Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Изготовление Термопластичные микрожидкостных каналов

doi: 10.3791/664 Published: February 3, 2008

Summary

Здесь показано, как для изготовления термопластичных микрожидкостных чипов использованием горячего тиснения и заварены. Затем мы покажем, как использовать на месте света, направленный поверхности прививки и полимеризации через запечатанном чип для формирования смесевых твердых столбцов фазу.

Abstract

В нашей лаборатории мы успешно изолированных нуклеиновых кислот непосредственно из микролитр и submicroliter объемов человеческой крови, мочи и кала использованием полимер / наночастицы композитных микромасштабной лизиса и твердых экстракционные колонны фазу. Восстановленные образцы сосредоточены и образцов малого объема, которые PCRable, без дополнительной очистки. Здесь показано, как для изготовления термопластичных микрожидкостных чипов использованием горячего тиснения и заварены. Затем мы показываем, как использовать на месте света, направленный поверхности прививки и полимеризации через запечатанном чип для формирования смесевых твердых столбцов фазу. Мы показываем, прививки и полимеризации углеродных нанотрубок / полимерных композиционных колонки для бактериального лизиса клетки. Затем мы показываем, лизис процессе последующей твердофазной экстракции нуклеиновых кислот из образцов на чипе использованием кремния / полимерных композиционных колонке. Прилагаются протоколы содержат подробные инструкции о том, чтобы и лизиса и твердых экстракционные колонны фазу.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Микрожидкостных каналов изготавливаются в циклических полиолефина (Zeonex ® 690R, Zeon Химическая Inc, Луисвилл, Кентукки). Zeonex имеет температуры стеклования (Т г) 136 ° С и УФ-прозрачные, что очень важно для света, направленный химии, используемые в пористых монолит образования. Микроканалов изготавливаются по микро-горячего тиснения с Нико electroformed мастер-формы, которая имеет отрицательный (обратный) особенности микрожидкостных платформы. Горячего тиснения делается следующим образом:

  1. Плесени и полимерной подложки располагаются между двумя параллельными валиками металла.
  2. Валики нагреваются до температуры тиснения (166 ° C), что на 30 º С выше Т г Zeonex.
  3. Валики затем прижимаются друг к другу в течение примерно 5 мин и давление поддерживается на уровне 250 фунтов на квадратный дюйм.
  4. Плесени и подложки затем удаляются из нагретого валики, дают остыть в течение 1-2 мин, а затем вручную отделяются друг от друга.
  5. Уэллс из 1,5-мм сверлятся на концах каналов для введения образца и коллекции.
  6. Тисненые пластиковые подложки затем термически связанного с другой частью Zeonex для формирования закрытых микрожидкостных каналов. Тиснением субстрата и крышкой кусок может быть УФ-озона или плазмы лечение до термоскреплением для повышения эффективности уплотнения и обеспечить верность закрытого типа канала (Бхаттачарья и Klapperich, 2007).

Изготовление твердофазной экстракции (SPE) колонку в пластиковых микрожидкостных каналов

Изготовление твердой фазы происходит в два этапа. Во-первых, сфабрикованных микроканалов являются модифицированной поверхностью для улучшения адгезии SPE колонке пластиковые устройства. Пересадка через поверхностные фотополимеризации используется для functionalize стен полимерные микроканалов.

Прививки процедура выглядит следующим образом:

  1. Микроканалы заполнены 1:01 смеси этилена диакрилат (EDA) и метилметакрилата (ММА) с 3% бензофенона, который является водород абстрагирование фотоинициатора. EDA, ММА и бензофенона закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
  2. Чип то УФ-облучении в течение 10 мин при 254 нм УФ-волны и 200 мДж / см 2 энергии в ультрафиолетовом инструмент воздействия (CL-1000 UV Crosslinker, УПВ Inc, возвышенность, CA). Прививки происходит через H-абстракции полимеризации и приводит к поверхностной привязаны полимерных цепей, которые получают включены в полимеризации смеси, используемой для подготовки монолит во втором шаге.
  3. Избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 15 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.

После photografting процесса, микропористого полимера монолит формируется в микроканалов, что завлечь частиц кремнезема для выделения ДНК. Пористый монолит готовится на месте следующим образом:

  1. С модифицированной поверхностью каналы заполнены смесью монолит предшественник, состоящий из Бума (15% веса), Эдма (10% веса), 1-додеканол (52,5% веса), циклогексанол (22,5% веса), DMPAP (1% по весу по отношению до мономеров) и 0,7 мкм частиц кремнезема (15% по сравнению с общим объемом предварительно полимерная смесь). Кремнезема микросферы были приобретены у Polysciences, Inc (Уоррингтон, штат Пенсильвания) и мономеров и растворителей porogenic закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
  2. Чип облучении УФ в УФ сшивателя при 200 мДж / см 2 в течение 1,1 мин до начала полимеризации, а избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 15 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.
  3. Жидкостного соединения (NanoPorts ТМ соединений, Апчерч Научные, Oak Harbor, Вашингтон), затем крепится на введение и сбор скважин микрожидкостных каналов.
  4. Пористый монолит затем снова промывают метанолом, по крайней мере, 30 минут, используя шприц насоса при расходе 100mL/hour.

Изготовление CNT лизис монолит в пластиковых микрожидкостных каналов

Изготовление CNT (углеродные нанотрубки) лизис монолит состоит из двух этапов. Во-первых, сфабрикованных микроканалов являются модифицированной поверхностью (привитые) таким же образом, как и для SPE столбцы в пластмассовое устройство.

После photografting процесса, микропористого полимера монолит формируется в микроканальных, пропитанную нескольких углеродных нанотрубок. Пористый монолит готовится на месте следующим образом:

  1. Многослойных нанотрубок ресуспендируют в циклогексанол в концентрации 2.27M. Это ресуспендирования является ультразвуком в течение 30 минут при 50% амплитуды и скважности 50% с сотовым sonifier нарушающими (Sonifier S-250D, производства Брэнсон ультразвуковой, Дэнбери, штат Коннектикут). Ультразвука при условии эффективного и стабильного 0.5M приостановлении УНТ. УНТ были приобретены у Nanolabs (Брайтон, Массачусетс).
  2. С модифицированной поверхностью каналы наполнены аналогичные смеси предшественников монолит исключением того, что теперь решение циклогексанол + УНТ используется. Смесь состоит из монолита Бума (15% веса), Эдма (10% веса), 1-додеканол (52,5% веса), и циклогексанол + УНТ (22,5% веса). К этому раствору фотоинициатора DMPAP добавляется (1,13% вес по отношению к мономеров). Мономеров, растворителей и porogenic DMPAPA закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
  3. Чип облучении УФ в УФ сшивателя при 120 мДж / см 2 в течение 0,9 мин до начала полимеризации. Устройство переворачивается на 180 градусов в crossliker и облученных в течение еще ​​0,9 мин при 120 мДж / см 2. Избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 50 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.
  4. Жидкостного соединения (NanoPorts ТМ соединений, Апчерч Научные, Oak Harbor, Вашингтон), затем крепится на введение и сбор скважин микрожидкостных каналов.

Бактериальные Подготовка проб для использования с УНТ лизис монолит

Пробоподготовки для бактериальных образцов включает в себя прием измерения оптической плотности при 600 нм для того, чтобы образец не очень концентрированный, чтобы избежать засорения каналов.

  1. Возьмите чтения ОП при 600 нм с бактериями в средствах массовой информации, это делается с biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Эппендорф Научные, Inc, Westbury, Нью-Йорк). Разбавьте образец до OD чтениях попадает в этот диапазон 0.18-0.25 А.
  2. Центрифуга образца при 6500 оборотов в минуту в течение 5 минут и сцедить супернатант.

Лизис

  1. Ресуспендируют бактерий в GuSCN * + 0,01% SDS + 4% протеиназы К (0.8mg/ml). Vortex кратко (1 мл бактерий в СМИ должны быть ресуспендировали в 1 мл GuSCN). Протеиназы К был добавлен в раствор, чтобы помочь с денатурации белков, которые прикреплены к бактериальной ДНК и ингибировать DNAases и RNAases. Дополнительным преимуществом протеиназы К, что он также помогает при разрушении клеточных белков стены, которая является желательным, так как оба грамположительных бактерий и грамотрицательных бактерий, стены ячейки содержат большое количество белка (хотя и грамотрицательных бактерий, как правило, имеют больше белка ). Хаотропных буфера дополнительно средства протеиназы К с денатурации белков в то время как моющее средство разрушает клеточную стенку. Протеиназы К и гуанидиний тиоцианата (GuSCN) приобретены в Qiagen Inc (Валенсия, Калифорния). SDS (додецилсульфата натрия) был приобретен у Пирс (Рокфорд, штат Иллинойс).
  2. Сразу же нагрузка образца в шприц подключен к PEEK трубки. Аспирируйте шприц так, чтобы воздух не в системе. Подсоедините шланг к nanoport и канал.

KDS100 насос шприца (производства К. Д. Научные, Холлистон, Массачусетс) был использован для эксперимента и расхода используется 450 мкл / час для всех шагов. Поток канала образца лизиса на 450ul/hr.

  1. Сбор образцов и приступить к экстракции ДНК с помощью SPE (см. протокол выделения ДНК). ПРИМЕЧАНИЕ: Это бактериальная образца не нужно будет следить нагрузки Шаг 2, так как подвеска GuSCN *.

ДНК Добыча протокола

Добыча процедура состоит из 3 шагов:

  1. Load.
  2. Вашингтон
  3. Элюции.

KDS100 шприцевой насос (производство К. Д. Научные, Холлистон, Массачусетс) был использован для эксперимента и расход использовали 300 мкл / час для всех шагов.

Нагрузка

  1. Условие канал с хаотропных буфер (GuSCN *, гуанидиний тиоцианата) в течение 1-2 мин до начала эксперимента.
  2. Смешайте образца с хаотропных буфер в соотношении 1:1.
  3. Поток образец смеси через канал в течение 3 мин.

Мыть

  1. Вымойте канал с 70% этанолом в течение 2 мин.
  2. Вымойте канал со 100% этанола в течение 2 мин.

Элюировать

  1. Элюировать извлечения ДНК в Millipore воде в течение 3 мин. Сбор 15 мкл очищенной, ПЦР-готовый ДНК.

* GuSCN от Qiagen комплект (буфера RLT) был использован.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices. Lab Chip. 7, 876-882 (2007).
Изготовление Термопластичные микрожидкостных каналов
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bhattacharyya, A., Kulinski, D., Klapperich, C. Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels. J. Vis. Exp. (12), e664, doi:10.3791/664 (2008).More

Bhattacharyya, A., Kulinski, D., Klapperich, C. Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels. J. Vis. Exp. (12), e664, doi:10.3791/664 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter