Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma'nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir.

Abstract

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma'nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil kalite kontrol işlemleri sırasında ne proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir. Bu testte, kazein, bir substrat olarak davranır. Test proteaz kazeinin sindirir, amino asit olan tirozin ile birlikte diğer amino asitler ve peptit kurtuldu. Folin ve Fenol Ciocalteus ya da Folin Kullanıcı reaktif öncelikle, ölçülebilir ve spektrofotometre bir absorbans değeri olarak ölçülen bir mavi renkli kromofor üretmek için ücretsiz tirozin ile reaksiyona girer. Kazein salgılanır tirozin, daha kromoforlar proteaz aktivitesi oluşturulan ve güçlüdür. Tirozin bilinen miktarlarda FC reaktifi ile reaksiyona girerek mikromolden tirozin miktarı ile absorbans değişiklikleri ilişkilendirmek için oluşturulan bir standart eğri, proteaz aktivitesi tarafından oluşturulan absorbans değerleri karşılaştırılır. Standart eğrisinden, proteaz örnekleri aktivitesi açısından Üniteleri, kazein dakikada serbest tirozin benzerlerinin mikromolden miktarı tespit edilebilir.

Çince Bu makaleyi görüntülemek için buraya tıklayın

Protocol

Testin başlamadan önce, aşağıdaki reaktifler doğru hazırlanmış olduğundan emin olmanız gerekir:

  1. 50 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5. 11.4 mg / ml potasyum fosfat dibazik, arıtılmış su ve 1M HCl ile pH ayarlanması içinde trihidrat kullanarak hazırlayın. Bu çözüm, 37 ° C önceden yerleştirilmiş.
  2. Kazein 6.5 mg / ml 50 mM potasyum fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanan% 0,65 ağırlık / hacim kazein çözüm. Yavaş yavaş ° C yaklaşık 10 dakika boyunca homojen bir dağılım elde edilene kadar nazik karıştırma ile çözüm sıcaklığı 80-85 arttı. Bu çözüm kaynatmak için çok önemlidir. Gerekirse NaOH ve HCl ile pH ayarlanır.
  3. 6.1N bir stok 01:55 arıtılmış su ile seyreltilmesi ile hazırlanan 110 mM Trikloroasetik asit çözeltisi,. Trikloroasetik asit güçlü bir asit ve bakım ile ele alınmalıdır.
  4. 0.5 mM Folin & Ciolcaltea ya da proteaz aktivitesi ile doğrudan ilgili olacaktır ölçülebilir bir renk değişikliği oluşturmak için tirozin ile reaksiyona girer çözümdür Folin Fenol Reaktif. Folin Fenol Reaktif bir asittir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
  5. Anyhydrous sodyum karbonat 53 mg / ml saf su kullanılarak hazırlanan 500 mm Sodyum Karbonat çözüm.
    5mM Kalsiyum Asetat ile 10 mM Sodyum Asetat Tamponu, pH 7.5, 37 ° oluşan bir enzimin seyreltici çözüm ° C. Bu çözüm, katı proteaz örnekleri çözülür veya enzim çözümler sulandırmak için ne kullanın.
  6. 1.1 mM L-tirozin Standart stok solüsyonu. Arıtılmış su ve tirozin eriyene kadar hafifçe ısıtılır 0.2 mg / ml L-tirozin kullanılarak hazırlanmıştır. Kazein gibi, bu çözüm kaynatın. L-tirozin standart oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Bu çözüm, standart eğri daha seyreltilmiş olacaktır.
  7. Proteaz çözüm. Proteaz çözülür ve kullanmadan önce hemen, 6. adımda hazırlanan enzim seyreltici çözüm.

Gerekirse, önceden belirlenmiş bir aktivite 0.1-0.2 ünite / ml enzim seyreltici kullanılarak çözülür sağlam bir proteaz örnek, kullanın. Bu çözüm, kalite kontrol testi için bir pozitif kontrol ve enzim aktivitesini belirlemek için yapacağı hesaplamalar için doğrulama olarak hizmet vermektedir.

Proteaz Testi ve Standart Eğriler ayarlama

  1. Bu testte başlamak için, yaklaşık 15 ml tutun uygun şişeleri bulabilirsiniz. Test edilecek her bir enzim için, 4 flakon ihtiyaç vardır. Bir flakon, bir boş olarak kullanılan olacak ve diğer üç proteaz üç dilüsyonları tahlil aktivitesi için kullanılacak. Üç dilüsyonları birbirlerine karşı son hesaplamalar kontrol ederken yararlıdır.
    1. Dört şişeleri her set için% 0.65 kazein çözüm 5mls ekleyin. Onları 37 yaşında bir su banyosunda dengeye ° C, yaklaşık 5 dakika.
    2. Boş değil, test numune şişeleri üç test edilecektir enzim çözeltisi hacimleri değişen, ancak ekleyin. ° C tam on dakika dönen ve 37 inkübe karıştırın. Bu inkübasyon süresi sırasında proteaz aktivitesi ve tirozin dolaylı kurtuluş ölçülür ve test örnekleri arasında karşılaştırıldı ne olacak.
  2. Bu 10 dakika inkübasyondan sonra, reaksiyon durdurmak için her tüpe 5 ml TCA reaktif ekleyin. Daha sonra, her tüpe bile boş, her tüp enzim çözüm son hacmi 1 ml enzim çözeltisi uygun bir hacim kazandırmak. Bu enzim kendisi absorbans değeri hesaba ve her tüp nihai hacmi eşit olmasını sağlamak için yapılır. 37 çözümler ° C'de 30 dakika için.


    Bu 30 dakikalık inkübasyon sırasında, tirozin standart dilüsyonları kurmak isteyebilirsiniz. 8 mls kolayca tutabilir 6 dram şişeleri (dram şişeleri polipropilen tüpler ile ikame edilebilir) kullanın. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 altı şişeleri, mls aşağıdaki hacimleri ile 1.1 mM tirozin standart stok çözümleri ekleyin. Tirozin için herhangi bir standart boş katmayın. Alt standartları biraz renk değişikliği verecektir saf test örnekleri için gerekli olabilir. Tirozin standart solüsyonu ilave edildikten sonra, 2 ml hacmi getirmek için her standartlara uygun bir hacimde saf su ekleyin.
  3. 30 dakika inkübasyondan sonra, test çözümleri her filtre ve boş bir 0.45 um polyethersulfone şırınga filtre kullanarak. Filtrasyon örneklerinden herhangi bir Çözünmezlerin kaldırmak için gereklidir.
    1. En az 8 ml tutabilir 4 dram şişeleri filtrasyon 2 ml test örnekleri ve boş süzüntü ekleyin. Aynı tip standartlar hazırlanmıştır flakon kullanılabilir.
    2. Tüm standartları ve standart boş içeren flakon, sodyum karbonat 5mls ekleyin. En iyi sonuç için, hemen ardından Folin reaktifi 1 ml ekleyin.
    3. Folin reaktif ilavesi ile oluşturulan herhangi bir pH düşüşü düzenleyen sodyum karbonat ekleyin.
    4. Test örnekleri ve tes sodyum karbonatt boş. Bu çözümler, sodyum karbonat ilave edildikten sonra bulutlu olur. Öncelikle ücretsiz tirozin tepki vereceğini Folin reaktifi ekleyin.
    5. Dönen tarafından dramını şişeleri karıştırın ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    Bu inkübasyondan sonra, standartlara tirozin eklendi miktarı ile korele bir tonlama renk olduğunu fark; tirozin yüksek konsantrasyonlarda karanlık görünen. Ayrıca test örnekleri içinde kayda değer bir renk değişikliği fark edebilirsiniz. Bu çözümlerin 2mls uygun küvetler içine 0.45 um polyethersulfone şırınga filtresi kullanarak filtrelenir. Tahlil yapılır Şimdi, bizim absorbans değerleri kaydetmek için spektrofotometre devam edebilirsiniz.

Absorbans Ölçüm ve Enzim Aktivitesi Hesaplanması

  1. Örneklerin absorbansı 660nm dalga boyunda bir spektrofotometre ile ölçülür. Işık yolu 1 cm olarak ayarlanır. Standartları, standart boş, farklı test örnekleri ve test boş absorbans değerleri kaydedin. Bir kez tüm verileri toplandı, standart eğri oluşturulabilir. Standart ve standart boş arasındaki absorbans eğrisi oluşturmak için, fark hesaplanması gerekmektedir. Bu standart çözümler tirozin miktarı atfedilebilecek absorbans değerdir. Bu basit bir hesaplama sonra, standart eğri, Y ekseni üzerinde standartların absorbans değişikliği, X ekseni üzerinde 5 standartlarını her mikromolden miktarına karşı komplo bir grafik programını kullanarak oluşturabilirsiniz.

    Tirozin Standart Hacmi uMoles Tyrosine
    0,05 0,055
    0,10 0,111
    0,20 0,221
    0,40 0,442
    0,50 0,553
  2. Veri noktaları girildikten sonra, en uygun ve ilgili eğim denklemi bir çizgi oluşturur.


    Test örneği absorbans ve test boş absorbans arasındaki fark hesaplanarak test örnekleri absorbans değişikliğini bulun. Eğim denklemi içine bir test örnekleri için absorbans değeri takma ve çözme bu özel proteolitik reaksiyon sırasında tirozin kurtarılmış mikromolden neden olacaktır. / Ml başına birim enzim aktivitesi elde etmek için, aşağıdaki hesaplama gerçekleştirin:


    (Tirozin umole eşdeğerleri piyasaya) x (11)
    Birimler / ml Enzim = __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    Testin 11 = Toplam hacmi (mililitre)
    Testin 10 = Zaman (dakika) Birim tanımını başına
    1 = Enzim enzim hacmi (mililitre)
    Kolorimetrik belirlenmesi kullanılan 2 = hacmi (mililitre)


    Eğim denklemi elde mikromolden tirozin eşdeğerleri piyasaya numarasını alın ve bizim durumumuzda 11mls olan mls, testin toplam hacmi ile çarpın. Kolorimetrik saptanmasında kullanılan mililitre hacmi, bu değeri diğer üç miktarlarda Böl: 10 dakika boyunca koştu tahlil, zaman, hacim, tayininde kullanılan enzim, (Kullanıcı 1ml kullanmak izin) çeşitli olduğu. sizin küvet göre farklılık gösterir. Biz mls 2 kullanılır.
  3. Tirozin mikromolden "birim" olarak adlandırılan proteaz aktivitesi dakika verim ölçümü zaman bölünür. Biz enzim aktivitesi ünite / ml açısından bir ölçüm bırakarak, pay ve payda hacim ölçümü için birimler iptal edebilirsiniz. , Enzim seyreltici seyreltilmiş sağlam bir proteaz örnek aktivitesini belirlemek amacıyla, ünite / mg açısından aktivitesi ile bize bırakarak, mg / ml. Başlangıçta bu testte kullanılan katı konsantrasyonu ünite / ml faaliyet bölmek .


    Birimler / ml enzim
    Birimler / mg'lık katı = _____________________

    mg katı / ml enzim

Discussion

Biz sadece Sigma'nın evrensel proteaz aktivitesi tahlil kullanarak proteaz aktivitesi analiz nasıl gösterilir ettik. Buna ek olarak, bu testte deneyler için onları almadan önce proteazlar tam aktivite olduğunu tespit ettik sağlamak için yararlıdır. Görüldüğü gibi, bu işlemi yaparken, yavaş ve onları kaynatmak için kazein ve tirozin çözümler ısı hatırlamak için büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, hem kendi standartları ve sahip olduğunuz her test örneği için farklı boşlukları hazırlamak için önemlidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter