Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Helmonteret fluorescens in situ-hybridisering for at studere spermatogenese i Anopheles-myggen

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65356
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech
* These authors contributed equally

Summary

I betragtning af deres enkle anatomi tilbyder Anopheles testikler en god cytologisk model til undersøgelse af spermatogenese. Denne protokol beskriver helmonteret fluorescens in situ-hybridisering , en teknik, der bruges til at undersøge denne biologiske proces, samt fænotypen af transgene stammer, der huser mutationer i de gener, der er involveret i sædproduktionen.

Abstract

Spermatogenese er en kompleks biologisk proces, hvor diploide celler gennemgår successiv mitotisk og meiotisk opdeling efterfulgt af store strukturelle ændringer til dannelse af haploide spermatozoer. Ud over det biologiske aspekt er undersøgelse af spermatogenese af afgørende betydning for forståelse og udvikling af genetiske teknologier såsom gendrev og syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, som ved at ændre henholdsvis Mendelsk arv og sædkønsforholdet kan bruges til at kontrollere skadedyrsinsektpopulationer. Disse teknologier har vist sig at være meget lovende i laboratorieindstillinger og kan potentielt bruges til at kontrollere vilde populationer af Anopheles myg, som er vektorer af malaria. På grund af testiklernes anatomiske enkelhed og deres medicinske betydning repræsenterer Anopheles gambiae, en vigtig malariavektor i Afrika syd for Sahara, en god cytologisk model til undersøgelse af spermatogenese. Denne protokol beskriver, hvordan helmonteret fluorescens in situ hybridisering (WFISH) kan bruges til at studere de dramatiske ændringer i cellekernestruktur gennem spermatogenese ved hjælp af fluorescerende sonder, der specifikt pletter X- og Y-kromosomerne. FISH kræver normalt forstyrrelse af reproduktive organer for at udsætte mitotiske eller meiotiske kromosomer og tillade farvning af specifikke genomiske regioner med fluorescerende sonder. WFISH muliggør bevarelse af testiklernes oprindelige cytologiske struktur kombineret med et godt niveau af signaldetektion fra fluorescerende sonder rettet mod gentagne DNA-sekvenser. Dette gør det muligt for forskere at følge ændringer i kromosomadfærden hos celler, der gennemgår meiose langs organets struktur, hvor hver fase af processen tydeligt kan skelnes. Denne teknik kan være særlig nyttig til at studere kromosommeiotisk parring og undersøge de cytologiske fænotyper forbundet med for eksempel syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, hybrid mandlig sterilitet og knock-out af gener involveret i spermatogenese.

Introduction

Malaria pålægger en enorm byrde for den globale menneskelige befolknings sundhed og trivsel. I 2021 vurderede Verdenssundhedsorganisationen (WHO), at malaria forårsagede 619,000 dødsfald, hvoraf 96% forekom i Afrika syd for Sahara1. Sygdommen overføres af myg, der tilhører Anopheles-slægten, og i Afrika syd for Sahara har tre arter, nemlig Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) og Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) en uforholdsmæssig stor rolle i malariaoverførsel og tegner sig for 95% af malariatilfældene globalt. Kontrolprogrammer, der er afhængige af traditionelle metoder såsom insekticider og malariamedicin, har reddet millioner af liv; I de senere år har den stigende resistens over for disse kontrolmetoder imidlertid udfordret deres effektivitet 1,2. Derudover har restriktioner pålagt af COVID-19-pandemien påvirket tilgængeligheden af vigtige malariakontrolinterventioner, hvilket ifølge WHO World Malaria Report 2022 har øget malariaforekomsten1. I de sidste to årtier er der udviklet nye genetiske kontrolmetoder i laboratorieindstillinger for at målrette Anopheles myg 3,4,5,6,7,8,9,10. Blandt disse strategier synes dem, der er baseret på gendrevsystemer (GDS'er) og syntetiske kønsforholdsforvrængere (SD'er), lovende. GDS'er er afhængige af muligheden for at overføre med meget høj frekvens en genetisk modifikation, der påvirker kvindelig fertilitet eller forringer parasitens livscyklus i myggen 5,11,12. SD'er virker i stedet ved at skæve kønsforholdet mellem et mygafkom mod mænd, hvilket over tid fører til sammenbruddet af en målpopulation på grund af mangel på kvinder 4,6,13. Hovedkomponenterne i disse genetiske systemer virker primært på myggenes reproduktive organer, hvor kønsceller, æg og sædceller produceres efter meiotisk division14.

I denne protokol anvendes fremskridt inden for cytogenetiske teknikker til at udforske spermatogenese i An. gambiae med fokus på kromosomernes adfærd in situ. Strukturen af mygtestiklerne og de biologiske processer, der finder sted i den, er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af en række cytologiske metoder, såsom immunofluorescens, fluorescerende reportertransgener og DNA- og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)15,16,17,18,19,20; Organerne viser en spindellignende form, hvor den nederste pol er fastgjort til en deferent kanal forbundet med de mandlige tilbehørskirtler. I den øverste pol spredes kimlinjestamcellernes niche og differentieres til spermatogonia-celler indlejret i spermatocyster dannet af somatiske celler. Efter flere runder af mitotisk opdeling differentieres spermatogonien til spermatocytter, som går ind i meiose. Ved profase parres autosom- og kønskromosomer med deres homologer, og krydsning finder sted. Efter de meiotiske opdelinger genereres runde haploide spermatider og går ind i spermiogenese, og denne proces fører til dannelsen af modne haploide spermatozoer, hvor cytoplasmaet er fjernet, det nukleare kromatin kondenseres, og flageller dukker op ved den basale del af kernerne21,22 (figur 1 og figur 2).

Generelt starter spermiogenese omkring midten af puppestadiet, og modne spermatozoer kan påvises i det sene puppestadium i sædreservoiret23. Modningsprocessen af spermatocysterne fortsætter i voksenlivet23,24,25. I Anopheles testikler kan hvert trin af spermatogenese let identificeres ved at se på cellernes nukleare morfologi i hver spermatocyst (figur 2). Helmonteret fluorescens in situ hybridisering (WFISH), beskrevet i denne protokol, giver forskere mulighed for specifikt at mærke en kromosomal region og spore den under spermatogenese, samtidig med at organets og cellekernernes oprindelige struktur bevares; dette repræsenterer en fordel sammenlignet med standard DNA FISH-protokollen, hvor organet normalt klemmes, hvilket fører til vævsskade19. I den nuværende protokol bruges fluorescerende sonder til at plette gentagne sekvenser på kønskromosomerne og dermed spore deres adfærd under spermatogenese, fra diploide delende celler til modne haploide spermatozoer. WFISH kan være særlig nyttig til at studere meiotisk parring af kønskromosomer og undersøge de cytologiske fænotyper forbundet med for eksempel syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, hybrid mandlig sterilitet og knock-out af gener involveret i spermatogenese 4,19,26,27.

I betragtning af deres rolle som malariavektorer er Anopheles-myg målet for et stigende antal genetiske vektorkontrolstrategier, som ofte virker i disse organismers reproduktive organer. Flere myggenutanter og cytologiske fænotyper er blevet genereret, der kræver nye cytologiske teknikker, der skal undersøges26,27,28,29. Metoden beskrevet i denne undersøgelse kaster lys over forståelsen af spermatogenese samt de cytologiske mekanismer bag genetiske strategier, der har potentiale til at kontrollere malariaoverførende myg.

Protocol

1. DNA-sondemærkning

BEMÆRK: Nedenfor er de tekniske trin til generering af fluorescerende DNA-sonder, der specifikt mærker kønskromosomerne hos An. gambiae myg.

  1. Sondemærkning ved hjælp af PCR
    1. Uddrag genomisk DNA fra pupper eller voksne mænd for at mærke X- eller Y-kromosomerne ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt genomisk DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel).
    2. Forbered PCR-reaktionsblandingen: 200 ng genomisk DNA, 0,05 mM umærket nukleotid (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP og 1 uL fluorescerende mærket dUTP (Cy3, Cy5 eller en anden fluorochrom), 50 pmol fremadgående og omvendt primer (tabel 1), 5 μL 10x PCR-buffer og 10 U Taq DNA-polymerase (se materialetabel).
    3. For at mærke 18S rDNA og satellit AgY53B (tabel 1) skal du udføre en PCR-reaktion ved hjælp af følgende PCR-parametre: en cyklus på 95 °C i 10 minutter; 35 cyklusser på 95 °C i 30 s, 52 °C i 30 s og 72 °C i 45 s en cyklus på 72 °C i 5 minutter og et sidste hold ved 4 °C.
      BEMÆRK: For at opnå en god sondekoncentration med PCR-mærkningsmetoden (~ 1 μg i 5 μL), hvilket er afgørende for en vellykket WFISH, skal PCR-reaktionen være yderst effektiv. Af denne grund anbefales det kraftigt at teste effektiviteten af de primere, der er valgt til forstærkningen, inden sonden mærkes. Derudover vil inkludering af en positiv kontrol i PCR-reaktionen (uden fluorescerende dUTP) bidrage til at verificere effektiviteten af mærkningsreaktionen.
    4. Opbevar sonden ved -20 °C på et mørkt sted.
  2. Opnåelse af 3' ende fluorescerende oligonukleotidsonder
    1. Få kommercielt tilgængelige fluorescerende oligonukleotidprober som modificerede oligoer ved at tilføje Cy3- eller Cy5-fluorkromer (eller enhver anden fluorochrom) til 3'-enden af nukleotidsekvensen (se materialetabel). Se primere/oligonukleotid i tabel 1 for referencesekvenser, der anvendes til at mærke den Y-bundne satellit AgY477-AgY53B-forbindelsesregion og den X-bundne satellit fra Contig_240.
      BEMÆRK: Der er ingen tekniske hindringer relateret til koncentrationen af 3' slutmærkede oligonukleotider, da brugeren normalt kan vælge dette før køb. Vi foreslår fortynding ~ 800 ng oligo sondeopløsning i hybridiseringsbufferen for effektiv mærkning ved hjælp af oligo sonden. X- og Y-specifikke oligosonder er tidligere blevet brugt til WFISH af Liang og Sharakhov19, og referencesekvensen findes i tabel 1.

2. Fremstilling af hybridiseringsopløsningen

BEMÆRK: De fluorescerende sonder, der genereres i trin 1, skal inkorporeres i en kemisk opløsning, der hybridiserer med målsekvenserne.

  1. Sondeudfældning før fluorescens in situ-hybridisering
    1. Til et 1,5 ml rør tilsættes 5 μL mærket DNA-sonde (hvis opnået ved PCR-mærkningsmetoden) eller 2,2 μL 3' modificeret oligosonde (~ 800 ng sonde) fra trin 1 og 5 μL laksesæd-DNA (se materialetabel). Kombiner sonderne, der er specifikke for forskellige genomiske regioner i det samme rør, og brug dem som en unik løsning i de følgende trin.
    2. DNA-sonden udfældes ved tilsætning af 0,1 volumen 3 M natriumacetat og 2 volumener 100% ethanol. Opbevares ved -20 °C i mindst 2,5 timer (forøgelse af inkubationstiden ved -20 °C vil øge det endelige udbytte). På dette stadium kan sonderne også opbevares natten over før centrifugering.
    3. Centrifuger ved 17.000 x g ved 4 °C i 20 minutter, fjern ethanolen, og lufttør pillen ved RT i mørke i ~20 min.
  2. Hybridisering løsning
    1. Før du fortsætter med testisdissektionen (trin 3), fremstilles hybridiseringsbufferen ved at blande følgende reagenser i et 1,5 rør: 500 μL formamid, 0,2 g dextransulfat, 100 μL 20x natriumsaltvandcitrat (SSC) og 200 μL steril H20 (se materialetabel). Vortex hybridiseringsopløsningen i 1 min, og lad dextransulfatet opløses ved 37 °C i 30 minutter.
    2. Pellet opløses fra trin 2.1.3 i 20-30 μL hybridiseringsbuffer (hvirvel i ca. 1 min, udfør en hurtig centrifugering, og opbevar rørene ved 37 °C i mørke) for at opnå hybridiseringsopløsningen.

3. Testis dissektion og fiksering

  1. Ved stuetemperatur (RT) dissekeres21 mindst ~ 20 testikler fra pupper eller 1 dag gamle voksne i steril 1x fosfatbufret saltopløsning (PBS) og overføres til et rent mikroskopglas, der indeholder en frisk dråbe 1x PBS-opløsning.
  2. Overfør testiklerne ved hjælp af en P1.000 bredboret filtreret spids eller spidsen af en dissektionsnål fra 1x PBS-dråben til en embryoskål indeholdende 3,7% formaldehyd i 1x PBS med 0,1% Tween-20 (PBST), og inkuber i 10 minutter ved RT.
  3. Testiklerne vaskes i 1x PBST i 5 minutter ved RT. Testiklerne inkuberes i 0,1 mg/ml RNAse A (se materialetabel) fortyndet i steril 1x PBS i 30 minutter ved 37 °C.
  4. RNAse-opløsningen fjernes, penetrationsopløsningen tilsættes (1 % Triton/0,1 M HCl i 1x PBST), og der inkuberes ved RT i 10 minutter.
    BEMÆRK: Proteinase K kan anvendes som penetrationsmiddel ved en slutkoncentration på 10 μg/ml i 1x PBST for at øge permeabiliseringen af testiklerne.
  5. Vask testiklerne i 1x PBST to gange i 5 minutter hver ved RT.

4. Hybridisering

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver de sidste trin for in situ-hybridisering .

  1. Efter vasketrinnet (trin 3.5) overføres testiklerne i et 1,5 ml rør med 20-30 μL hybridiseringsopløsning indeholdende den tidligere fremstillede sonde (trin 2.2.2). Brug pipettens spids til at blande opløsningen forsigtigt. Svip forsigtigt med tuben fem gange, før du fortsætter til næste trin.
  2. Der inkuberes i 5 minutter ved 75 °C til DNA-denaturering.
  3. Der inkuberes natten over ved 37 °C (om muligt med vuggende ved mindre end 100 omdr./min.) til DNA-DNA-hybridisering.
  4. Overfør testiklerne tilbage i en embryoskål ved hjælp af en P1.000 bredboret filtreret spids, og vask dem i 2x SSC forvarmet til 50 ° C i 5 minutter.
    BEMÆRK: Efter hybridiseringstrinnet kræves et sidste vasketrin ved hjælp af 2x SSC; Dette spiller en vigtig rolle i fjernelsen af ethvert baggrundssignal forårsaget af tilstedeværelsen af uhybridiserede sonder inde i organvævet. Hvis der er et stærkt baggrundssignal, anbefales det at gentage det sidste vasketrin.
  5. Fjern 2x SSC, og monter testiklerne ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (se materialetabel) på et frostet glasglas, forsegl med dækslipforseglingsmiddel og inkuber i mindst 2 timer ved RT i mørke.
  6. Udfør konfokal billeddannelse. Hele testiklerne kan visualiseres ved hjælp af 40x eller 63x olienedsænkningsmål. Hvis der udføres en z-stak, foreslår vi at bruge et z-trin på 1,25 μm.

Representative Results

I dette arbejde blev WFISH brugt til at undersøge kromosomadfærden under spermatogenese i An. gambiae. Det første afgørende skridt for at anvende denne protokol er at opnå testikler, der viser et lavt niveau af morfologisk ændring efter dissektion. Grundlæggende kendskab til myggens anatomi er nødvendig for at udføre en vellykket testisdissektion, og nedenfor gives nogle vejledninger til denne procedure. I Anopheles-myggen kan modne testikler findes liggende i det sjette abdominale segment af puppe- og voksenstadierne21. Som vist i figur 1 forbinder vas deferens testiklerne med de mandlige tilbehørskirtler (MAG'er), som er placeret i det sidste segment af maven. MAG'erne er forbundet med en unik ejakulatorisk kanal, der leverer sædceller og sædvæsker til det kopulatoriske organ og den ydre del af det mandlige kønsapparat21. Hele det indre mandlige kønsapparat kan dissekeres ved hjælp af forskellige tilgange afhængigt af myggens livsstadium. Under puppestadiet kan testikler let identificeres ved hjælp af et stereomikroskop i hele lysbåndet ved at se på den ventrale side af maven i nærheden af det sjette segment (figur 1). For at dissekere testiklerne kan den nederste del af maven, herunder det sjette segment, isoleres fra resten af kroppen ved hjælp af et par nåle og overføres til en ren dråbe på 1x PBS. Efter fjernelse af det sidste segment kan hele apparatet presses ud af maven ved at anvende let tryk med dissekeringsnålene. For at dissekere testiklerne fra voksne mænd involverer det første trin at isolere hele maven i en frisk dråbe på 1x PBS og derefter trække det sidste segment ud, der bærer spænderne, som er de mandlige kopulatoriske strukturer (figur 1). På dette tidspunkt skal den nederste del af MAG'erne dukke op og være let identificerbare på grund af deres gule farve. Hele det mandlige apparat kan derefter langsomt trækkes ud ved hjælp af en nål eller tang i en dråbe på 1x PBS, indtil testiklerne, der er fastgjort til vas deferens , er synlige. Før du fortsætter med fikseringen, er det vigtigt at isolere testiklerne fra de andre dele af hanapparatet ved at skære i nærheden af den nedre del af vas deferens (figur 1).

Puppernes eller voksne hanners alder er en vigtig faktor at overveje afhængigt af spermatogenesestadiet under undersøgelse. I An. gambiae starter spermatogenese i det tidlige / midterste puppestadium, og det fortsætter gennem hele individets liv24. Mellem 3 timer og 10 timer efter hvalpen er de præmeiotiske og meiotiske stadier mere repræsenteret i testiklerne (meiotisk profase, meiotiske opdelinger), spermatid-DNA'et er relativt kondenseret, og modne sædceller er endnu ikke dannet. Sene pupper og 1 dag gamle voksne tilbyder en god balance mellem de præmeiotiske, meiotiske og postmeiotiske stadier (figur 2 og figur 3). Hos voksne, der er mere end 4 dage gamle, er de præmeiotiske stadier og spermatocyster mindre repræsenteret, og testiklerne er hovedsageligt optaget af modne sædceller indeholdt i sædreservoiret.

For at undersøge kønskromosomernes opførsel under forskellige stadier af spermatogenese blev WFISH udført på testikler dissekeret på det sene puppestadium for at sikre en god repræsentation af hele processen. For at følge opførelsen af disse kromosomer blev fluorescerende prober, der er specifikke for gentagne sekvenser, der udelukkende er placeret på X- eller Y-kromosomet, anvendt. De fluorescerende sonder kan genereres ved hjælp af PCR eller opnås kommercielt som 3' slutmærkede oligonukleotider. Brug af en oligo med en længde på >40 bps anbefales for at muliggøre god signaldetektion fra den fluorescerende oligosonde. Efter vores erfaring fungerer 3' slutmærkede oligoer bedre end PCR-mærkede sonder med hensyn til signaldetektion. Derudover er kopinummeret på målsekvensen en faktor, der kan påvirke effektiviteten af WFISH. Hvis mærkning ikke lykkes, foreslås det at bruge PCR-mærkningsmetoden på et længere fragment eller designe flere oligoer, der er specifikke for målregionen.

De nuværende metoder, der er baseret på anvendelse af en penetrerende opløsning (1% Triton/0,1 M HCI i 1x PBST), tillader et godt niveau af testikelpermeabilisering og penetration af sonderne, hvilket resulterer i en vellykket hybridiseringsreaktion. Oligo-sonder, der er specifikke for kønskromosom-gentagne sekvenser, kan designes baseret på den omfattende karakterisering af gentagne elementer udført af Hall et al.20. Derudover kan konsensussekvenser, der er specifikke for X- eller Y-bundne gentagne elementer, opnås ved hjælp af en bioinformatisk platform såsom RedKmer-rørledningen30. Det er vigtigt at bemærke, at kønskromosomprober kan målrette mod gentagne elementer såsom satellitter og retrotransposoner, og de kan have et andet niveau af hybridisering med X- eller Y-kromosomerne afhængigt af arten under undersøgelse 20,31,32. Som vist i figur 3 tillod et godt niveau af hybridisering af sonderne og lav baggrund visualisering af de målrettede kromosomer gennem spermatogenese. Parringen af mærkede kønskromosomer kunne ses i de præmeiotiske og meiotiske stadier. Dette blev efterfulgt af påvisning af enten X- eller Y-kromosomerne i haploide cellekerner som følge af meiotiske opdelinger. Derefter kunne X- eller Y-bærende spermatider følges gennem spermiogenese, præget af forskellige niveauer af DNA-kondensation, til det sidste trin af pilformede modne spermatozoer. I den nuværende eksperimentelle opsætning blev konfokale Z-stakke brugt til at erhverve information om cellernes 3D-rumlige organisering under denne proces (Video 1).

Figure 1
Figur 1: Testikler dissekeret fra pupper og 1 dag gamle voksne Anopheles gambiae hanner. (A) En abdomen dissekeret i det sene puppestadium, der viser testiklernes position i nærheden af det sjette abdominale segment. Testiklerne kan identificeres i hele neglebåndet og fremstår som brunlige strukturer på begge sider af maven (med pile). (B) Testikler dissekeret på puppestadiet, der viser de modne testikler (1), vas deferens (2), MAG'er (3) og ejakulatorisk kanal (4). (C) En abdomen dissekeret fra en 1 dag gammel voksen mand efter fjernelse af basallåssegmentet. MAG'erne kan klemmes fra maven ved at anvende let tryk (hvid pil). (D) Mandligt indre reproduktionsapparat dissekeret fra en 1 dag gammel voksen mand. Den hvide pil angiver positionen optaget af modne sædceller, der fremstår som et hvidt aggregat ved testiklernes basale pol. Skalastænger: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. Romertallene fra I til VIII angiver abdominale segmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentation af spermatogenese i Anopheles gambiae. Billedet til venstre viser en An. gambiae sen puppetestis efter helmonteret DAPI-farvning. Til højre er en skematisk version for bedre visualisering. Ved at observere den nukleare form og kondensationsniveauet er det relativt let at følge alle spermatogenesestadierne fra diploide celler til haploide spermatozoer. Stamcellenichen er placeret i organets øverste pol, hvor differentiering til spermatogonia starter. Spermatogoniacellerne stiger i antal efter mitotisk opdeling (grønne celler), og spermatocysterne stiger i størrelse (gule celler). Spermatogonia-cellerne differentieres til spermatocytter efter flere runder af mitotiske opdelinger (blå celler). Spermatocytterne, som er karakteriseret ved relativt større kerner end cellerne i de andre stadier af processen, er de celler, der vil gennemgå meiotisk opdeling. Celler, der gennemgår meiose, kan detekteres ved at se på tilstedeværelsen af kromosomer på forskellige meiotiske stadier; Chiasmata og metafasekromosomer kan detekteres selv ved lav forstørrelse. De præmeiotiske stadier er overrepræsenteret i testikler dissekeret i det tidlige puppestadium. Efter den første og anden meiotiske opdeling produceres spermatider og kan normalt findes liggende midt i testiklerne. Kernerne af spermatider viser en vis grad af variation i deres form, fra en rund til en pillignende form. Spermatiderne går ind i spermiogeneseprocessen, hvor kernerne begynder at kondensere, og deres struktur ændres til pillignende prikker. Når myg modnes seksuelt efter fremkomst, kan spermatocyster, der indeholder modne sædceller, optage det meste af testisvolumenet på bekostning af spermatocyster på et andet udviklingsstadium. Skalabjælke: 20 μm. Stjernen (*) angiver den apikale del af testiklerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: WFISH på en An. gambiae testis dissekeret fra det sene puppestadium. WFISH blev udført ved hjælp af sonder, der var specifikke for X (Contig_240) og Y (oligo sonde specifik for AgY53B) kromosomer. (A) WFISH gør det muligt at følge kønskromosomets opførsel under spermatogenese fra diploide celler til haploide spermatozoer. I dette billede er det muligt at sætte pris på de dramatiske ændringer, som kernerne gennemgår under spermatogenese. Mærkning af kønskromosomerne giver mulighed for diskrimination mellem diploide og haploide celler. I diploide celler er signalet fra kønskromosomerne bundet til de samme kerner. I haploide celler (spermatider og spermatozoer) er signalet fra kønskromosomerne ikke forbundet på grund af den meiotiske reduktionsdeling. (B,C) Et billede med højere forstørrelse (63x) af testiklerne vist i (A). De blev erhvervet på forskellige positioner langs Z-aksen. De hvide stiplede rammer angiver erhvervelsesområdet. (B) Overgangstrinnet mellem spermatocytter og spermatider, der viser dannelsen af haploide celler og adskillelsen af signalerne fra kønskromosomerne i separate kerner. C) Overgangsstadiet mellem haploide spermatider og modne spermatozoer. Denne fase viser ændringerne i det nukleare kondensationsniveau; Modne spermatozoer viser en mere kondenseret og langstrakt form end spermatider. Skalastænger: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Grå: DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.

Målsekvens Primersekvens og oligo-sondekonsensus Henvisning
Contig_240 (X) 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorochrome]		 19
AgY53B (Y) 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorochrome]		 Denne undersøgelse
AgY477-
AgY53B
knudepunkt
region (Y)		 5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochrome]		 19
18S rDNA (X) F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 19
AgY53B (Y) F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 19

Tabel 1: Liste over oligoprober, der er specifikke for X- eller Y-kromosomet i An. gambiae.

Video 1: En 3D-stak på WFISH udført på en An. gambiae testis dissekeret fra det sene puppestadium. For at opnå en 3D-repræsentation af spermatogeneseprocessen kan en konfokal 3D-stak udføres på testikler, der viser et lavt antal strukturelle ændringer. I denne undersøgelse blev stablerne udført med et interval på 1,25 μm mellem to optiske sektioner under en 63x eller 40x olielinse for ikke at miste information om cellernes 3D-rumlige organisation. Grå: DAPI, gul: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Almindeligvis kræver FISH-protokoller klemning af det interessante organ for at muliggøre kromosomfarvning. Dette medfører tab af information om det rumlige arrangement af cellerne i dette organ33. Denne protokol beskriver, hvordan biologiske processer, såsom spermatogenese, kan studeres in situ, samtidig med at testiklernes intakte native struktur og dens interne cytologiske organisation opretholdes. Sonder rettet mod forskellige DNA-gentagne elementer, som er særligt beriget i kønskromosomer20, kan samtidig bruges til at afsløre dynamikken i sædmodning. Afhængigt af tidspunktet for testisdissektionen giver WFISH mulighed for at studere forskellige stadier af spermatogenese gennem mygudvikling. WFISH er nyttig til at studere specifikke fænomener såsom hybrid inkompatibilitet, som i Anopheles myg skyldes tilstedeværelsen af meiotiske defekter såsom præmeiotisk svigt og kønskromosom ikke-disjunktion 19,34,35. Udover det biologiske aspekt er spermatogenese målet for en række genetiske strategier udviklet til bekæmpelse af skadedyrsinsekter som Anopheles myg. I denne sammenhæng er det X-bundne rDNA-locus af An. gambiae blevet brugt som et mål for at udvikle en syntetisk kønsforholdsforvrængning, som ved at beskadige X-bærende sædceller skævvrider afkom mod mænd 4,8,13.

Denne teknologi afspejler virkningen af naturlige kønsforhold meiotiske drev, der er blevet identificeret i flere taxa, herunder myg, men som stadig er dårligt forstået 28,36,37,38,39,40,41. WFISH giver mulighed for at undersøge dette fænomen og baner vejen for at forfine eller forbedre kønsforvrængningsbaserede genetiske strategier ved for eksempel at give information om, hvordan sædproduktionens cytologi påvirkes af valget af de målsteder, der anvendes til kønskromosommakulering. Selvom WFISH efter vores erfaring viser store chancer for succes, kan der stadig forekomme fiasko. Dette kan skyldes et ineffektivt niveau af vævspermeabilisering, som kan overvindes ved at øge inkubationstiden for den penetrerende opløsning. Alternativt kan proteinase K anvendes under permeabiliseringstrinnet. I nogle tilfælde bemærkede vi et ikke-ensartet niveau af sondeindtrængning med et højere signal i spermatocytkerner og et lavere eller fraværende signal i meiotiske og spermiogenese stadier. Dette kan skyldes en forskel i permeabiliseringsniveauet afhængigt af cellestadiet. Derudover viste WFISH sig at være værdifuld, når man brugte fluorescerende sonder designet til at målrette DNA-sekvenser, der var til stede i høje kopinumre. Når man målretter mod enkeltkopigener, er signaldetekteringen muligvis ikke tilstrækkelig. I dette tilfælde skal metoder til signalforstærkning, såsom tyramidsignalforstærkning (TSA), integreres42.

Denne protokol kunne kombineres med immunfarvning eller med transgene reporterstammer, der huser kimlinjespecifikke fluorescerende markører16,18, da dette ville tilføje information om proteinlokalisering og genekspression in situ. I dette arbejde beskrives WFISH som en teknik til at undersøge spermatogenese i Anopheles myg; Men i betragtning af den fælles anatomi af mandlige reproduktive organer kunne denne protokol anvendes på andre myggearter, der spiller en rolle i sygdomsoverførsel. På samme måde kunne kvindelig gametogenese undersøges ved hjælp af denne teknik. Derudover kunne cytologiske undersøgelser i organer eller væv af interesse, såsom myggens midgut, som er et mål for parasitinvasion, eller atypiske genetiske baggrunde, såsom dem i hybridmyg, udforskes43. Desuden kan denne teknik potentielt overføres til andre organismer inden for Diptera-ordenen.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Bill & Melinda Gates Foundation og Open Philanthropy. Vi takker Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) ved Imperial College London for mikroskopianalysen. Figur 2 blev oprettet med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP Cytiva PA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP Cytiva PA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips ThermoFisher Scientific 2079GPK
CytoBond Removable Coverslip Sealant SciGene 2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits  Qiagen 69504
Embryo Dishes VWR 70543-30
Ethanol, molecular grade Sigma-Aldrich 51976
Formamide ThermoFisher Scientific 17899
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
Hydrochloric acid, 37% Sigma-Aldrich 320331
Microscope slides, SuperFrost VWR  631-0114
PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36941
RNase A/T1 Mix ThermoFisher Scientific EN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U1330
Sodium Acetate Solution ThermoFisher Scientific R1181
SP8 inverted confocal microscope Leica
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution ThermoFisher Scientific 15632011
UltraPure SSC 20x ThermoFisher Scientific 15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics Contig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 Eurofins Genomics 18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
  2. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  3. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  4. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977 (2014).
  5. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  6. Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
  7. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
  8. Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158 (2019).
  9. Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
  10. Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218 (2022).
  11. Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
  12. Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
  13. Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139 (2016).
  14. Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
  15. Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
  16. Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841 (2019).
  17. Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255 (2015).
  18. Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13 (2009).
  19. Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080 (2019).
  20. Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
  21. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
  22. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
  23. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, S6 (2009).
  24. Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62 (2006).
  25. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  26. Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374 (2021).
  27. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
  28. Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
  29. Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160 (2019).
  30. Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
  31. Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327 (2020).
  32. Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
  33. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215 (2012).
  34. Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207 (2021).
  35. Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
  36. Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
  37. Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
  38. Jaenike, J. Sex chromosome meiotic drive. Annual Review of Ecology and Systematics. 32 (1), 25-49 (2001).
  39. Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430 (2019).
  40. Zanders, S. E., Unckless, R. L. Fertility costs of meiotic drivers. Current Biology. 29 (11), R512-R520 (2019).
  41. Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
  42. Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15 (2014).
  43. Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).

Tags

Helmonteret fluorescens in situ-hybridisering spermatogenese Anopheles myg genetiske teknologier gendrev syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler skadedyrsinsektpopulationer mendelsk arv sædkønsforhold Anopheles gambiae malariavektor cytologisk model cellekernestruktur fluorescerende sonder FISH reproduktive organer genomiske regioner
Helmonteret fluorescens <em>in situ-hybridisering</em> for at studere spermatogenese i <em>Anopheles-myggen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov,… More

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov, I., Bernardini, F. Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito. J. Vis. Exp. (195), e65356, doi:10.3791/65356 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter