Summary
ハ マダラカ の精巣は、その単純な解剖学的構造を考えると、精子形成を研究するための優れた細胞学的モデルを提供します。このプロトコルは精液の生産にかかわる遺伝子の突然変異を宿すtransgenic緊張の表現型と同様、この生物的プロセスを調査するのに使用される技術、その 場 の全台紙の蛍光性を記述する。
Abstract
精子形成は、二倍体細胞が連続的な有糸分裂と減数分裂を経て、その後大きな構造変化を経て一倍体精子を形成する複雑な生物学的プロセスです。生物学的側面に加えて、精子形成の研究は、遺伝子ドライブや合成性比歪曲器などの遺伝技術を理解し、開発するために最も重要であり、メンデル遺伝と精子の性比をそれぞれ変更することにより、害虫の個体数を制御するために使用できます。これらの技術は、実験室で非常に有望であることが証明されており、マラリアの媒介者である ハマダラカ の野生個体群の制御に使用できる可能性があります。 精巣の解剖学的構造の単純さと医学的重要性により、サハラ以南のアフリカの主要なマラリア媒介者である ガンビエハマダラカは、精子形成を研究するための優れた細胞学的モデルを表しています。このプロトコルはとりわけXおよびY染色体を汚す蛍光プローブを使用して精子形成によってセル核構造の劇的な変更を調査するのに全台紙の蛍 光性を そのままの交配(WFISH)がいかに使用することができるか記述する。FISHは通常、有糸分裂染色体または減数分裂染色体を露出させ、特定のゲノム領域を蛍光プローブで染色するために生殖器官の破壊を必要とします。WFISHは、反復DNA配列を標的とする蛍光プローブからの良好なシグナル検出と相まって、精巣の天然細胞学的構造の保存を可能にします。これにより、研究者は減数分裂を起こしている細胞の染色体挙動の変化を器官の構造に沿って追跡することができ、プロセスの各段階を明確に区別することができます。この手法は、染色体減数分裂のペアリングを研究し、例えば、合成性比歪曲器、ハイブリッド男性不妊症、精子形成に関与する遺伝子のノックアウトに関連する細胞学的表現型を調査するために特に有用である可能性があります。
Introduction
マラリアは、世界の人々の健康と福祉に多大な負担をかけています。2021年、世界保健機関(WHO)は、マラリアによる死者数は61万9,000人で、そのうち96%がサハラ以南のアフリカで発生したと推定しています1。この病気はハマダラカ属に属する蚊によって伝染し、サハラ以南のアフリカでは、ガンビエハマダラカ(An. gambiae)、ハマダラカ(An, coluzzi)、アハマダラカ(An. arabiensis)の3種がマラリア伝播に不釣り合いに大きな役割を果たしており、世界のマラリア症例の95%を占めています。 殺虫剤や抗マラリア薬などの従来の方法に頼る防除プログラムは、何百万人もの命を救ってきました。しかし、近年、これらの制御方法に対する耐性の高まりにより、その有効性が疑問視されています1,2。さらに、COVID-19のパンデミックによって課せられた制限は、主要なマラリア制御介入の利用可能性に影響を与えており、2022年のWHO世界マラリア報告書によると、マラリアの発生率が増加しています1。過去20年間で、ハマダラカ3,4,5,6,7,8,9,10を標的とする新しい遺伝子制御法が実験室で開発されてきました。これらの戦略の中で、遺伝子ドライブシステム(GDS)と合成性比歪曲器(SD)に基づく戦略は有望であるように思われます。GDSは、蚊の雌の生殖能力に影響を与えたり、寄生虫のライフサイクルを損なう遺伝子組み換えを非常に高い頻度で伝達する可能性に依存しています5,11,12。代わりに、SDは、蚊の子孫の性比をオスに歪めることによって作用し、時間の経過とともに、メスの不足によるターゲット集団の崩壊につながります4,6,13。これらの遺伝子系の主成分は、主に蚊の生殖器官に作用し、配偶子、卵子、精子は減数分裂14の後に産生される。
このプロトコルでは、細胞遺伝学的技術の進歩が、その場での染色体の行動に焦点を当ててAn.ガンビエの精子形成を探索するために採用されています。蚊の精巣の構造とその中で起こる生物学的プロセスは、免疫蛍光、蛍光レポーター導入遺伝子、DNAおよびRNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)などの多くの細胞学的方法を使用して以前に調査されてきました15,16,17,18,19,20;器官は紡錘体のような形状を示し、下部の極は男性の副腺に接続された従順な管に取り付けられています。上極では、生殖細胞系幹細胞のニッチが増殖し、体細胞によって形成された精母嚢胞内に埋め込まれた精原細胞に分化します。有糸分裂の複数回のラウンドの後、精原細胞は精母細胞に分化し、精母細胞は減数分裂に入ります。前期では、常染色体と性染色体が相同体とペアになり、交叉が起こります。減数分裂後、丸い一倍体精子が生成されて精子形成に入り、細胞質が除去され、核クロマチンが凝縮し、核基底部にべん毛が出現する成熟一倍体精子が形成される21,22(図1、図2)。
一般に、精子形成は蛹期中期頃に始まり、成熟精子は蛹期後期に精子貯留部23で検出することができる。精母嚢胞の成熟過程は、成人期まで続きます23,24,25。ハマダラカの精巣では、精子形成の各段階は、各精母嚢胞の細胞の核形態を調べることで簡単に識別できます(図2)。このプロトコルで記述されている全台紙の蛍光性その場の交配(WFISH)は研究者が器官および細胞核の位置の自然な構造を維持している間染色体領域をとりわけ分類し、精子形成の間にそれを追跡することを可能にする;これは、臓器が通常押しつぶされ、組織損傷につながる標準的なDNA FISHプロトコルと比較した場合の利点を表しています19。現在のプロトコルでは、蛍光プローブを使用して性染色体上の反復配列を染色し、二倍体分裂細胞から成熟した一倍体精子まで、精子形成中の挙動を追跡します。WFISHは、性染色体減数分裂のペアリングを研究し、例えば、合成性比歪曲、ハイブリッド男性不妊症、精子形成に関与する遺伝子のノックアウトに関連する細胞学的表現型を調査するのに特に有用である4,19,26,27。
マラリア媒介生物としての役割を考えると、ハマダラカはますます多くの遺伝的媒介生物防除戦略の標的となっており、これらの生物の生殖器官に作用することが多い。いくつかの蚊の変異体と細胞学的表現型が生成されており、新しい細胞学的手法を調査する必要があります26,27,28,29。本研究で報告された方法は、精子形成の理解と、マラリアを媒介する蚊を制御する可能性のある遺伝的戦略の背後にある細胞学的メカニズムに光を当てます。
Protocol
1. DNAプローブラベリング
注:以下は、 An. gambiae 蚊の性染色体を特異的に標識する蛍光DNAプローブを生成するための技術的手順です。
- PCRを用いたプローブラベリング
- 市販のゲノムDNA抽出キットを用いて、蛹または成体オスからゲノムDNAを抽出し、X染色体またはY染色体を標識します( 材料表を参照)。
- PCR反応混合物を調製します:200 ngのゲノムDNA、0.05 mMの非標識ヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP)、0.015 mMのdTTP、および1 uLの蛍光標識dUTP(Cy3、Cy5、または別の蛍光色素)、50 pmolのフォワードおよびリバースプライマー(表1)、5 μLの10x PCRバッファー、および10 UのTaq DNAポリメラーゼ( 材料表を参照)。
- 18S rDNAおよびサテライトAgY53B(表1)を標識するには、以下のPCRパラメータを使用してPCR反応を行います:95°Cで10分間の1サイクル。95°Cで30秒、52°Cで30秒、72°Cで45秒の35サイクル。72°Cで5分間の1サイクル。そして4°Cでの最終ホールド。
注:WFISHを成功させるために重要なPCR標識法(5 μL中~1 μg)で良好なプローブ濃度を得るには、PCR反応を非常に効率的に行う必要があります。このため、プローブを標識する前に、増幅のために選択されたプライマーの有効性をテストすることが強く推奨されます。さらに、PCR反応(蛍光dUTPなし)にポジティブコントロールを含めると、標識反応の有効性を検証するのに役立ちます。 - プローブは-20°Cの暗所に保管してください。
- 3'末端蛍光オリゴヌクレオチドプローブの入手
- ヌクレオチド配列の3'末端にCy3またはCy5蛍光色素(またはその他の蛍光色素)を添加することにより、市販の蛍光オリゴヌクレオチドプローブを修飾オリゴとして入手します( 材料表を参照)。Y結合衛星AgY477-AgY53B接合領域およびContig_240からのX結合衛星の標識に用いた参照配列については、 表1 のプライマー/オリゴヌクレオチドを参照してください。
注:3'末端標識オリゴヌクレオチドの濃度に関する技術的な障害はなく、ユーザーは通常、購入前にこれを選択できます。オリゴプローブを使用して効率的に標識するために、ハイブリダイゼーションバッファーで~800 ngのオリゴプローブ溶液を希釈することをお勧めします。XおよびY特異的オリゴプローブは、LiangおよびSharakhov19によってWFISHに以前に使用されており、参照配列を 表1に示します。
- ヌクレオチド配列の3'末端にCy3またはCy5蛍光色素(またはその他の蛍光色素)を添加することにより、市販の蛍光オリゴヌクレオチドプローブを修飾オリゴとして入手します( 材料表を参照)。Y結合衛星AgY477-AgY53B接合領域およびContig_240からのX結合衛星の標識に用いた参照配列については、 表1 のプライマー/オリゴヌクレオチドを参照してください。
2. ハイブリダイゼーション溶液の調製
注:ステップ1で生成した蛍光プローブは、標的配列とハイブリダイズする薬液に組み込む必要があります。
- 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション前のプローブ沈殿
- 1.5 mLのチューブに、ステップ1の標識DNAプローブ5 μL(PCR標識法で得られた場合)または2.2 μLの3'修飾オリゴプローブ(~800 ngのプローブ)と5 μLのサケ精子DNAを加えます( 材料表を参照)。異なるゲノム領域に特異的なプローブを同じチューブ内で組み合わせ、次の手順で独自のソリューションとして使用します。
- 0.1容量の3 M酢酸ナトリウムと2容量の100%エタノールを添加してDNAプローブを沈殿させます。-20°Cで少なくとも2.5時間保持します(-20°Cでのインキュベーション時間を長くすると、最終収量が増加します)。この段階では、遠心分離前にプローブを一晩保存することもできます。
- 17,000 x g 、4°C、20分間遠心分離し、エタノールを除去し、室温でペレットを暗所で~20分間風乾します。
- ハイブリダイゼーションソリューション
- 精巣解剖(ステップ3)に進む前に、以下の試薬を1.5チューブ中で混合してハイブリダイゼーションバッファーを調製する:ホルムアミド500μL、硫酸デキストラン0.2g、20x生理食塩クエン酸ナトリウム(SSC)100μL、および滅菌H2 020μL(材料表参照)。ハイブリダイゼーション溶液を1分間ボルテックスし、デキストラン硫酸を37°Cで30分間溶解させます。
- ステップ2.1.3のペレットを20〜30μLのハイブリダイゼーションバッファーに溶解し(約1分間ボルテックスし、クイックスピンを行い、チューブを暗所で37°Cで保存する)、ハイブリダイゼーション溶液を得る。
3.精巣の解剖と固定
- 室温(RT)で、蛹または生後1日の成体から少なくとも21 ~20個の精巣を滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で解剖し、1x PBS溶液を新たに滴下した清潔な顕微鏡スライドに移します。
- P1,000ワイドボアフィルターチップまたは1x PBSドロップの解剖針の先端を使用して精巣を、1x PBS中の3.7%ホルムアルデヒドと0.1%Tween-20(PBST)を含む胚皿に移し、室温で10分間インキュベートします。
- 精巣を1x PBSTで5分間室温で洗浄し、滅菌1x PBSで希釈した0.1 mg/mL RNAse A( 材料表を参照)中で精巣を37°Cで30分間インキュベートします。
- RNAse溶液を除去し、浸透溶液(1x PBST中の1%トリトン/0.1 M HCl)を加え、室温で10分間インキュベートします。
注:プロテイナーゼKは、精巣の透過性を高めるために、1x PBSTの最終濃度10 μg/mLで浸透剤として使用できます。 - RTで精巣を1x PBSTで2回、それぞれ5分間洗浄します。
4. ハイブリダイゼーション
注:このセクションでは、 in situ ハイブリダイゼーションの最終ステップについて説明します。
- 洗浄工程(ステップ3.5)の後、精巣を、以前に調製したプローブを含む20〜30μLのハイブリダイゼーション溶液を含む1.5mLチューブに移す(ステップ2.2.2)。ピペットの先端を使用して、溶液を穏やかに混合します。次のステップに進む前に、チューブを5回軽くはじきます。
- DNA変性のために75°Cで5分間インキュベートします。
- DNA-DNAハイブリダイゼーションのために、37°Cで一晩インキュベートします(可能であれば、100rpm未満でロッキングします)。
- P1,000ワイドボアフィルターチップを使用して精巣を胚皿に戻し、50°Cに予熱した2x SSCで5分間洗浄します。
注:ハイブリダイゼーションステップの後、2x SSCを使用した最終洗浄ステップが必要です。これは、臓器組織内のハイブリダイズされていないプローブの存在によって引き起こされるバックグラウンドシグナルを除去する上で重要な役割を果たします。強いバックグラウンド信号が存在する場合は、最後の洗浄ステップを繰り返すことをお勧めします。 - 2x SSCを取り外し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)( 材料表を参照)を含む市販の封入剤を使用して曇りガラススライドに精巣をマウントし、カバーガラスシーラントでシールし、暗所の室温で少なくとも2時間インキュベートします。
- 共焦点イメージングを実行します。精巣全体は、40倍または63倍の油浸対物レンズを使用して視覚化できます。zスタックを実行する場合は、1.25μmのzステップを使用することをお勧めします。
Representative Results
この研究では、WFISHを使用して、 An. gambiaeの精子形成中の染色体挙動を調査しました。このプロトコルを適用するための最初の重要なステップは、解剖後に低レベルの形態学的変化を示す精巣を得ることです。精巣解剖を成功させるには、蚊の解剖学に関する基本的な知識が必要であり、以下に、この手順に関するいくつかのガイダンスを示します。 ハマダラカ では、成熟した精巣が蛹と成虫の段階の第6腹部に横たわっているのが見られます21。 図1に示すように、 精管 は精巣を腹部の最後の部分にある男性副腺(MAG)に接続します。MAGは、精子および精液を交尾器官および男性生殖器21の外部部分に送達する独自の射精管に接続されている。男性の生殖器官全体は、蚊のライフステージに応じて異なるアプローチで解剖することができます。蛹の段階では、第6体節付近の腹側を見ることで、光キューティクル全体の実体顕微鏡を使用して精巣を簡単に識別できます(図1)。精巣を解剖するには、第6セグメントを含む腹部の下部を、一対の針を使用して体の他の部分から分離し、1x PBSのきれいな滴に移すことができます。最後のセグメントの除去に続いて、解剖針で穏やかな圧力をかけることにより、装置全体を腹部から押し出すことができます。成人男性の精巣を解剖するには、まず腹部全体を1x PBSの新鮮な滴で分離し、次に男性の交尾構造であるクラスプを運ぶ最後のセグメントを引き抜きます(図1)。この時点で、MAGの下部が浮かび上がり、黄色で簡単に識別できるはずです。次に、精 管 に取り付けられた一対の精巣が見えるまで、針または鉗子の助けを借りて、1x PBSの滴で男性装置全体をゆっくりと引き抜くことができます。固定を進める前に、精管の下部の近くで切断することにより、 精 巣を男性装置の他の部分から分離することが重要です(図1)。
蛹または成体オスの年齢は、調査中の精子形成段階に応じて考慮すべき重要な要素です。 An. gambiae では、精子形成は蛹の初期/中期に始まり、個体の生涯を通じて続きます24。蛹化後3時間から10時間の間に、減数分裂前期および減数分裂期が精巣に多く表され(減数分裂前期、減数分裂)、精子DNAは比較的凝縮されておらず、成熟精子はまだ形成されていない。後期の蛹と生後1日の成虫は、減数分裂前期、減数分裂期、減数分裂後の段階のバランスが取れています(図2 および 図3)。生後4日以上の成人では、減数分裂前期と精母嚢胞はあまり表されず、精巣は主に精子貯留層に含まれる成熟した精子によって占められています。
精子形成のさまざまな段階での性染色体の挙動を調査するために、WFISHは、プロセス全体の良好な表現を確保するために、蛹の後期に解剖された精巣に対して実施されました。これらの染色体の挙動を追跡するために、X染色体またはY染色体にのみ位置する反復配列に特異的な蛍光プローブを使用しました。蛍光プローブは、PCRを用いて作製するか、または3'末端標識オリゴヌクレオチドとして市販のものとして得ることができる。蛍光オリゴプローブからの良好なシグナル検出を可能にするために、>40 bpsの長さのオリゴの使用が推奨されます。私たちの経験では、3'末端標識オリゴは、シグナル検出の点でPCR標識プローブよりも優れた性能を発揮します。また、標的配列のコピー数はWFISHの有効性を左右する因子です。標識がうまくいかない場合は、より長いフラグメントにPCR標識法を使用するか、標的領域に特異的な複数のオリゴを設計することをお勧めします。
現在の分析法は、浸透性溶液(1x PBST 中の 1% Triton/0.1 M HCl)の使用に基づいており、プローブの精巣透過と浸透を良好に行うことができ、ハイブリダイゼーション反応が成功します。性染色体反復配列に特異的なオリゴプローブは、Hallらによって行われた反復要素の広範な特性評価に基づいて設計することができる20。さらに、X−またはY−連結された反復要素に特異的なコンセンサス配列は、RedKmerパイプライン30などのバイオインフォマティクスプラットフォームを用いて得ることができる。性染色体プローブは、サテライトやレトロトランスポゾンなどの反復要素を標的とすることができ、検査中の種に応じてX染色体またはY染色体とのハイブリダイゼーションのレベルが異なる可能性があることに注意することが重要です20,31,32。図3に示すように、プローブのハイブリダイゼーションのレベルが良好でバックグラウンドが低いため、精子形成全体を通して標的染色体を可視化することができました。標識された性染色体のペアは、減数分裂前期と減数分裂期で見られました。これに続いて、減数分裂から生じる一倍体細胞核染色体中のX染色体またはY染色体のいずれかを検出しました。その後、XまたはYを持つ精子は、さまざまなレベルのDNA凝縮によって特徴付けられる精子形成全体から、矢印の形をした成熟精子の最終段階まで追跡することができました。本実験では、共焦点Zスタックを用いて、この過程で細胞の3次元空間構成に関する情報を取得しました(動画1)。
図1:蛹と生後1日の成虫のガンビアハマダラカのオスから解剖した精巣。 (A)蛹後期に解剖された腹部で、第6腹部付近の精巣の位置を示す。精巣はキューティクル全体で識別でき、腹部の両側に茶色がかった構造として現れます(矢印付き)。(B)蛹期に解剖された精巣は、成熟精巣(1)、精管(2)、MAG(3)、射精管(4)を示しています。(C)生後1日の成人男性の腹部を、基底クラスプ部分を取り除いた後に解剖した。MAGは、穏やかな圧力をかけることで腹部から押しつぶすことができます(白い矢印)。(D)生後1日の成人男性から解剖された男性の体内生殖器官。白い矢印は、精巣の基底極に白い凝集体として現れる成熟した精子が占める位置を示しています。スケールバー:(A、C)200μm;(B,D)100μm。IからVIIIまでのローマ数字は腹部を示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)における精子形成の表現。左の画像は、An. gambiaeの後期蛹の精巣をホールマウントDAPI染色した後のものです。右側は、視覚化しやすいように回路図バージョンです。核の形と凝縮レベルを観察することで、二倍体細胞から一倍体精子までのすべての精子形成段階を比較的簡単に追跡できます。幹細胞ニッチは器官の上極に位置し、そこで精原細胞への分化が始まります。精原細胞は有糸分裂後に数が増加し(緑色の細胞)、精母嚢胞のサイズが大きくなります(黄色の細胞)。精原細胞は、有糸分裂(青色細胞)を複数回繰り返した後、精母細胞に分化します。プロセスの他の段階の細胞よりも比較的大きな核を特徴とする精母細胞は、減数分裂を受ける細胞です。減数分裂を起こしている細胞は、さまざまな減数分裂段階で染色体の存在を調べることによって検出できます。キアズマ染色体と中期染色体は、低倍率でも検出できます。減数分裂前期は、蛹の初期段階で解剖された精巣で過剰に表現されています。第1および第2減数分裂の後、精子細胞が産生され、通常、精巣の真ん中に横たわっているのが見られます。精子の核は、丸い形から矢印のような形まで、その形状にある程度の変化を示します。精子は精子形成プロセスに入り、その間に核が凝縮し始め、それらの構造は矢印のような点に変化します。蚊が羽化後に性的に成熟すると、成熟した精子を含む精嚢胞は、発達の異なる段階にある精子嚢胞を犠牲にして、精巣の体積の大部分を占める可能性があります。スケールバー:20 μm。アスタリスク(*)は精巣の頂端部分を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:蛹後期から解剖した An. gambiae精 巣のWFISH。 WFISHは、X染色体(Contig_240)およびY染色体(AgY53Bに特異的オリゴプローブ)に特異的なプローブを用いて実施した。(A)WFISHは、二倍体細胞から一倍体精子への精子形成中の性染色体の挙動を追跡することができます。この画像では、精子形成中に核が受ける劇的な変化を理解することができます。性染色体を標識することで、二倍体細胞と一倍体細胞を区別することができます。二倍体細胞では、性染色体からのシグナルは同じ核に結合しています。一倍体細胞(精子細胞と精子)では、減数分裂により性染色体のシグナルが解かれます。(B、C)精巣の高倍率(63倍)画像を(A)に示す。これらは、Z軸に沿ったさまざまな位置で取得されました。白い点線の枠は、取得領域を示します。(B)精母細胞と精子細胞の間の移行段階であり、一倍体細胞の形成と性染色体からのシグナルの別々の核への分離を示しています。(C)一倍体精子と成熟精子の間の移行段階。この段階は、核凝縮レベルの変化を示します。成熟した精子は、精子よりも凝縮して細長い形状を示します。スケールバー:(A)、30 μm;(B、C)、10μm;グレー:DAPI。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ターゲット・シーケンス | プライマー配列とオリゴプローブのコンセンサス | 参考 |
| Contig_240 (X) | 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[蛍光色素] |
19 |
| AgY53B(Y) | 5'アガアアタガアタカガアタグトク TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[蛍光色素] |
この研究 |
| AgY477- AgY53B型 ジャンクション 地域 (Y) |
5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT GAAGAAACCGACTATTC-3'-[蛍光色素] |
19 |
| 18S rDNA(X) | F:AACTGTGGAAAAGCCAGAGCの 研究:TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
19 |
| AgY53B(Y) | F:CCTTTAAACACATGCTCAAATT R:GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
19 |
表1: An. gambiaeのX染色体またはY染色体に特異的なオリゴプローブのリスト。
ビデオ1:蛹後期から解剖した An. gambiae 精巣で実施されたWFISHの3Dスタック。 精子形成過程の3D表現を得るために、構造変化の数が少ない精巣に対して共焦点3Dスタックを実行することができる。この研究では、細胞の3D空間構成に関する情報を失わないように、63倍または40倍のオイルレンズの下で、2つの光学セクションの間に1.25μmの間隔でスタックを実行しました。グレー:DAPI、イエロー:Contig_240(X)、マゼンタ:AgY53B(Y)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
一般的に、FISHプロトコルでは、染色体染色を可能にするために目的の臓器を潰す必要があります。これは、その器官33内の細胞の空間的配置に関する情報の喪失を引き起こす。このプロトコルは精巣および内部細胞学の構成のそのままの原産の構造を維持している間生物的プロセスが、精子形成のような、その場でいかに調査することができるか記述する。特に性染色体20に富む異なるDNA反復要素を標的とするプローブは、精子の成熟のダイナミクスを明らかにするために同時に使用することができます。精巣解剖のタイミングに応じて、WFISHは蚊の発生による精子形成のさまざまな段階を研究する機会を提供します。WFISHは、ハマダラカでは、減数分裂前障害や性染色体非分離などの減数分裂欠陥の存在による雑種不適合などの特定の現象を研究するのに役立ちます19,34,35。生物学的側面に加えて、精子形成は、ハマダラカなどの害虫を制御するために開発された多くの遺伝的戦略のターゲットです。これに関連して、An. gambiaeのX連鎖rDNA遺伝子座は、Xを有する精子を損傷させることにより、子孫を雄に偏らせる合成性比歪曲器を開発するための標的として使用されてきた4,8,13。
この技術は、蚊を含むいくつかの分類群で確認されているが、まだ十分に理解されていない自然な性比減数分裂ドライブの作用を反映している28,36,37,38,39,40,41。WFISHは、この現象を調査する機会を提供し、例えば、精子生産の細胞診が性染色体細断に使用される標的部位の選択によってどのように影響を受けるかについての情報を提供することにより、性歪みに基づく遺伝的戦略を洗練または改善するための道を開きます。私たちの経験では、WFISHは成功する可能性が高いことを示していますが、それでも失敗が発生する可能性があります。これは、組織の透過処理のレベルが非効率的であることが原因である可能性がありますが、浸透溶液のインキュベーション時間を長くすることで克服できます。あるいは、プロテイナーゼKを透過処理工程中に使用することもできます。場合によっては、精母細胞核のシグナルが高く、減数分裂期と精子形成期のシグナルが低いか存在しないなど、プローブの浸透レベルが不均一であることに気づきました。これは、細胞の段階による透過度の違いが原因である可能性があります。さらに、WFISHは、コピー数の多いDNA配列を標的とするように設計された蛍光プローブを使用する場合に有用であることが証明されました。シングルコピー遺伝子を標的とする場合、シグナル検出が十分でない場合があります。この場合、チラミド信号増幅(TSA)などの信号増幅の方法を統合しなければならない42。
このプロトコルは、免疫染色または生殖細胞特異的蛍光マーカー16,18を有するトランスジェニックレポーター株と組み合わせることができ、これによりタンパク質の局在化と遺伝子発現のin situに関する情報が追加されます。この研究では、ハマダラカの精子形成を調査する技術としてWFISHが説明されています。しかし、男性の生殖器官の解剖学的構造が共有されていることを考えると、このプロトコルは、病気の伝染に関与する他の蚊種にも適用できます。同様に、雌の配偶子形成は、この技術を使用して調査することができます。さらに、寄生虫の侵入の標的である蚊の中腸や、雑種蚊などの非定型遺伝的背景など、関心のある臓器や組織における細胞学的研究も検討できる43。さらに、この技術は双翅目内の他の生物に転用できる可能性があります。
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この活動は、ビル&メリンダ・ゲイツ財団とオープン・フィランソロピーからの助成金によって支援されました。インペリアル・カレッジ・ロンドンのFacility for Imaging by Light Microscopy(FILM)の顕微鏡分析に感謝します。図 2 は Biorender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
| Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
| ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
| Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
| Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
| RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
| Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
| Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
| SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
| UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
| Primer sequences | |||
| 5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
| 5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
| 5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
| F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
| F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |
References
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