Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65343
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 1,5,6
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية للفئران واستخدامها في العديد من التطبيقات النهائية. غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا قبل السريري ، ويملأ النظام العضوي المعوي القوي الحاجة إلى نظام في المختبر لمرافقة الدراسات في الجسم الحي .

Abstract

عند استخدام المواد العضوية لتقييم قرارات علم وظائف الأعضاء ومصير الخلية ، من المهم استخدام نموذج يلخص عن كثب في سياقات الجسم الحي . وفقا لذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية وفحص العلاج الشخصي. تستخدم عضويات الأمعاء في الفئران بشكل شائع لفهم جوانب كل من وظيفة الأمعاء / علم وظائف الأعضاء وديناميكيات الخلايا الجذعية / قرارات المصير. ومع ذلك ، في العديد من سياقات المرض ، غالبا ما تفضل الفئران على الفئران كنموذج بسبب تشابهها الفسيولوجي الأكبر مع البشر من حيث الفيزيولوجيا المرضية للمرض. كان نموذج الفئران محدودا بسبب نقص الأدوات الوراثية المتاحة في الجسم الحي ، وقد أثبتت الكائنات العضوية المعوية للفئران أنها هشة ويصعب استزراعها على المدى الطويل. هنا ، نبني على البروتوكولات المنشورة مسبقا لتوليد عضويات معوية للفئران بقوة من الاثني عشر والصائم. نحن نقدم لمحة عامة عن العديد من التطبيقات النهائية التي تستخدم عضويات معوية للفئران ، بما في ذلك مقايسات التورم الوظيفي ، وتلطيخ جبل كامل ، وتوليد أحاديات الطبقة المعوية 2D ، ونقل lentiviral . يوفر نموذج الفئران العضوي حلا عمليا لحاجة الحقل إلى نموذج في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر ، ويمكن التلاعب به وراثيا بسرعة ، ويمكن الحصول عليه بسهولة دون الحواجز التي ينطوي عليها شراء عضويات معوية بشرية.

Introduction

العمارة الظهارية المعوية الصغيرة البشرية والتكوين الخلوي معقدة ، مما يعكس وظائفها الفسيولوجية. يتمثل الدور الأساسي للأمعاء الدقيقة في امتصاص العناصر الغذائية من الطعام الذي يمر عبر تجويفها1. لتعظيم هذه الوظيفة ، يتم تنظيم سطح الأمعاء في نتوءات تشبه الأصابع تسمى الزغابات ، والتي تزيد من مساحة السطح الامتصاصية ، والغزوات الشبيهة بالكوب تسمى الخبايا ، والتي تضم الخلايا الجذعية وتعزلها. داخل الظهارة ، يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا الامتصاصية والإفرازية المتخصصة لأداء وظائف مميزة1. بسبب هذا التعقيد ، كان من الصعب نمذجة أنسجة مثل الأمعاء في خطوط الخلايا الخالدة عالية الممرات. ومع ذلك ، فإن دراسة الخلايا الجذعية ، وخاصة الخلايا الجذعية البالغة وآليات تمايزها ، سمحت بتطوير الثقافات العضوية المعوية 3D. أدى استخدام النماذج العضوية إلى تحويل المجال ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تلخيصها لبعض المكونات المعمارية وعدم تجانس نوع الخلية الموجود في الأمعاء السليمة. يمكن زراعة الكائنات العضوية المعوية على المدى الطويل في المختبر بسبب الحفاظ على عدد الخلايا الجذعية النشطة2.

أصبحت الكائنات العضوية المعوية بسرعة نموذجا قابلا للتكيف لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ، وفسيولوجيا الخلية ، والأمراض الوراثية ، والتغذية 3,4 ، بالإضافة إلى أداة لتطوير طرق جديدة لتوصيل الأدوية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض ، واكتشاف الأدوية ، وفحص العلاج الشخصي ، من بين أمور أخرى6،7،8،9. ومع ذلك ، لا تزال الكائنات العضوية المعوية البشرية تمثل تحديات. إن توافر الأنسجة ، ومتطلبات موافقة مجلس المراجعة المؤسسية ، والقضايا الأخلاقية تحد من الاستخدام الواسع النطاق للعينات البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الكائنات العضوية المعوية البشرية المتولدة من الخبايا المعوية شرطين متميزين للثقافة للحفاظ على الخلايا الجذعية غير المتمايزة أو للحث على تمايز أنواع الخلايا الناضجة10. هذا يتناقض مع الجسم الحي ، حيث توجد الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا المتمايزة الناضجة في وقت واحد ويتم توليدها / صيانتها باستمرار1. من ناحية أخرى ، لا تتطلب الكائنات العضوية المعوية للفأر ، والتي تزرع في مزيج أقل تعقيدا من عوامل النمو ، هذا التبديل في تكوين الوسائط ويمكنها الحفاظ على الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة في نفس سياق الوسائط 2,11. ومع ذلك ، فإن الاختلافات الرئيسية في أمعاء الفأر عند مقارنتها بالبشر يمكن أن تجعل عضويات الفئران نموذجا دون المستوى الأمثل في كثير من الحالات. بشكل عام ، تم إنشاء العديد من الكائنات العضوية المعوية من الثدييات الكبيرة ، بما في ذلك الخيول والخنازير والأغنام والأبقار والكلاب والقطط ، بنجاح في ظروف الاستزراع الأكثر توافقا مع الكائنات العضوية المعوية للفأر من ظروف زراعة الكائنات العضوية المعوية البشرية12. من المحتمل أن تعكس الاختلافات في ظروف عامل النمو بين الفئران والكائنات العضوية البشرية الاختلافات في تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة والمتطلبات المختلفة لبقاء الخلايا الجذعية وانتشارها وصيانتها. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام عضوي نموذجي يسهل الوصول إليه 1) يشبه إلى حد كبير تكوين الخلايا المعوية البشرية ، 2) يحتوي على خلايا جذعية ذات متطلبات عامل النمو مثل تلك الخاصة بالكائنات العضوية المعوية البشرية ، و 3) قادر على الحفاظ باستمرار على مقصورات غير متمايزة ومتباينة. من الناحية المثالية ، سيكون النظام من نموذج حيواني قبل سريري شائع الاستخدام ، بحيث يمكن ربط التجارب في الجسم الحي وفي المختبر واستخدامها جنبا إلى جنب.

الفئران هي نموذج ما قبل السريري شائع الاستخدام لفسيولوجيا الأمعاء ودراسات علم الأدوية بسبب تشابهها الشديد في فسيولوجيا الأمعاء والكيمياء الحيوية للبشر13 ، خاصة فيما يتعلق بنفاذية الأمعاء14. حجمها الأكبر نسبيا مقارنة بالفئران يجعلها أكثر قابلية للعمليات الجراحية. في حين أن النماذج الحيوانية الكبيرة ، بما في ذلك الخنازير ، تستخدم في بعض الأحيان ، فإن الفئران هي نموذج أكثر بأسعار معقولة ، وتتطلب مساحة أقل للتربية ، ولديها سلالات قياسية متاحة تجاريابسهولة 15. عيب استخدام نماذج الفئران هو أن مجموعة الأدوات الجينية للدراسات في الجسم الحي ليست متطورة بشكل جيد مقارنة بالفئران ، وغالبا ما يكون توليد سلالات الفئران الجديدة ، بما في ذلك الضربة القاضية ، والضربات القاضية ، والجينات المحورة ، باهظ التكلفة. إن تطوير وتحسين نموذج عضوي قوي لأمعاء الفئران من شأنه أن يسمح بالتلاعب الجيني والعلاجات الدوائية ودراسات الإنتاجية الأعلى في نموذج يمكن الوصول إليه يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية الرئيسية للبشر. ومع ذلك ، فإن مزايا نموذج عضوي للقوارض مقابل آخر تعتمد بشكل كبير على العملية أو الجين المعين قيد الدراسة. قد تكون بعض الجينات الموجودة في البشر جينات زائفة في الفئران ولكن ليس الفئران16,17. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن أنواع فرعية من الخلايا الخاصة بالأنواع بواسطة RNAseqأحادي الخلية 18،19،20. أخيرا ، غالبا ما تظهر نماذج الأمراض المعوية للفئران والفئران اختلافات كبيرة في الأنماط الظاهرية21,22 بحيث يجب اختيار النموذج الذي يلخص الأعراض وعملية المرض التي تظهر في البشر عن كثب للعمل النهائي. يوفر إنشاء نموذج عضوي معوي للفئران مرونة واختيارا إضافيا للباحثين في اختيار نظام نموذجي أكثر ملاءمة لظروفهم. هنا ، يتم توسيع البروتوكولات الحالية23،24 لتوليد عضويات معوية للفئران ويتم تحديد بروتوكول لتوليد وصيانة الكائنات العضوية المعوية للفئران من الاثني عشر أو الصائم. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك العدوى الفيروسية العدسية ، وتلطيخ جبل كامل ، ومقايسات تورم فورسكولين.

Protocol

ملاحظة: يجب التعامل مع جميع زراعة الخلايا باستخدام تقنية معقمة مناسبة في غطاء زراعة الأنسجة. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة ييل (IACUC).

1. إعداد كواشف زراعة الخلايا

  1. قم بإعداد الوسائط المشروطة R-spondin 1 باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد الوسائط المكيفة Wnt3a باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد AdDMEM + كما هو موضح في الجدول 1.
  2. أعد تعليق الغاسترين في dH2O المعقم لتحضير مخزون 100 ميكرومتر. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية. أعد تعليق N-acetylcysteine في ماء معقم لتحضير مخزون 100 mM. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  3. إعادة تعليق Noggin البشري المؤتلف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + 0.1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) لتحضير مخزون 250 ميكروغرام / مل. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية. أعد تعليق عامل نمو بشرة الفأر المؤتلف (EGF) في PBS + 0.1٪ BSA لإعداد مخزون 100 ميكروغرام / مل. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. تمييع IGF-1 البشري المؤتلف في PBS + 0.1٪ BSA لإعداد مخزون 100 ميكروغرام / مل. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية. إعادة تعليق FGF-2 البشري المؤتلف في 5 mM Tris ، درجة الحموضة 7.6 ، لإعداد مخزون 100 ميكروغرام / مل. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لجميع عوامل النمو ، استخدم تخفيفا متوسطا في PBS + 0.1٪ BSA إلى 100x التركيز النهائي في وسط الاستزراع. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2. إنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئران

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكولين تم نشرهما سابقا للعضويات المعويةللفئران 23،24.

  1. تحضير الوسائط العضوية المعوية للفئران (rIOM) وفقا للجدول 2 وتعيين حمام مائي عند 37 درجة مئوية. هذا الوسط الكامل مستقر لمدة 5 أيام عند 4 درجات مئوية.
  2. تحضير 10 مل من 3 ملليمتر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل والاحتفاظ بها على الجليد. قم بإذابة 250 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة خارج الخلية (EME) على الجليد.
  3. بسرعة الفئران بين عشية وضحاها مع الوصول إلى المياه الإعلانية libitum. القتل الرحيم للفأر وفقا للبروتوكول المعتمد من IACUC. في هذا البروتوكول ، تم القتل الرحيم لذكور الفئران البالغة Sprague Dawley (التي تزن ~ 200 جم) عن طريق استنشاق CO2 (جدول المواد). تم استخدام خلع عنق الرحم كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
  4. استخدم ملقط معقم معقم ومقص تشريح للتشريح. ضع الجرذ الرحيم على الجانب البطني لسطح التشريح لأعلى. قرصة طبقة الجلد مع ملقط. يجب إجراء التخفيضات التالية على مستوى السطح ، بحيث يتم قطعها فقط من خلال طبقة الجلد هذه وليست عميقة بما يكفي لإتلاف الأعضاء الداخلية.
  5. لفتح تجويف البطن ، باستخدام مقص تشريح كبير وحاد ، قم بقطع طبقة الجلد في قطع كبير طولي على مستوى السطح في وسط البطن. بعد ذلك ، انطلاقا من هذا القطع ، قم بعمل قطعتين أفقيتين أقصر ، واحدة على كل جانب. استخدم الملقط لتقشير الجلد بعيدا لكشف تجويف البطن. قطع الغشاء البريتوني لفضح الأعضاء الداخلية بالكامل في تجويف البطن مع سهولة الوصول إلى الأمعاء.
  6. باستخدام المقص والملقط ، حدد موقع المعدة وحدد الاثني عشر حوالي 2-3 سم البعيد ، والذي يظهر كقطعة صفراء. يقع الصائم القريب على بعد حوالي 4-5 سم من رباط تريتز ، والذي يعمل كمعلم بين الاثني عشر والصائم.
  7. ضع الجزء المعوي المعزول في طبق بتري 10 سم. تنظيف الجزء المعوي المطلوب من المساريق قدر الإمكان. اغسل ب 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد حتى يتم التخلص من محتويات اللمعة. على منشفة ورقية ، قم بقطع الجزء المعوي إلى قطع طولها ~ 2 سم. افتح كل قطعة معوية طوليا لفضح الظهارة.
  8. باستخدام شريحة مجهر زجاجي ، اكشط سطح اللمعان المكشوف لإزالة الزغب. ضع القطع المعوية في محلول EDTA المحضر على الثلج. قم بالتدوير عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على مسدس أنبوبي مضبوط على 10 دورات في الدقيقة.
  9. في المجهر التشريحي ، صب محتويات الأنبوب المخروطي في طبق بتري 10 سم. أضف ~ 5 مل إضافية من برنامج تلفزيوني بارد.
  10. باستخدام ملقط ناعم ، أمسك شريحة معوية ويهز بقوة. سيكون من الممكن رؤية إطلاق الظهارة في برنامج تلفزيوني. في البداية ، سيحتوي برنامج PBS بشكل أساسي على الزغب.
  11. استمر في الهز. تخلص بشكل دوري من برنامج تلفزيوني يحتوي على الزغابات وأضف 10 مل من برنامج تلفزيوني طازج بارد إلى شظايا الأمعاء. استمر في هز الشظايا وكرر خطوة الغسيل هذه حتى لا يتم إطلاق الزغب في PBS ، ولكن بدلا من ذلك يحتوي PBS بشكل أساسي على خبايا. لا تتجاوز 15 دقيقة لعزل القبو ، بحيث لا يتم المساس بصلاحية الخلية.
  12. تجاهل الشظايا المعوية المتبقية. إثراء PBS المتبقية في طبق بتري للخبايا المعوية. في غطاء زراعة الأنسجة ، اجمع الخبايا المحتوية على PBS وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر (جدول المواد).
  13. أجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من AdDMEM +. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 × ز لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يوصى باستخدام جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح.
  14. قم بإزالة المادة الطافية ، وترك ~ 50 ميكرولتر من الوسائط مع الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في الوسائط المتبقية وأضفها إلى حصصة EME على الجليد. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتعليق الخبايا بالتساوي في جميع أنحاء EME. تجنب إدخال الفقاعات.
  15. صفيحة 50 ميكرولتر من قباب EME في طبق زراعة الأنسجة 35 مم واحتضانها لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  16. أضف 2 مل من rIOM (الجدول 2) يحتوي على 10 ميكرومتر Y27632 و 10 ميكرومتر CHIR99021 (الجدول 3). بعد المرور ، يمكن إيقاف Y27632 و CHIR99021.
  17. قم بتغيير rIOM كل 2-3 أيام. المرور حسب الحاجة ، عادة ما بين 3-7 أيام ، اعتمادا على العدد الأولي للعضويات والحجم ومعدل النمو.

3. تمرير الفئران العضوية المعوية

  1. قم بإذابة حصة 250 ميكرولتر من EME على الجليد وقم بتسخين rIOM إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بنضح الوسط من لوحة 35 مم تحتوي على مواد عضوية وأضف 1 مل من كاشف التفكك لتحرير الكائنات العضوية على الفور من قباب EME.
  3. نقل كاشف التفكك على الفور مع عضويات مجزأة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. اغسل طبق الاستزراع ب 2 مل من AdDMEM + وأضفه إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على مواد عضوية مجزأة.
  4. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل 15-20 مرة لتفتيت المواد العضوية. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 2 دقيقة.
  5. أضف ~ 50 ميكرولتر من المحلول من قاع الأنبوب المخروطي إلى EME. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط. تجنب صنع الفقاعات.
  6. صفيحة 50 ميكرولتر من قباب EME في طبق 35 مم واحتضانها لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  7. أضف 2 مل من rIOM مع 10 ميكرومتر Y27632 و 10 ميكرومتر CHIR99021. قم بتغيير وسائط النمو كل 2-3 أيام. عند تغيير الوسائط ، يمكن حذف Y27632 و CHIR99021.

4. الحفظ بالتبريد وذوبان العضويات المعوية للفئران

  1. الحفظ بالتبريد الفئران العضوية المعوية
    ملاحظة: تم تعديل بروتوكول الحفظ بالتبريد من بروتوكول سابق للعضويات البشرية والفئران25. قبل التجميد ، يجب أن تحتوي الكائنات العضوية على مقطعين على الأقل في الثقافة الأولية. ينصح بزراعة المواد العضوية إلى درجة كروية كبيرة أو عضويات ناشئة قليلا قبل الحفظ بالتبريد ، لأن هذا سيؤدي إلى إنتاجية أعلى من الكائنات العضوية القابلة للحياة بعد الذوبان. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زيادة الوسائط المكيفة R-spondin إلى 15٪ و / أو عن طريق إضافة 10 mM nicotinamide (الجدول 3) إلى الثقافة العضوية.
    1. باستخدام المجهر ، احسب عدد المواد العضوية على طبق 35 مم. قم بتسمية cryovials بحيث يتم اقتباس 200 من الكائنات العضوية في كل cryovial.
    2. قم بإزالة rIOM من طبق 35 مم. استبدل ب 2 مل من برنامج تلفزيوني من درجة زراعة الأنسجة الباردة.
    3. باستخدام طرف P1000 ، حرر قباب EME من أسفل طبق الاستزراع إلى PBS عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. استمر في الماصة لأعلى ولأسفل ~ 20 مرة لتفتيت EME وإطلاق المواد العضوية. اجمع المواد العضوية و PBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    4. أضف 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد إلى طبق الاستزراع والماصة لأعلى ولأسفل لتحرير أي عضويات متبقية في برنامج تلفزيوني. انقل PBS إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    5. بيليه المواد العضوية عن طريق الطرد المركزي في 290 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية دون تعطيل الحبيبات العضوية.
    6. اغسل الحبيبات عن طريق تعليقها برفق في 5 مل من AdDMEM + البارد. أجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية.
    7. أعد تعليق الحبيبات العضوية في 1 مل من وسط التجميد البارد لكل 200 عضوي. القسمة 1 مل من المواد العضوية في وسط التجميد لكل cryovial وصفت. ضع الكريوفيال في وعاء تجميد.
    8. قم بتخزين المواد العضوية في حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ثم انقل الكريوفيال إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
  2. ذوبان عضويات معوية للفئران
    ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول سابق لإذابة العضويات المعوية البشرية والفأر26.
    1. قم بإذابة حصة 250 ميكرولتر من EME على الجليد. تحضير rIOM المكمل بوسائط مكيفة R-spondin بنسبة 15٪ ، و 10 ميكرومتر Y27632 ، و 10 ميكرومتر CHIR99021. يسخن عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 2 مل من وسط إزالة الجليد (الجدول 3) إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل في درجة حرارة الغرفة.
    3. استرجع وأذوب قارورة من المواد العضوية من النيتروجين السائل عن طريق وضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب القارورة بالكامل تقريبا.
    4. أضف 1 مل من وسط إزالة الجليد إلى القارورة وانقل جميع المحتويات إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط إزالة الجليد. اغسل القارورة مرتين ب 1 مل من وسط إزالة الجليد وانقلها إلى الأنبوب المخروطي.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق. نضح الوسائط ، وترك ~ 50 ميكرولتر من الوسط مع المواد العضوية. انقل الوسائط التي تحتوي على مواد عضوية إلى 250 ميكرولتر من EME.
    6. قم بتوزيع المواد العضوية بالتساوي من خلال EME عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وتجنب الفقاعات. ماصة ستة قباب سعة 50 ميكرولتر في طبق زراعة الأنسجة 35 مم.
    7. احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 15-20 دقيقة للسماح ل EME بالبلمرة. أضف 2 مل من rIOM المحضر إلى الطبق.
    8. بعد 2 أيام ، استبدل الوسائط ب rIOM. يمكن تعليق استخدام Y27632 و CHIR99021. قد يكون نمو الأعضاء بطيئا في الممر الأول بعد الذوبان. ينصح بمرور المواد العضوية مرتين بعد الذوبان قبل بدء التجارب.

5. توليد أحاديات 2D المعوية الفئران من المواد العضوية 3D

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي الأحجام المطلوبة لتوليد 24 بئرا من صفيحة 48 بئرا مطلية ب EME ، بدءا من ست قباب سعة 50 ميكرولتر (طبق 35 مم) تحتوي على ~ 300 عضوي / قبة معوية (مقياس: قبة واحدة تولد أربعة آبار) ، ولكن يمكن زيادتها أو خفضها حسب الحاجة. كما هو مكتوب ، يحقق هذا البروتوكول التقاء ~ 80٪ في 4-5 أيام. عند التقاء أعلى ، تبدأ الخلايا في الحصول على هياكل عضوية 3D مرة أخرى. عند التقاء منخفض (≤40٪) ، تظل الخلايا أحادية الطبقات وقابلة للحياة لمدة ~ 14 يوما. إذا كان الغرض من الدراسة هو استخدام طبقة أحادية 2D ، فقم بتقليص حجمها بحيث تولد قبة واحدة ثمانية آبار من صفيحة 24 بئرا. يمكن أيضا طلاء الآبار بالكولاجين I لتشكيل طبقة أحادية.

  1. تحضير الأسطح المطلية
    1. لطلاء اللوحة ب EME ، قم بتخفيف EME 1:20 في AdDMEM + البارد (الجدول 1). للطلاء بالكولاجين ، قم بإعداد الكولاجين الأول وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خفف 5 ملغ/مل من الكولاجين I في AdDMEM+ إلى 100 ميكروغرام/مل (1:50 في هذه الحالة).
    2. قم بتغطية اللوحة ب 200 ميكرولتر من EME المخفف أو الكولاجين لتغطية سطح البئر بالكامل. احتضان لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. تحضير الوسط العضوي المعوي للفئران للاستزراع أحادي الطبقة ثنائي الأبعاد (rIOM2D) كما هو موضح في الجدول 4.
  2. توليد أحادي الطبقات
    1. نضح الوسائط من لوحة 35 مم تحتوي على مواد عضوية. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. قم بتعطيل EME في الآبار عن طريق الخدش بطرف P1000. ماصة صعودا وهبوطا حوالي 20 مرة لتخفيف كل EME. نقل كل شيء إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. أضف 1 مل من PBS إلى لوحة 35 مم لاستعادة أي عضويات إضافية ونقلها إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 2 دقيقة ونضح الطاف، بما في ذلك بقايا EME. أضف 1 مل من محلول التربسين إلى الحبيبات العضوية واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    5. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات باستخدام طرف P1000 وإضافة 2 مل من AdDMEM + لتحييد التربسين.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأضف 4.8 مل من rIOM2D (الجدول 4). أعد تعليق بيليه الخلية.
    7. قبل وضع المواد العضوية ، أخرج أي EME أو كولاجين زائد في AdDMEM + من الآبار. ثم أضف 200 ميكرولتر من المواد العضوية في rIOM2D و 10 ميكرومتر Y27632 إلى كل بئر مغلف مسبقا.
    8. بعد 4-16 ساعة ، اجمع الوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وتخلص من الحبيبات.
    9. اغسل كل بئر ب 300 ميكرولتر من PBS وأضف 200 ميكرولتر من rIOM2D بالطرد المركزي إلى كل بئر. قم بتغيير rIOM2D كل 2-3 أيام ، مع تعليق استخدام Y27632.
  3. إصلاح المواد العضوية 3D من 2D أحادي الطبقات
    ملاحظة: يمكن حث الطبقات الأحادية المزروعة على EME لإصلاح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، في حين أن الطبقات الأحادية التي تزرع على الكولاجين لا تعود بكفاءة إلى المواد العضوية ثلاثية الأبعاد. عادة ، يمكن استخدام 2-3 آبار من المواد العضوية المتولدة من أحادي الطبقات لصنع قبة واحدة من 50 ميكرولتر من EME في اليوم الخامس.
    1. قم بتخفيف EME 1: 4 في rIOM2D. عندما تصل الطبقات الأحادية إلى التقاء ~ 80٪ ، قم باستنشاق الوسائط بعناية وإضافة 100 ميكرولتر من EME المخفف إلى الآبار التي تحتوي على طبقات أحادية.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من rIOM2D والعودة إلى حاضنة زراعة الأنسجة. سيتم إنشاء عضويات 3D في غضون 5 أيام من إضافة EME المخفف.
    3. بعد إصلاح المواد العضوية الصغيرة (~ اليوم 5) ، قم بإعداد rIOM. اجمع كل محتويات البئر ، وقم بسحبها لأعلى ولأسفل لتعطيل EME ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 2 دقيقة. نضح بقايا الطافية و EME.
    5. أضف 1 مل من AdDMEM + البارد وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 2 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية ، وترك ~ 50 ميكرولتر من الوسائط.
    6. انقل 50 ميكرولتر من الوسائط والمواد العضوية إلى قسمة EME سعة 250 ميكرولتر. ماصة صعودا وهبوطا لتوزيع المواد العضوية في جميع أنحاء EME.
    7. ماصة 50 ميكرولتر من قباب EME في طبق 35 مم واحتضانها لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة.
    8. أضف 2 مل من rIOM بالإضافة إلى 10 ميكرومتر Y27632. قم بتغيير وسائط النمو كل 2-3 أيام. عند تغيير الوسائط ، يمكن حذف Y27632.

6. التلاعب الجيني

  1. نقل عابر من 2D أحادي الطبقات
    تنبيه: تحضير أحاديات الظهارة المعوية للفئران باتباع القسم 5.1 في لوحة 48 بئرا. يجب إجراء النقل عند التقاء 70٪ -80٪. استبدل دائما الوسائط الموجودة في الآبار ب 200 ميكرولتر من rIOM2D الطازج قبل النقل. حساب نسب امتصاص 260/280 نانومتر و 260/230 نانومتر للحمض النووي البلازميد ؛ يجب أن تكون هذه أعلى من 1.8 لضمان نتائج نقل جيدة.
    ملاحظة: استخدم عنصر تحكم البلازميد لحساب كفاءة النقل. يوصى باستخدام البلازميد الذي يشفر بروتين الفلورسنت للسهولة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام pLJM1-EGFP27 .
    1. تحضير 1 ملغم / مل من 20 كيلو دالتون بولي إيثيلينيمين (PEI; الجدول 3). لكل بئر ، تحضير الأنبوب A (0.6 ميكروغرام من البلازميد + 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض) والأنبوب B (1.8 ميكرولتر من PEI + 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض). الحفاظ على نسبة الحمض النووي: PEI من 1: 3.
    2. دوامة كلا الأنابيب لمدة 30 ثانية. الجمع بين الأنبوب A والأنبوب B ، والدوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. إذا لزم الأمر ، استخدم جهاز طرد مركزي للدوران. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف بلطف مجمع DNA / PEI من حيث الإسقاط إلى طبقة أحادية 2D. حرك الطبق برفق لخلطه. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2. يمكن عادة اكتشاف التعبير بعد 24 ساعة.
      ملاحظة: إذا كان من الضروري العودة إلى الهياكل العضوية 3D ، فانتظر لمدة 48 ساعة بعد النقل لإضافة EME المخفف.
  2. نقل Lentiviral من العضويات المعوية الفئران
    ملاحظة: قبل العمل مع الفيروسات العدسية ، احصل على الإذن المناسب والتدريب المتخصص من المؤسسة. احرص دائما على ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع الفيروسات العدسية. على الرغم من عدم تحديده هنا ، فإن فيروس lentivirus عالي الجودة والمركز ضروري لنجاح عدوى المواد العضوية. استخدم هذا البروتوكول متجه pLJM1-EGFP فارغ27 للتعبير عن GFP القابل للذوبان. تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول تم نشره مسبقا28. تعتمد كفاءة النقل على جودة وتركيز الجسيمات الفيروسية ، والتفكك الفعال للعضويات إلى مجموعات خلايا صغيرة ، والجين الذي يتم التعبير عنه. عند حسابها بعد 5 أيام من الإصابة ، كان متوسط كفاءة النقل قبل الاختيار 19.4٪ (± 6.5٪ انحراف معياري).
    1. في يومين قبل الإصابة بالفيروس العدسي ، خطط لمرور (القسم 3) بئرين كثيفين من صفيحة 24 بئرا لكل فيروس عدسي سيتم تحويله. يمكن أن يستوعب كل بئر من صفيحة 24 بئرا قبة واحدة سعة 50 ميكرولتر من EME.
    2. بمجرد أن تصلب EME ، أضف 0.5 مل من rIOM المكمل ب 10 mM نيكوتيناميد و 10 μM Y27632 و 2.5 ميكرومتر CHIR99021. هذا يحفز مورفولوجيا كروية كبيرة ، وهو أمر موات لكفاءة نقل الفيروسات العدسية. في غضون 2 أيام من الطلاء ، يجب أن تكون الكائنات العضوية الفئران كروية كبيرة. إذا لوحظ تمايز كبير (أي مهدها) ، فقم بإعادة مرور المواد العضوية.
    3. ذوبان الفيروس المركز على الجليد. تحضير وسائط نقل جديدة ، وفقا للجدول 3.
    4. باستخدام طرف P1000 ، حرر قباب EME من أسفل طبق زراعة الخلايا في الوسائط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. استمر في الماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة لتفتيت EME وإطلاق المواد العضوية.
    5. ماصة المواد العضوية والوسائط في أنبوب مخروطي 15 مل. يمكن تجميع جميع الآبار معا ، بشرط أن يكون للعضويات نفس النمط الجيني وأن تكون من نفس السلالة.
    6. اغسل كل بئر مرتين باستخدام 1 مل من AdDMEM + البارد. اجمع AdDMEM + وانقله إلى نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    7. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، قم بتعطيل عضويات الفئران ميكانيكيا. هذه خطوة حاسمة ، لأن الهدف هو مجموعات صغيرة متعددة الخلايا من الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا ~ 30 مرة. تحقق من كفاءة الاضطراب تحت المجهر باستخدام هدف 4x. استمر في هذه العملية حتى يتكون تعليق الخلية بشكل أساسي من مجموعات الخلايا مع بقاء عدد قليل من الكائنات العضوية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن طرد المواد العضوية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة المادة الطافية بعناية ، وإعادة تعليقها في 1 مل من الإنزيم المؤتلف لتحل محل التربسين / EDTA التقليدي ، مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. احتضان المواد العضوية في بديل التربسين لمدة 2 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع دوامة منتظمة لتعزيز التفكك. تجنب الحضانة لفترات طويلة مع استبدال التربسين ، لأن هذا يمكن أن يعزز موت الخلايا. تحقق بانتظام من كفاءة الاضطراب تحت المجهر باستخدام هدف 4x. عندما يتكون التعليق من خلايا مفردة بشكل أساسي مع عدد قليل من مزارع الخلايا ، قم بتخفيف بديل التربسين بإضافة 4 مل من AdDMEM + وتابع الخطوة التالية.
    8. أدر الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على مجموعات الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية.
    9. إعادة تعليق مجموعات الخلايا في 230 ميكرولتر من وسط النقل لكل بئر مصاب. للعدوى ، استخدم بئرا واحدا من صفيحة 48 بئرا لكل فيروس عدسي.
    10. لوحة 230 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 48 بئر موسومة. أضف 20 ميكرولتر من الفيروس المركز إلى كل بئر. استخدم طرف P1000 لخلط محلول الفيروس / الخلية في كل بئر وختم اللوحة بغشاء شفاف.
    11. أداء spinoculation: الطرد المركزي لوحة في 600 × غرام لمدة 1 ساعة في 32 درجة مئوية. قم بفك اللوح واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 6 ساعات.
    12. سخن صفيحة 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
    13. بعد الحضانة ، ماصة كل بئر صعودا وهبوطا ونقل المحتويات إلى أنبوب المسمى 1.5 مل. اغسل كل بئر ب 750 ميكرولتر من AdDMEM + وانقله إلى الأنبوب. أدر الأنابيب عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    14. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي وتخزينها على الجليد. استخدم طرف P1000 لإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها بشكل صحيح.
    15. أعد تعليق حبيبات الخلية في EME وقباب اللوحة 50 ميكرولتر في اللوحة المسخنة مسبقا المكونة من 24 بئرا. احتضان لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يتم بلمرة EMA.
    16. لكل بئر ، أضف 500 ميكرولتر من rIOM المكمل ب 10 mM نيكوتيناميد ، 10 ميكرومتر Y27632 ، و 2.5 ميكرومتر CHIR99021.
    17. استبدل الوسائط ب rIOM plus 10 μM Y27632 بعد يوم واحد من الإصابة. قم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام. إذا تم إجراء الاختيار ، أضف التحديد بعد 48-72 ساعة من الإصابة. لاختيار بوروميسين ، استخدم 2 ميكروغرام / مل بوروميسين.

7. التألق المناعي تلطيخ جبل كامل من المواد العضوية

  1. نضح الوسائط وإضافة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS-Tween 20 (PBS-T) (الجدول 3) إلى المواد العضوية في طبق زراعة الخلايا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. حرر المواد العضوية من EME عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. اجمع الكائنات العضوية في أنبوب سعة 0.75 mL. سوف تستقر الكائنات العضوية في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية في غضون بضع دقائق. إذا لزم الأمر ، أجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة.
  3. باستخدام ماصة نقل ، قم بإزالة PFA وأعد تعليق المواد العضوية في PBS-T. دع المواد العضوية تستقر في قاع الأنبوب. قم بإزالة PBS-T وأعد التعليق في 200 ميكرولتر من محلول الكتلة (الجدول 3).
  4. احتضان في درجة حرارة الغرفة على الروك أو nutator لمدة 45 دقيقة. يمكن أن تتكتل المواد العضوية وتستقر في قاع الأنبوب. حرك الأنبوب بالإصبع بشكل دوري لإعادة تعليقه وتفريقه في جميع أنحاء المحلول.
  5. دع المواد العضوية تستقر في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر ، أجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة حل الكتلة.
  6. أضف الجسم المضاد الأولي المخفف في 100 ميكرولتر من محلول الكتلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة على خلاط nutating لمدة 45 دقيقة في 24 دورة في الدقيقة. تختلف تركيزات الأجسام المضادة اعتمادا على الجسم المضاد المستخدم.
    ملاحظة: يمكن تمديد هذه الخطوة بناء على الجسم المضاد الأساسي ، حتى ليلة واحدة عند 4 درجات مئوية.
  7. دع المواد العضوية تستقر في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر ، أجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة.
  8. اغسل في PBS-T خمس مرات باستخدام ماصة نقل. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على خلاط nutating في 24 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  9. أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 200 و 50 ميكروغرام / مل 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) المخفف في 100 ميكرولتر من محلول الكتلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة على خلاط nutating لمدة 30 دقيقة في 24 دورة في الدقيقة.
  10. دع المواد العضوية تستقر في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر ، أجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة الأجسام المضادة الثانوية. اغسل خمس مرات في PBS-T باستخدام ماصة نقل.
  11. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على خلاط nutating في 24 دورة في الدقيقة. كرر خطوة الغسيل مرتين.
  12. أثناء غسل المواد العضوية ، قم بتسخين حصة من مانع التسرب VALAP (الجدول 3) عند 40-50 درجة مئوية لتسييلها. باستخدام فرشاة الرسم ، قم بطلاء مربع رفيع من VALAP على شريحة مجهرية بحجم شريحة الغطاء تقريبا. استخدم غطاء 22 مم × 22 مم رقم 1.5.
  13. باستخدام المقص ، قم بقص نهاية طرف ماصة P200. نقل المواد العضوية إلى بئر VALAP على الشريحة. باستخدام مناديل مبللة ، قم بإزالة PBS-T بعناية. لا تدع المواد العضوية تجف.
  14. قم بإغراق بئر VALAP بوسط تثبيت مضاد للتلاشي (الجدول 3). بالنسبة لمربع ~ 22 مم × 22 مم ، سيتطلب ذلك 100-150 ميكرولتر من مضاد التلاشي.
  15. يمكن أن تتجمع المواد العضوية. قم بتدوير مانع التلاشي بطرف ماصة لإعادة توزيع المواد العضوية ، إذا لزم الأمر. قم بالتركيب بغطاء 22 مم × 22 مم رقم 1.5 ، وتجنب فقاعات الهواء. أغلق غطاء الغطاء عن طريق طلاء طبقة رقيقة من VALAP على الحواف.
    ملاحظة: بالنسبة للمجاهر المقلوبة ، يمكن أيضا تركيب المواد العضوية في طبق زجاجي 35 مم.

8. تورم فورسكولين الناجم عن عضويات معوية الفئران

  1. تنمو المواد العضوية لمدة 3-5 أيام بعد المرور في rIOM. ينصح بزراعة المواد العضوية في صفيحة مكونة من 24 بئرا لضمان إمكانية إعادة تصوير نفس المنطقة بسهولة. التقاط الصور قبل إضافة فورسكولين (T0).
  2. أضف فورسكولين (الجدول 3) مباشرة إلى الوسائط العضوية إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. أضف نفس الحجم من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى آبار التحكم.
  3. تخيل الآبار الضابطة والمعالجة بفورسكولين على فترات منتظمة ، كل 15-30 دقيقة. عندما لا تقوم بالتصوير ، احتفظ بالمواد العضوية في الحاضنة أو استخدم نظام تصوير متحكم فيه مع الحضانة. يجب ملاحظة الحد الأقصى للتورم لمدة 120 دقيقة.
  4. اتبع البروتوكولات القياسية لحساب التورم النسبي من الصور المكتسبة29.

Representative Results

تم إنشاء عضويات الاثني عشر والصائم للفئران باستخدام البروتوكول المبين في القسم 2. من المهم جدا أثناء خطوات عزل القبو أن يتم استنفاد الزغابات بكفاءة من PBS. إذا تم طلاء الكثير من الزغب في EME بالخبايا ، فقد يتسبب ذلك في موت الثقافة بأكملها والفشل في إنشاء خط عضوي. لهذا السبب ، من المفيد عزل الخبايا تحت نطاق تشريح ، مما يسمح بتأكيد مرئي لنضوب الشرير. يصور الشكل 1 شظايا وخبايا فيلار تمثيلية (الشكل 1 أ). لاحظ الحجم الأصغر بكثير للخبايا مقارنة بالزغابات (الشكل 1 ب). بعد الطلاء ، ستتوسع الخبايا إلى كرويات خلال الأيام القليلة القادمة وستبدأ في التبرعم والتمايز بحلول اليوم 4-7 (الشكل 2). بمجرد أن تصل المواد العضوية إلى مرحلة مهدة على نطاق واسع ، يجب تمريرها. أثناء المرور ، من المهم تعطيل المواد العضوية بما يكفي لتقسيم براعم القبو ، بحيث يمكن توسيع أعداد الأعضاء (الشكل 3 ب).

يعتمد الاسترداد الناجح للعضويات بعد التجميد بشكل كبير على الحالة التي يتم تجميدها فيها. تتعافى المواد العضوية في حالة غير متمايزة تكاثرية للغاية بأعلى كفاءة. لذلك ، نوصي بحثها على أن تكون كروية وكيسية بدلا من مهدها ومتباينة. لتحقيق ذلك ، يمكن تنشيط Wnt بشكل مفرط عن طريق زيادة كمية Wnt ligand R-spondin في الوسائط وعن طريق تضمين نيكوتيناميد في الوسائط ، والذي ثبت أنه يدعم تكوين الأعضاء وبقاء الخلايا في العديد من أنظمة الاستزراع30,31. يوضح الشكل 3 أ ثقافة عضوية صحية بعد يومين فقط من الذوبان. ساعد تضمين BSA في وسائل الإعلام أثناء ذوبان الجليد أيضا في بقاء الثقافات العضوية المعوية للفئران ، والتي أثبتت أنها أكثر حساسية من الكائنات العضوية المعوية للفئران.

في حين أن ثقافة 3D العضوية غالبا ما تكون مفضلة لأنها تلخص بعض البنية المعوية الطبيعية ، إلا أنها تجعل الأساليب الأخرى ، بما في ذلك التصوير الحي ، والنقل ، وعمليات النقل الفيروسية ، أكثر تحديا من الناحية الفنية. يسمح استخدام أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد المتولدة من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد32 (الشكل 4) بإدخال البلازميدات بكفاءة أعلى. في حين أن المواد العضوية المعوية 3D مقاومة تقليديا لعمليات النقل العابرة ، يمكن إدخال ترميز البلازميدات ل EGFP بنجاح باستخدام طرق النقل القائمة على الدهون. تم تحديد النهج الأكثر فعالية من حيث التكلفة باستخدام PEI في الخطوة 6.1 (الشكل 5) ، ولكن التثقيب الكهربائي وكواشف النقل المتاحة تجاريا أسفرت أيضا عن نتائج قابلة للمقارنة (البيانات غير معروضة). ستركز الدراسات المستقبلية على ما إذا كان يمكن استخدام هذه الأساليب لإدخال تركيبات كريسبر في طبقة أحادية.

كان من المهم أن تكون قادرا على إصلاح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد من أحاديات الطبقات 2D بعد النقل بحيث يمكن الحفاظ عليها كخط قابل للمرور مع المكونات المعمارية ثلاثية الأبعاد للأقبايا. ومن المثير للاهتمام ، أن أحاديات الطبقات 2D المطلية على EME تم إصلاحها بسهولة إلى كرويات صغيرة عندما تمت إضافة EME مرة أخرى إلى الجزء العلوي من الخلايا ، في حين أن ركيزة الكولاجين I لم تكن كافية لإصلاح هياكل 3D (الشكل 6).

في حين أن عمليات النقل العابرة مفيدة للعديد من الدراسات ، فإن تكوين خطوط مستقرة غالبا ما يكون أكثر فائدة ، مما يتطلب إدخال فيروس lentivirus في الخلايا. أصيبت عضويات معوية الفئران بفيروس lentivirus عن طريق تعديل البروتوكولات المنشورة سابقا (الشكل 7). الخطوة الرئيسية في البروتوكول هي تعطيل المواد العضوية إلى مجاميع صغيرة أو مجموعات خلوية. إذا لم يتم تعطيل الثقافات بكفاءة وظلت الكائنات العضوية سليمة ، فلن تدخل جزيئات الفيروسات العدسية إلى الخلايا. بعد الإصابة ، يجب أن تتعافى الكائنات العضوية وتنمو. يسمح البروتوكول الموضح هنا بامتصاص الجسيمات الفيروسية بنسبة 10٪ -48٪ (يعني: 19.4٪ ± 6.5٪) من الخلايا قبل الاختيار.

يمكن أن يكون تلطيخ الجسم الكامل للعضويات أمرا صعبا بسبب الإزالة غير الكاملة لبقايا EME أو اختراق الأجسام المضادة غير الكامل. يسمح البروتوكول الموضح هنا بتلطيخ قوي للمواد العضوية. يمكن أن يكون تصور المواد العضوية على المجهر متحد البؤر صعبا أيضا إذا كانت بعيدة جدا عن غطاء الغطاء. باستخدام VALAP ، يتم إنشاء بئر مع بعض الارتفاع بحيث لا يتم سحق المواد العضوية بواسطة غطاء الغطاء ، ولكن لا يزال يسمح لها بالاستقرار بالقرب من غطاء الغطاء لسهولة التصوير. يوضح الشكل 8 تلطيخا تمثيليا ضد منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي لقناة الأنيون القمية (CFTR) والقضيب لتسمية F-actin.

أخيرا ، المواد العضوية لها فائدة في المقايسات الوظيفية. تم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض من مرضى التليف الكيسي لفحص وظيفة CFTR ، حيث أن العلاج باستخدام فورسكولين ناهض cAMP يؤدي إلى إفراز سائل قوي بوساطة CFTR ، مما يسبب تورم عضوي29،33-37. كان أحد أهداف هذا العمل هو تحديد وتطوير نموذج عضوي يمكن استخدامه بالتوازي مع الدراسات قبل السريرية في الجسم الحي. لذلك ، كنا نهدف إلى تحديد ما إذا كانت الكائنات العضوية المعوية للفئران تخضع للتورم الناجم عن فورسكولين. في الواقع ، في غضون 30 دقيقة من علاج فورسكولين ، تضخمت عضويات الفئران ، مع تأثير أقصى لوحظ لمدة 120 دقيقة (الشكل 9).

Figure 1
الشكل 1: شظايا فيلار وخباياها أثناء العزل الطلائي . (أ) صورة تمثيلية لشظايا فيلار في محلول EDTA أثناء بروتوكول عزل التشفير. رؤوس الأسهم الصفراء علامة شظايا فيلار. تصور الأسهم الحمراء خبايا متصلة بجزء من الشرير. لاحظ الفرق في الأحجام النسبية. (ب) صورة تكبير أعلى لسرداب واحد (سهم أحمر) بحيث يمكن تصور التشكل. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تطور العضو العضوي المعوي للفئران. تم طلاء خبايا الصائم الفئران في EME مباشرة بعد العزل (A ، B). في غضون 2 أيام ، أصبحت الخبايا كروية (C ، D). بحلول اليوم 5 ، بدأوا في بدء براعم التشفير (E ، F) ، والتي تطورت ونمت بحلول اليوم 7 (G). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: العضويات بعد الذوبان والتمرير. (أ) تم إذابة عضويات الفئران الصائمية باتباع البروتوكولات الموضحة بعد الحفظ بالتبريد. لاحظ وجود كل من الكائنات الكروية والعضوية البراعم بعد 2 أيام فقط من ذوبان الجليد. (ب) نفس الخط العضوي الموضح في A مباشرة بعد المرور باتباع البروتوكول المحدد. لاحظ فرق الحجم النسبي بين الهياكل في A و B ووجود مجالات واحدة تشبه التشفير في B. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تشكيل أحادي الطبقة 2D من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد. (A-C) تقدم أحادي الطبقة 2D على EME. (D-F) تقدم أحادي الطبقة 2D على الكولاجين I. بحلول اليوم 5 ، أسفرت كل حالة ~ 80٪ التقاء. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الانتقال العابر لطبقة أحادية 2D. صورة تمثيلية لطبقة أحادية ثنائية الأبعاد نمت على EME تم نقلها بشكل عابر باستخدام بلازميد pLJM1-EGFP باستخدام PEI. (أ) برايتفيلد، (ب) التألق (GFP)، (ج) التراكب. يشير الخط الأحمر المنقط إلى حد الطبقة الأحادية. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: إصلاح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد من أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد على EME. (أ) تكوين عضويات ثلاثية الأبعاد من طبقات أحادية ثنائية الأبعاد نمت في EME. تتشكل المواد العضوية بكفاءة بعد 5 أيام من إضافة EME إلى السطح القمي للطبقة الأحادية. لاحظ وفرة الخلايا الميتة المحيطة كرويات 3D الصغيرة. (ب) استمرار أحادي الطبقات ثنائي الأبعاد بعد 5 أيام من إضافة الكولاجين I إلى السطح القمي للطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد المزروعة على الكولاجين I. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: عدوى Lentiviral من المواد العضوية 3D. أصيبت عضويات الفئران الصائمية بجزيئات GFP النووية عدسية باستخدام البروتوكول المحدد. بعد الشفاء والنمو لمدة 5 أيام ، تم إصلاح المواد العضوية وتلطيخها باستخدام DAPI. (أ) DAPI: رمادي؛ GFP النووية: أخضر. (ب) GFP النووية: أخضر. يشير الخط الأحمر المنقط إلى الحدود العضوية. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: التألق المناعي الكامل للعضويات المعوية للفئران. (أ) CFTR ، (ب) القضيب ، و (ج) دمج التألق المناعي الكامل للعضويات الصائمية للفئران. لاحظ الإثراء القمي لتلطيخ CFTR في المواد العضوية (الرمادي في A ، الأرجواني في C). يشير Phalloidin إلى F- actin ويسمي بشكل بارز حدود الفرشاة القمية (رمادي في B ، سماوي في C). قضبان المقياس: 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تنتفخ عضويات معوية الفئران عند تحفيز فورسكولين. دورة زمنية تمثيلية لتورم عضوي معوي للفئران بعد إضافة فورسكولين ناهض cAMP. يمثل الوقت 0 دقيقة النقطة الزمنية مباشرة قبل إضافة 10 ميكرومتر فورسكولين. تظهر الصور نفس العضو العضوي على فترات زمنية 30 دقيقة. لوحظ أقصى تورم في 120 دقيقة بعد إضافة فورسكولين. يحدد الخط الأحمر المنقط الحدود العضوية. تتكون المادة المظلمة في منتصف التجويف العضوي من خلايا ميتة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: وصفة AdDMEM +. المكونات اللازمة لجعل وسائط AdDMEM + القياسية ، وهي الوسائط الأساسية عبر الطرق الموضحة هنا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: وصفة الوسائط العضوية المعوية للفئران (rIOM). وصفة مفصلة للوسائط العضوية المعوية القياسية للفئران ، بما في ذلك ظروف المذيبات والتخزين للبروتينات المؤتلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: الحلول. وصفات وتعليمات لعمل حلول أخرى مستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4. وسط عضوي معوي للفئران لثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (rIOM2D). وصفة معدلة من وسائط الثقافة العضوية الأمثل للنمو 2D من أحادي الطبقات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يحافظ تطوير نموذج عضوي معوي للفئران على الخصائص الوظيفية المهمة الموجودة في العضو في الجسم الحي وهو أداة واعدة للاختبار قبل السريري وفحص الأدوية والمقايسات الوظيفية. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر بالتوازي مع دراسات أمراض الجهاز الهضمي قبل السريرية في الجسم الحي ، والتي غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا لها بسبب حجمها المعوي الأكبر ، والجوانب الفسيولوجية المشتركة مع البشر ، وفي بعض الحالات تكون نماذج مرض أفضل38. هنا ، تم تحديد بروتوكول قوي خطوة بخطوة لعزل الخبايا المعوية للفئران ، وتوليد وثقافة طويلة الأجل من عضويات معوية الفئران ، بالإضافة إلى تطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات تورم فورسكولين الوظيفية ، وتألق مناعي كامل ، وثقافة أحادية الطبقة 2D ، والتلاعب الجيني للفيروسات العدسية. من المحتمل أن تكون العضويات المعوية للفئران ذات صلة في العديد من سياقات المرض حيث تكون الفيزيولوجيا المرضية لنماذج الفئران غير مناسبة وقد توفر نموذجا أفضل لفسيولوجيا الأمعاء البشرية مقارنة بالعضوية المعوية للفئران.

لإنشاء ثقافات عضوية طويلة العمر يمكن تمريرها وتوسيعها ، من الضروري تحديد عوامل النمو الرئيسية المطلوبة للحفاظ على الانتشار الظهاري المعوي. غالبا ما تزرع عضويات الفأر في كوكتيل بسيط من EGF و R-spondin و Noggin ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن Noggin ليس ضروريا لثقافة الأعضاء المعوية39. يمكن أن تحل الوسائط المكيفة محل عوامل النمو المؤتلفة وخطوط الخلايا الأكثر استخداما هي L-WRN ، والتي تفرز Wnt3a و Rspondin-3 و Noggin39 و L-Wnt3a و HA-Rspondin1-Fc 293Tالخلايا 40. الوسائط المكيفة L-WRN كافية لدعم ليس فقط نمو الفئرانالمعوية 39 العضوية ، ولكن نمو الكائنات العضوية المعوية من العديد من المزرعة والحيوانات المصاحبة ، بما في ذلك الكلاب والقطط والدجاج والخيول والأبقار والأغنام والخنازير12. ومع ذلك ، فإن الكائنات العضوية المعوية البشرية تختلف اختلافا كبيرا في متطلبات عامل النمو ، لأنها تتطلب تركيبات وسائط متميزة لمرحلة نموها التوسعي (أي التقدم من كرويات صغيرة إلى كبيرة) مقابل مرحلة تمايزها (أي توليد ونضج أنواع الخلايا المتمايزة)10. تعكس المتطلبات الإعلامية للعضويات المعوية للفئران عن كثب تلك الخاصة بوسائط النمو التوسعية للعضويات المعوية البشرية ، ومع ذلك ، على وجه الخصوص ، فإن عضويات الفئران قادرة على النمو والتمايز في هذه البيئة الإعلامية ، مما يبسط إلى حد كبير متطلبات الاستزراع الخاصة بهم. بينما ركزت محاولاتنا الأولية على إنشاء وتنمية عضويات معوية للفئران في وسائط مكيفة L-WRN ، كانت الثقافة طويلة المدى ضعيفة ، وعانت خطوط الأعضاء المعوية في الفئران من نقص المتانة (البيانات غير معروضة). قد يكون هذا بسبب تصميم خطوط خلايا L-WRN لإفراز R-spondin 3 ، بينما تم تصميم خط الخلايا 293T-Rspo1 الموصى به هنا لإفراز R-spondin 1. من الممكن أن تفضل الفئران والكائنات العضوية البشرية R-spondin 1 ، مما قد يفسر فشل خطوط الفئران العضوية في الوسائط المشروطة L-WRN.

لتلخيص الإعداد في الجسم الحي عن كثب ، من المهم تطوير ظروف الثقافة العضوية التي تسمح ببقاء الخلايا الجذعية وصيانتها وتكاثرها ، والتي يمكن أن تحافظ على دوران الخلايا وأحداث التمايز المتزامنة إلى أنواع خلايا منفصلة. لذلك ، يجب معايرة تركيزات البروتينات و / أو البروتينات المؤتلفة في الوسائط المكيفة بإحكام والتحكم فيها لتحقيق هذا التوازن المثالي. على وجه الخصوص ، تعد مستويات Wnt المثلى ضرورية لتجنب فقدان الثقافات العضوية المعوية. القليل جدا من Wnt في الوسائط المكيفة لن يكون قادرا على دعم النمو ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا الجذعية والموت العضوي اللاحق ؛ سيؤدي الإفراط في تنشيط Wnt إلى أن تكون المواد العضوية كيسي وغير متمايزة10. على الرغم من عدم تفصيلها هنا ، يوصى بشدة باختبار كل دفعة من الوسائط المكيفة L-Wnt3a و 293T-Rspo1 باستخدام مقايسة لوسيفيراز مراسل Wnt ، مثل خط خلية Topflash41. وقد وصفت الدراسات السابقة أن الدفعة المثلى من وسائط L-Wnt3a يجب أن تؤدي إلى زيادة الإشارة بمقدار 15 ضعفا عند 12.5٪ وزيادة الإشارة بمقدار 300 ضعف عند 50٪ ، مقارنة ب 1٪ L-Wnt3a10. نظرا لأن عضويات الفئران أكثر حساسية من عضويات الفئران لمتطلبات الاستزراع ، وخاصة مستويات تنشيط Wnt ، فإن خطوات مراقبة الجودة الإضافية هذه تساعد بشكل كبير في تسهيل متانة وموثوقية مزارع الفئران العضوية. نظرا لعدم توفر خط مراسل مماثل لاختبار نشاط Bmp وتركيزات Noggin النسبية في وسائط Noggin المكيفة ، فمن المستحسن استخدام Noggin المؤتلف عندما يكون ذلك ممكنا للتحكم بدقة في مستويات Noggin. في حين يمكن زراعة العضويات المعوية للفأر والحفاظ عليها في غياب Noggin39 ، لم تتم محاولة ذلك لمزارع الأعضاء المعوية للفئران.

بالإضافة إلى متطلبات زراعة الخلايا ، يعتمد الإنشاء الأولي الناجح لخط عضوي للفئران بشكل حاسم على الاستنفاد الفعال للزغابات المتمايزة أثناء عزل السرداب. تتسبب المستويات العالية من تلوث فيلار في موت القبو ، ويفترض أنه إما بسبب إشارات من الخلايا المحتضرة أو عزل العوامل الأساسية. لاستنفاد هذه الزغابات المتمايزة من المستحضرات الظهارية بدقة وثبات ، يوصى بإجراء عزلات ظهارية بمساعدة مجسم. يوفر الفحص البصري للظهارة التي يتم إطلاقها إشارة واضحة عند التخلص من PBS واستبداله (الشكل 1). لا ينبغي جمع الخبايا حتى يكون هناك استنفاد كاف للزغب. يتم تمييز خلايا فيلار بشكل نهائي ولا يمكنها توليد عضويات في الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب المرور اللاحق للعضويات المعوية للفئران واستخدامها لأي تطبيق نهائي رعاية دقيقة. تؤدي الحضانة في كواشف التفكك لفترات زمنية أطول (10 دقائق) إلى موت كبير للخلايا وفقدان الخط العضوي.

هنا ، يتم وصف بروتوكول بسيط وسريع لتوليد أحاديات الأمعاء من عضويات الفئران. ركائز EME والكولاجين I لها تأثيرات مختلفة على الظهارة ، والتي يمكن الاستفادة منها اعتمادا على الغرض من الدراسة. يسمح EME بالالتصاق السريع والفعال للخلايا المفردة وتشكيل نتوءات الخلايا. في المقابل ، فإن طلاء السطح بالكولاجين يؤخر هذه العمليات. بمجرد أن تصل الطبقة الأحادية إلى التقاء 80٪ تقريبا ، تبدأ الخلايا المزروعة على EME في توليد هياكل عضوية 3D مرة أخرى. ومع ذلك ، فإنها تفتقر إلى الدعم المادي والكيميائي الكافي لمواصلة النمو. يمكن منع هذا الارتداد إلى الحالة العضوية عن طريق الحفاظ على أحادي الطبقات في EME عند التقاء 50٪ -80٪. إن إضافة EME المخفف إلى السطح القمي للطبقات الأحادية يعزز الانتعاش السريع وتشكيل المواد العضوية دي نوفو ، مما يولد مناطق التقارب بسرعة وسهولة أكبر. على سطح الكولاجين الأول ، يمكن للخلايا أن تشكل طبقة أحادية موحدة وتولد مجموعات صغيرة. ومع ذلك ، فإن إضافة الكولاجين الأول فوق الطبقات الأحادية لا يكفي للحث على تكوين عضوي. يجب تخفيف EME عند الإضافة إلى سطح الطبقة الأحادية ، حيث ستكون هناك مقاومة ميكانيكية أقوى للتغلب على العضو الناشئ. ومع ذلك ، فإن هذا EME المخفف لا يسمح بتكوين قوي للعضويات الكبيرة. يجب إزالة أي عضويات فئران تم إنشاؤها من جديد تنفصل بشكل طبيعي عن السطح على الفور ونقلها إلى EME غير المخفف حتى يمكن استعادة الدعم الهيكلي والنمو. نظرا لصغر حجم المواد العضوية في هذه الخطوة ، لا ينصح بمرور المواد العضوية حتى يتم إنشاء نمو قوي. الأهمية البيولوجية الكامنة وراء سبب قدرة EME على دعم إصلاح المواد العضوية ، ولكن ما إذا كان الكولاجين يمكنني القيام بذلك أم لا ، ليس واضحا. ومع ذلك ، كانت هناك تقارير تفيد بأن الخلايا المزروعة في الكولاجين ثلاثي الأبعاد لا يمكنها تكوين عضويات ناشئة42,43 أو دعم الصيانة طويلة الأجل. منتجات EME المتاحة تجاريا هي مخاليط غير متجانسة من البروتينات خارج الخلية ، في المقام الأول اللامينين والكولاجين IV44. ومن ثم، فإن التركيب المميز للبروتينات وقدرة الخلية الطلائية على التعامل مع المصفوفة خارج الخلية باستخدام معقدات خلوية مختلفة يمكن أن يسمح بإعادة البناء في EME ولكن ليس الكولاجين الأول. لم يتم اختبار ما إذا كان يمكن وضع أحاديات الطبقات المشتقة من الكولاجين I في EME لدعم تكوين الأعضاء ونموها.

يتم وصف التلاعب الجيني لنموذج العضو العضوي المعوي للفئران هنا ، ويتم تحديد بروتوكولات نقل lentiviral من organoids 3D والنقل العابر للطبقات أحادية 2D. للتغلب على الكفاءة المنخفضة لنقل العضوي lentiviral ، تم تطوير بروتوكول للانتقال العابر للطبقات أحادية 2D. يوفر التشكل المسطح والمجالات القمية المكشوفة للطبقات الأحادية وصولا أسهل إلى الفيروسات والمجمعات المحتوية على الحمض النووي. تم استخدام تعبير مراسل EGFP باستخدام ناقل pLJM1-EGFP للتحقق من صحة هذه التقنية. لوحظ تعبير مراسل GFP بعد 24 ساعة ، وتم الحفاظ عليه لمدة 5-6 أيام في طبقة أحادية. من المرجح أن يكون للدراسات المستقبلية التي تركز على نقل الفيروسات العدسية للطبقات الأحادية كفاءة أعلى من نقل العضوي 3D. باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه ، يمكن إصلاح المواد العضوية 3D من أحادي الطبقات 2D المصابة لتسهيل إنشاء خطوط مستقرة. بحذر ، يمكن الحفاظ على خطوط الكائنات العضوية المعوية للفئران بنجاح لأكثر من عام ، وتبقى مستقرة على مدار العديد من الممرات ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها بنجاح ، وتعديلها وراثيا باستخدام نقل الفيروسات العدسية ، وبالتالي تلبية الحاجة إلى نموذج عضوي معوي يمكن الوصول إليه وقابل للتتبع في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبري سوميغراي وأمين على مناقشاتهم المدروسة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة تشارلز إتش هود لصحة الطفل ومنحة مؤسسة التليف الكيسي (004741P222) إلى KS والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة إلى NA بموجب الجائزة رقم 2R01DK077065-12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-D Culture Matrix Rat Collagen I Cultrex/R&D Systems 3447-020-01
70 µm cell strainer Corning/Falcon 352350
Advanced DMEM/F12 Gibco/Thermo Fisher 12634010
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher 17504044
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
CryoStor Stem Cell Technologies 100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells R & D Systems 3710-001-01
FBS Gibco/Thermo Fisher 16-000-044
Gastrin I (human) Sigma Aldrich G9145
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 100-0485
Glutamax Thermo Fisher 35-050-061
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free Corning 356231
HEPES AmericanBio AB06021
Lanolin Beantown Chemical 144255-250G
L-glutamine Gibco/Thermo Fisher A2916801
L-Wnt3a cells ATCC CRL-2647
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher 17502-048
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165-5G
Nicotinamide  Sigma Aldrich N0636
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco/Thermo Fisher 31985070
Paraffin Fisher Scientific P31-500
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
PBS Thermo Fisher 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco/Thermo Fisher 15140122
pLJM1-EGFP Addgene 19319
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) Sigma Aldrich 764965
p-phenylenediamine  Acros Organics/Thermo Fisher 417481000
Puromycin VWR J593-25mg
Recombinant human FGF2 protein Peprotech 100-18B-250ug
Recombinant human IGF-1 protein Biolegend B356441
Recombinant human Noggin protein R & D Systems 6057-NG-100
Recombinant mouse EGF protein Thermo Fisher PMG8041
Sprague Dawley rat Charles River Laboratories Strain 001
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
TrypLE Express Enzyme Gibco/Thermo Fisher 12604013
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023).
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023).
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 196،
توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen,… More

Zagoren, E., Santos, A. K., Ameen, N. A., Sumigray, K. Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (196), e65343, doi:10.3791/65343 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter