बाद एक स्वस्थ ऑर्गेनॉइड संस्कृति को दर्शाता है। पिघलने के दौरान मीडिया में बीएसए को शामिल करने से चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के अस्तित्व में भी मदद मिली है, जो माउस आंतों के ऑर्गेनोइड की तुलना में अधिक नाजुक साबित हुए हैं।

जबकि 3 डी ऑर्गनॉइड कल्चर को अक्सर पसंद किया जाता है क्योंकि यह कुछ सामान्य आंतों की वास्तुकला को पुन: उत्पन्न करता है, यह लाइव इमेजिंग, अभिकर्मक और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन सहित अन्य दृष्टिकोणों को अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है। 3 डी ऑर्गेनोइड्स32 (चित्रा 4) से उत्पन्न 2 डी मोनोलेयर का उपयोग प्लास्मिड के उच्च दक्षता परिचय की अनुमति देता है। जबकि 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड पारंपरिक रूप से क्षणिक अभिकर्मकों के प्रतिरोधी हैं, ईजीएफपी के लिए प्लास्मिड एन्कोडिंग को लिपिड-आधारित अभिकर्मक विधियों का उपयोग करके सफलतापूर्वक पेश किया जा सकता है। पीईआई का उपयोग करके सबसे अधिक लागत प्रभावी दृष्टिकोण चरण 6.1 (चित्रा 5) में उल्लिखित है, लेकिन इलेक्ट्रोपोरेशन और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मकों ने भी तुलनीय परिणाम दिए हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)। भविष्य के अध्ययनों पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा कि क्या इन दृष्टिकोणों का उपयोग सीआरआईएसपीआर संरचनाओं को मोनोलेयर में पेश करने के लिए किया जा सकता है।

अभिकर्मक के बाद 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड्स को सुधारने में सक्षम होना महत्वपूर्ण था ताकि उन्हें क्रिप्ट के 3 डी आर्किटेक्चरल घटकों के साथ एक मार्ग रेखा के रूप में बनाए रखा जा सके। दिलचस्प बात यह है कि ईएमई पर चढ़ाए गए 2 डी मोनोलेयर आसानी से छोटे स्फेरॉइड में सुधार करते हैं जब ईएमई को कोशिकाओं के शीर्ष पर वापस जोड़ा जाता है, जबकि एक कोलेजन आई सब्सट्रेट 3 डी संरचनाओं के सुधार के लिए पर्याप्त नहीं था (चित्रा 6)।

जबकि क्षणिक अभिकर्मक कई अध्ययनों के लिए उपयोगी होते हैं, स्थिर लाइनों का गठन अक्सर अधिक उपयोगी होता है, जिससे कोशिकाओं में लेंटिवायरस की शुरूआत की आवश्यकता होती है। चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल (चित्रा 7) को संशोधित करके लेंटिवायरस से संक्रमित किया गया था। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम छोटे समुच्चय या सेल क्लस्टर में ऑर्गेनोइड्स का विघटन है। यदि संस्कृतियों को कुशलता से बाधित नहीं किया जाता है और ऑर्गेनोइड बरकरार रहते हैं, तो लेंटिवायरल कण कोशिकाओं में नहीं जाएंगे। संक्रमण के बाद, ऑर्गेनोइड्स को ठीक होना चाहिए और फिर से बढ़ना चाहिए। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल चयन से पहले कोशिकाओं के 10% -48% (मतलब: 19.4% ± 6.5%) तक वायरल कणों के उत्थान की अनुमति देता है।

ईएमई अवशेषों या अपूर्ण एंटीबॉडी पेनेट्रेंस के अपूर्ण निष्कासन के कारण ऑर्गेनोइड्स का पूरा माउंट धुंधला होना मुश्किल साबित हो सकता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड्स के मजबूत धुंधलापन की अनुमति देता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ऑर्गेनोइड्स का विज़ुअलाइज़ेशन भी मुश्किल साबित हो सकता है यदि वे कवरस्लिप से बहुत दूर हैं। VALAP का उपयोग करके, कुछ ऊंचाई वाला एक कुआं बनाया जाता है जैसे कि ऑर्गेनोइड्स को कवरस्लिप द्वारा कुचल नहीं दिया जाता है, लेकिन फिर भी इमेजिंग में आसानी के लिए कवरस्लिप के करीब बसने की अनुमति दी जाती है। एफ-एक्टिन लेबल करने के लिए एपिकल आयन चैनल सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) और फैलोइडिन के खिलाफ प्रतिनिधि धुंधलापन चित्र 8 में दिखाया गया है।

अंत में, ऑर्गेनोइड्स की कार्यात्मक परख में उपयोगिता है। सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों से रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उपयोग सीएफटीआर फ़ंक्शन को स्क्रीन करने के लिए किया गया है, क्योंकि सीएमपी एगोनिस्ट फोर्स्कोलिन के साथ उपचार मजबूत सीएफटीआरआई-मध्यस्थता द्रव स्राव को प्रेरित करता है, जिससे ऑर्गेनॉइड सूजन 29,33-37 हो जाती है। इस काम का एक लक्ष्य एक ऑर्गनॉइड मॉडल की पहचान करना और विकसित करना था जिसका उपयोग विवो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के समानांतर किया जा सकता है। इसलिए, हमने यह निर्धारित करने का लक्ष्य रखा कि क्या चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड फोर्स्कोलिन-प्रेरित सूजन से गुजरते हैं। दरअसल, फोर्सकोलिन उपचार के 30 मिनट के भीतर, चूहे के ऑर्गेनोइड ्स सूज गए, जिसका अधिकतम प्रभाव 120 मिनट तक देखा गया (चित्रा 9)।

Figure 1
चित्रा 1: उपकला अलगाव के दौरान विलार टुकड़े और क्रिप्ट। (ए) क्रिप्ट अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान ईडीटीए समाधान में विलार टुकड़ों की प्रतिनिधि छवि। पीले तीर के निशान विलार के टुकड़ों को चिह्नित करते हैं। लाल तीर एक विलार टुकड़े से जुड़े क्रिप्ट को दर्शाते हैं। सापेक्ष आकार में अंतर पर ध्यान दें। (बी) एकल क्रिप्ट (लाल तीर) की उच्च आवर्धन छवि ताकि आकृति विज्ञान की कल्पना की जा सके। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड प्रगति। चूहे के जेजुनम क्रिप्ट्स को अलगाव (ए, बी) के तुरंत बाद ईएमई में चढ़ाया गया था। 2 दिनों के भीतर, क्रिप्ट ्स स्फेरॉइड (सी, डी) बन गए। दिन 5 तक, उन्होंने क्रिप्ट बड्स (ई, एफ) शुरू करना शुरू किया, जो दिन 7 (जी) तक विस्तृत और बढ़ गया। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पिघलने और पासिंग के बाद ऑर्गेनोइड्स। (ए) क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए चूहे के जेजुनल ऑर्गेनोइड्स को पिघलाया गया था। पिघलने के सिर्फ 2 दिन बाद स्फेरॉइड और बुडेड ऑर्गेनोइड दोनों की उपस्थिति पर ध्यान दें। (बी) उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए गुजरने के तुरंत बाद ए में चित्रित एक ही ऑर्गनॉइड लाइन। ए और बी में संरचनाओं के बीच सापेक्ष आकार अंतर और बी में एकल क्रिप्ट जैसे डोमेन की उपस्थिति पर ध्यान दें। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 3 डी ऑर्गेनोइड्स से 2 डी मोनोलेयर गठन। (ए-सी) ईएमई पर 2 डी मोनोलेयर प्रगति। (डी-एफ) कोलेजन I पर 2 डी मोनोलेयर प्रगति। दिन 5 तक, प्रत्येक स्थिति ने ~ 80% स्थिरता प्राप्त की। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 2 डी मोनोलेयर का क्षणिक अभिकर्मक। ईएमई पर उगाए गए 2 डी मोनोलेयर की प्रतिनिधि छवि क्षणिक रूप से पीईआई का उपयोग करके पीएलजेएम 1-ईजीएफपी प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित होती है। (ए) ब्राइटफील्ड, (बी) फ्लोरेसेंस (जीएफपी), (सी) ओवरले। बिंदीदार लाल रेखा मोनोलेयर सीमा को चिह्नित करती है। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: ईएमई पर 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड्स का सुधार। (ए) ईएमई पर उगाए गए 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड का गठन। मोनोलेयर की एपिकल सतह पर ईएमई जोड़ने के 5 दिनों बाद ऑर्गेनोइड्स कुशलतापूर्वक बनते हैं। छोटे 3 डी स्फेरॉइड के आसपास मृत कोशिकाओं की बहुतायत पर ध्यान दें। (बी) कोलेजन पर उगाए गए 2 डी मोनोलेयर की एपिकल सतह में कोलेजन I को जोड़ने के 5 दिन बाद 2 डी मोनोलेयर की दृढ़ता I. स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: 3 डी ऑर्गेनोइड्स का लेंटिवायरल संक्रमण। उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहे जेजुनम ऑर्गेनोइड्स को परमाणु जीएफपी लेंटिवायरल कणों से संक्रमित किया गया था। 5 दिनों के लिए वसूली और विकास के बाद, ऑर्गेनोइड्स को ठीक किया गया और डीएपीआई के साथ प्रतिस्थापित किया गया। (ए) डीएपीआई: ग्रे; न्यूक्लियरजीएफपी: हरा। (बी) परमाणु जीएफपी: हरा। बिंदीदार लाल रेखा ऑर्गेनॉइड सीमा को चिह्नित करती है। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (ए) सीएफटीआर, (बी) फेलोइडिन, और (सी) चूहे जेजुनल ऑर्गेनोइड्स के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का विलय हो गया। ऑर्गेनोइड्स (ए में ग्रे, सी में मैजेंटा) में सीएफटीआर धुंधला होने के एपिकल संवर्धन पर ध्यान दें। फेलोइडिन एफ-एक्टिन को चिह्नित करता है और एपिकल ब्रश बॉर्डर (बी में ग्रे, सी में सियान) को प्रमुखता से लेबल करता है। स्केल सलाखों: 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: फोर्स्कोलिन उत्तेजना पर चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड सूज जाते हैं। सीएमपी एगोनिस्ट फोर्स्कोलिन के अलावा चूहे की आंतों के ऑर्गेनॉइड सूजन का प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम। 0 मिनट का समय 10 μM forskoline के जुड़ने से तुरंत पहले समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। चित्र 30 मिनट के समय अंतराल पर एक ही ऑर्गेनॉइड दिखाते हैं। फोर्सकोलिन जोड़ने के बाद 120 मिनट में अधिकतम सूजन देखी गई। बिंदीदार लाल रेखा ऑर्गेनॉइड सीमा को रेखांकित करती है। ऑर्गनॉइड लुमेन के बीच में अंधेरे सामग्री में मृत कोशिकाएं शामिल होती हैं। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: AdDMEM + नुस्खा. मानक AdDMEM + मीडिया बनाने के लिए सामग्री, जो यहां दिखाए गए तरीकों में आधार मीडिया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: चूहा आंतों के ऑर्गनॉइड मीडिया (आरआईओएम) नुस्खा। मानक चूहे आंतों के ऑर्गनॉइड मीडिया का विस्तृत नुस्खा, जिसमें पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए विलायक और भंडारण की स्थिति शामिल है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: समाधान। पूरे प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अन्य समाधान बनाने के लिए व्यंजनों और निर्देश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4. 2 डी मोनोलेयर कल्चर (आरआईओएम 2 डी) के लिए चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड माध्यम। मोनोलेयर के 2 डी विकास के लिए अनुकूलित ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया का संशोधित नुस्खा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

चूहे की आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल का विकास विवो में अंग में पाए जाने वाले महत्वपूर्ण कार्यात्मक विशेषताओं को संरक्षित करता है और प्रीक्लिनिकल परीक्षण, दवा स्क्रीनिंग और कार्यात्मक परख के लिए एक आशाजनक उपकरण है। इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग विवो प्रीक्लिनिकल गैस्ट्रोएंटरोलॉजी अध्ययनों के समानांतर किया जा सकता है, जिसके लिए चूहे अक्सर अपने बड़े आंतों के आकार, मनुष्यों के साथ साझा शारीरिक पहलुओं और कुछ मामलों में बेहतर रोग मॉडल38 होने के कारण एक पसंदीदा मॉडल होते हैं। यहां, चूहे की आंतों के क्रिप्ट्स के अलगाव, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और दीर्घकालिक संस्कृति के साथ-साथ कार्यात्मक फोर्स्कोलिन सूजन परख, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, 2 डी मोनोलेयर कल्चर और लेंटिवायरल आनुवंशिक हेरफेर सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक मजबूत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स कई रोग संदर्भों में प्रासंगिक होने की संभावना है जहां माउस मॉडल का पैथोफिज़ियोलॉजी अनुचित है और माउस आंतों के ऑर्गेनोइड की तुलना में मानव आंतों के शरीर विज्ञान के लिए एक बेहतर मॉडल प्रदान कर सकता है।

लंबे समय तक रहने वाले ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए जिन्हें पारित और विस्तारित किया जा सकता है, आंतों के उपकला प्रसार को बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रमुख विकास कारकों की पहचान करना आवश्यक है। माउस ऑर्गेनोइड्स को अक्सर ईजीएफ, आर-स्पोंडिन और नोगिन के एक साधारण कॉकटेल में उगाया जाता है, हालांकि यह बताया गया है कि आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर39 के लिए नोगिन आवश्यक नहीं है। वातानुकूलित मीडिया पुनः संयोजक विकास कारकों को प्रतिस्थापित कर सकता है और सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें एल-डब्ल्यूआरएन हैं, जो डब्ल्यूएनटी 3 ए, आरएसपोंडिन -3, और नोगिन39, एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए और एचए-आरएसपोंडिन 1-एफसी 293 टी कोशिकाओं40 को स्रावित करती हैं। एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया न केवल माउस आंतों के39 ऑर्गेनॉइड विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है, बल्कि कुत्तों, बिल्लियों, मुर्गियों, घोड़ों, गायों, भेड़ और सूअरों सहित कई खेत जानवरों और साथी जानवरों से आंतों के ऑर्गेनोइड ्स की वृद्धि का समर्थन करताहै। हालांकि, मानव आंतों के ऑर्गेनोइड ्स उनकी विकास कारक आवश्यकताओं में बहुत अलग हैं, क्योंकि उन्हें अपने विस्तार विकास चरण (यानी, छोटे से बड़े स्फेरॉइड तक प्रगति) बनाम उनके भेदभाव चरण (यानी, विभेदित सेल प्रकारों की पीढ़ी और परिपक्वता) के लिए अलग-अलग मीडिया फॉर्मूलेशन की आवश्यकता होती है। चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की मीडिया आवश्यकताएं मानव आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए विस्तार विकास मीडिया को बारीकी से प्रतिबिंबित करती हैं, फिर भी, विशेष रूप से, चूहे के ऑर्गेनोइड इस मीडिया वातावरण में विकास और भेदभाव दोनों में सक्षम हैं, जो उनकी संस्कृति आवश्यकताओं को काफी सरल बनाते हैं। जबकि हमारे शुरुआती प्रयासों ने एल-डब्ल्यूआरएन-वातानुकूलित मीडिया में चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने और बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित किया, दीर्घकालिक संस्कृति कमजोर थी, और चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड लाइनों को मजबूती की कमी का सामना करना पड़ा (डेटा नहीं दिखाया गया)। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि एल-डब्ल्यूआरएन सेल लाइनों को आर-स्पोंडिन 3 को स्रावित करने के लिए इंजीनियर किया जाता है, जबकि यहां अनुशंसित 293 टी-आरएसपीओ 1 सेल लाइन को आर-स्पोंडिन 1 को स्रावित करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। यह संभव है कि चूहे और मानव ऑर्गेनोइड आर-स्पोंडिन 1 पसंद करते हैं, जो संभावित रूप से एल-डब्ल्यूआरएन वातानुकूलित मीडिया में चूहे के ऑर्गेनोइड लाइनों की विफलता के लिए जिम्मेदार है।

विवो सेटिंग में सबसे बारीकी से पुन: उत्पन्न करने के लिए, ऑर्गेनॉइड कल्चर स्थितियों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो स्टेम सेल अस्तित्व, रखरखाव और प्रसार की अनुमति देते हैं, और जो सेलुलर टर्नओवर और असतत सेल प्रकारों में एक साथ भेदभाव की घटनाओं को बनाए रख सकते हैं। इसलिए, वातानुकूलित मीडिया में पुनः संयोजक प्रोटीन और / या प्रोटीन की सांद्रता को इस सही संतुलन को बनाने के लिए कसकर टाइट और नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के नुकसान से बचने के लिए इष्टतम डब्ल्यूएनटी स्तर आवश्यक हैं। वातानुकूलित मीडिया में बहुत कम डब्ल्यूएनटी विकास का समर्थन करने में असमर्थ होगा, जिससे स्टेम कोशिकाओं का नुकसान होगा और बाद में ऑर्गेनॉइड की मृत्यु हो जाएगी; डब्ल्यूएनटी के अतिसक्रियण से ऑर्गेनोइड्स सिस्टिक और उदासीन10 हो जाएंगे। जबकि यहां विस्तृत नहीं है, एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए और 293 टी-आरएसपीओ 1 वातानुकूलित मीडिया के प्रत्येक बैच का परीक्षण करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, जिसमें डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर ल्यूसिफेरस परख का उपयोग किया जाता है, जैसे कि टॉपफ्लैश सेल लाइन41। पिछले अध्ययनों ने वर्णन किया है कि एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए मीडिया के एक इष्टतम बैच के परिणामस्वरूप 12.5% पर 15 गुना सिग्नल वृद्धि और 1% एल-डब्ल्यूएनटी 3 ए 10 की तुलना में50% पर 300 गुना सिग्नल वृद्धि होनी चाहिए। चूंकि चूहे के ऑर्गेनोइड ्स संस्कृति आवश्यकताओं, विशेष रूप से डब्ल्यूएनटी सक्रियण स्तरों के लिए माउस ऑर्गेनोइड्स की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं, ये अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम चूहे के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की मजबूती और विश्वसनीयता को सुविधाजनक बनाने में बहुत सहायता करते हैं। चूंकि नोगिन वातानुकूलित मीडिया में बीएमपी गतिविधि और सापेक्ष नोगिन सांद्रता के परीक्षण के लिए एक समान रिपोर्टर लाइन उपलब्ध नहीं है, इसलिए नोगिन स्तरों को ठीक से नियंत्रित करने के लिए संभव होने पर पुनः संयोजक नोगिन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। जबकि माउस आंतों के ऑर्गेनोइड्स को नोगिन39 की अनुपस्थिति में उगाया और बनाए रखा जा सकता है, यह चूहे आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए प्रयास नहीं किया गया है।

सेल कल्चर आवश्यकताओं से परे, एक चूहे के ऑर्गनॉइड लाइन की सफल प्रारंभिक स्थापना क्रिप्ट अलगाव के दौरान विभेदित विली की कुशल कमी पर गंभीर रूप से निर्भर करती है। विल्लर संदूषण के उच्च स्तर क्रिप्ट मृत्यु का कारण बनते हैं, संभवतः मरने वाली कोशिकाओं से संकेत या आवश्यक कारकों के अनुक्रम के कारण। उपकला तैयारी से इन विभेदित विली को ठीक से और लगातार कम करने के लिए, स्टीरियोस्कोप की सहायता से उपकला अलगाव करने की सिफारिश की जाती है। जारी किए जा रहे एपिथेलियम की दृश्य परीक्षा एक स्पष्ट संकेत प्रदान करती है कि पीबीएस को कब त्यागना है और इसे बदलना है (चित्रा 1)। क्रिप्ट ्स को तब तक एकत्र नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि विली की पर्याप्त कमी न हो। विलर कोशिकाएं टर्मिनल रूप से विभेदित होती हैं और संस्कृति में ऑर्गेनोइड उत्पन्न नहीं कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड्स के बाद के पासिंग और किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए उनके उपयोग के लिए नाजुक देखभाल की आवश्यकता होती है। लंबे समय तक (10 मिनट) के लिए पृथक्करण अभिकर्मकों में इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु और ऑर्गेनॉइड लाइन का नुकसान होता है।

यहां, चूहे के ऑर्गेनोइड्स से आंतों के मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक सरल और तेज़ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। ईएमई और कोलेजन आई सब्सट्रेट्स का एपिथेलियम पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है, जिसे अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर लाभ उठाया जा सकता है। ईएमई एकल कोशिकाओं के तेजी से और कुशल आसंजन और सेल अनुमानों के गठन की अनुमति देता है। इसके विपरीत, कोलेजन I के साथ सतह को कोटिंग करने से इन प्रक्रियाओं में देरी होती है। एक बार जब मोनोलेयर लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो ईएमई पर विकसित कोशिकाएं फिर से 3 डी ऑर्गेनॉइड संरचनाएं उत्पन्न करना शुरू कर देती हैं। हालांकि, उनके पास निरंतर विकास के लिए पर्याप्त भौतिक और रासायनिक समर्थन की कमी है। 50% -80% की स्थिरता पर ईएमई में मोनोलेयर को बनाए रखकर ऑर्गनॉइड अवस्था में इस पुनरावृत्ति को रोका जा सकता है। मोनोलेयर की एपिकल सतह पर पतला ईएमई जोड़ने से डी नोवो ऑर्गेनोइड्स की तेजी से वसूली और गठन को बढ़ावा मिलता है, जिससे अभिसरण के क्षेत्र अधिक तेज़ी से और आसानी से उत्पन्न होते हैं। कोलेजन I सतह पर, कोशिकाएं एक समान मोनोलेयर बना सकती हैं और छोटे क्लस्टर उत्पन्न कर सकती हैं। हालांकि, मोनोलेयर के शीर्ष पर कोलेजन आई का जोड़ ऑर्गनॉइड गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं है। मोनोलेयर सतह में जोड़ते समय ईएमई को पतला किया जाना चाहिए, क्योंकि नवजात ऑर्गेनॉइड को दूर करने के लिए एक मजबूत यांत्रिक प्रतिरोध होगा। हालांकि, यह पतला ईएमई बड़े ऑर्गेनोइड के मजबूत गठन की अनुमति नहीं देता है। किसी भी नए उत्पन्न चूहे के ऑर्गेनोइड्स जो स्वाभाविक रूप से सतह से अलग हो जाते हैं, उन्हें तुरंत हटा दिया जाना चाहिए और बिना पतला ईएमई में स्थानांतरित किया जाना चाहिए ताकि संरचनात्मक समर्थन और विकास को बहाल किया जा सके। इस चरण में ऑर्गेनोइड्स के छोटे आकार के कारण, मजबूत विकास स्थापित होने तक ऑर्गेनोइड्स के पारित होने की सिफारिश नहीं की जाती है। ईएमई ऑर्गेनोइड्स के सुधार का समर्थन क्यों कर सकता है, इसका अंतर्निहित जैविक महत्व, लेकिन क्या कोलेजन मैं ऐसा कर सकता हूं या नहीं, स्पष्ट नहीं है। हालांकि, ऐसी रिपोर्टें हैं कि 3 डी कोलेजन में विकसित कोशिकाएं बुड्ड ऑर्गेनोइड42,43 नहीं बना सकती हैं या दीर्घकालिक रखरखाव का समर्थन नहीं कर सकती हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईएमई उत्पाद बाह्य प्रोटीन, मुख्य रूप से लैमिनिन और कोलेजन IV44 के विषम मिश्रण हैं। इसलिए, प्रोटीन की विशिष्ट संरचना और विभिन्न सेलुलर परिसरों का उपयोग करके बाह्य मैट्रिक्स के साथ जुड़ने के लिए एक उपकला कोशिका की क्षमता ईएमई में रीमॉडेलिंग की अनुमति दे सकती है लेकिन कोलेजन आई नहीं। क्या कोलेजन आई-व्युत्पन्न मोनोलेयर को ऑर्गेनॉइड गठन और विकास का समर्थन करने के लिए ईएमई में रखा जा सकता है, इसका परीक्षण नहीं किया गया है।

चूहे की आंतों के ऑर्गनॉइड मॉडल के आनुवंशिक हेरफेर को यहां वर्णित किया गया है, और 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन और 2 डी मोनोलेयर के क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। लेंटिवायरल ऑर्गनॉइड ट्रांसडक्शन की कम दक्षता को दूर करने के लिए, 2 डी मोनोलेयर के क्षणिक अभिकर्मक के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। मोनोलेयर के फ्लैट आकृति विज्ञान और उजागर एपिकल डोमेन वायरस और डीएनए युक्त परिसरों तक आसान पहुंच प्रदान करते हैं। इस तकनीक के सत्यापन के लिए पीएलजेएम 1-ईजीएफपी वेक्टर का उपयोग करने वाले ईजीएफपी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का उपयोग किया गया था। जीएफपी रिपोर्टर अभिव्यक्ति 24 घंटे के बाद देखी गई थी, और मोनोलेयर में 5-6 दिनों तक बनाए रखी गई थी। मोनोलेयर के लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन पर ध्यान केंद्रित करने वाले भविष्य के अध्ययनों में 3 डी ऑर्गनॉइड ट्रांसडक्शन की तुलना में उच्च दक्षता होने की संभावना है। उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, स्थिर लाइनों के निर्माण की सुविधा के लिए संक्रमित 2 डी मोनोलेयर से 3 डी ऑर्गेनोइड्स में सुधार किया जा सकता है। देखभाल के साथ, चूहे की आंतों के ऑर्गेनोइड लाइनों को एक वर्ष से अधिक समय तक सफलतापूर्वक बनाए रखा जा सकता है, कई मार्गों पर स्थिर रहना, क्रायोप्रिजर्व, सफलतापूर्वक पिघलाना, और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है, जिससे एक सुलभ और ट्रैक्टेबल इन विट्रो आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल की आवश्यकता को संबोधित किया जा सकता है जो मनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता को बरकरार रखता है।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम सुमिग्रे और अमीन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी विचारशील चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन चाइल्ड हेल्थ ग्रांट और केएस को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन अनुदान (004741पी 222) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज द्वारा एनए को पुरस्कार संख्या 2आर01डीके077065-12 के तहत समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503

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जीव विज्ञान अंक 196
चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और हेरफेर
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Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen,… More

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).

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