20. yüzyılın başlarında, Frederick Griffith adlı bir İngiliz bakteriyolog, zatürreye neden olan bakteri Streptococcus pneumoniae ile çalışıyordu. İki farklı suş kullanarak basit bir deney yaptı. Bir suş, oluşturduğu kolonilerin veya kümelerin pürüzsüz görünmesini sağlayan ve aynı zamanda onu öldürücü veya zararlı hale getiren koruyucu bir kapsül nedeniyle S suşu olarak bilinir. İkincisi, bakterilerin koruyucu kapsülden yoksun bir versiyonu olan R suşu idi, kolonilere pürüzlü bir görünüm veriyor ve onu öldürücü olmayan hale getiriyordu.
İlk olarak, Griffith S suşu bakterilerinin bir kısmını aldı ve ısıttı ve S suşunun ısıyla öldürülmüş bir versiyonunu üretti. Sonra birkaç fare topladı ve onları dört gruba ayırdı. İlk gruba virülan S suşu, ikincisine ise virülan olmayan R suşu enjekte etti. Üçüncü gruba ısıyla öldürülen S suşu ile doz verdi ve son olarak, ısıyla öldürülen S suşu ile R suşu birleştirildi ve bu karışımı dördüncü gruba enjekte etti. Beklendiği gibi, ilk gruptaki fareler öldü ve ikinci ve üçüncü gruptakiler yaşadı. Ancak Griffith'i şaşırtan bir şekilde, son gruptaki fareler de öldü.
Çalışmasını 1928'de yayınladığında, daha önce öldürücü olmayan suşun ölümcül hale gelmesine izin veren altta yatan bir dönüşüm ilkesinin varlığını tahmin ettiği için bu gizemli süreç dönüşümü adını verdi. Daha sonra, 1943'te Avert, MacLeod ve McCarty, bu dönüştürücü ilkenin muhtemelen desoksiribonükleik asit veya şu anda kalıtım materyali olduğunu bildiğimiz DNA olduğunu bildirdi. Esasen Griffith'in deneyinde olan şey, bakteriler birleştiğinde, bir miktar DNA'nın ısıyla öldürülen S suşundan R suş hücrelerine sızması, bu öldürücü olmayan bakterileri dönüştürmesi ve koruyucu kapsülü yapmak için bilgiyi aktarması, R türünü öldürücü bir suşa dönüştürmesiydi, şimdi dördüncü gruptaki hayvanları öldürebilir.
Günümüze hızlı bir şekilde ilerleyin ve bilim adamları, bakteri E. coli ve plazmit adı verilen küçük, dairesel DNA halkalarını kullanarak bakteriyel dönüşümü incelemek için çok daha basit bir yol geliştirdiler. Genellikle, transformasyon deneylerinde kullanılan plazmit, antibiyotik direnci gibi özel bir işlev için bir gen içerir. E. coli, dönüşüm için mükemmel bir konudur, çünkü çevreden DNA alma yeteneği olan yeterlilik adı verilen bir özellik gösterebilirler. Esasen bu, bir kimyasal veya elektrik veya ısı şoku gibi belirli çevresel koşullar altında, E. coli'nin hücre duvarının geçici olarak geçirgen hale gelebileceği ve DNA'nın çevreden alınmasına izin verebileceği anlamına gelir. Plazmid E. coli'nin içine girdikten sonra, ya yeni konakçı hücresinin sitoplazmasında takılabilir ve genomun yanında nesiller boyunca kopyalanabilir ve eksprese edilebilir ya da kendisini konakçının genomuna tamamen dahil edebilir. Bakteriler herhangi bir noktada plazmidi kaybederse, hücre antibiyotik direncini de kaybeder ve bu nedenle bilim adamları, hayatta kalanların sadece ilgilenilen plazmidi içerenler olduğundan emin olmak için bakterileri antibiyotik içeren bir ortamda büyütürler.
Bu laboratuvarda, steril mikrobiyolojik teknikleri uygularken, E. coli hücrelerini antibiyotik direnç geni içeren bir plazmit ile nasıl dönüştüreceğinizi öğreneceksiniz.
Arka plan
20.yüzyılın başlarında, pnömoni bulaşıcı hastalık ölümlerinin büyük bir kısmından sorumluydu1. Pnömoniye karşı etkili bir aşı geliştirmek için Frederick Griffith, Streptococcus pneumoniae'nin iki farklı suşunu incelemeye başladı: pürüzlü bir görünüme sahip virülan olmayan bir suş (R-suşu) ve bir dış polisakkarit kapsülü2 nedeniyle pürüzsüz bir görünüme sahip virülan bir suş (S-suş). S-suşu bakterilerinin bu dış tabakası, konakçı bağışıklık sistemine dayanmalarını sağladı ve sonunda yaşamı tehdit eden bir hastalığa yol açtı. Griffith, farelere her iki suştan da ısıyla öldürülen bakterileri ayrı ayrı enjekte ettiğinde, fareler yaşadı. Bununla birlikte, farelere ısıyla öldürülen S-suşu ile canlı R-suşu'nun bir kombinasyonunu enjekte ettiğinde, fareleröldü 2. Kombinasyon enjekte edilen ölü farelerden elde edilen örnekleri analiz ettiğinde, canlı S-suşu bakterilerinin mevcut olduğunu gözlemledi. 1928'de Griffith, öldürücü olmayan bakterileri öldürücü suşa dönüştürmek için bir "dönüşüm" sürecinin meydana gelmiş olması gerektiğini belirtti. Bakteriyel dönüşümün bilinen ilk keşfi olan keşfi, genetik mühendisliğinde önemli bir araç olan dönüşüm3'ün geliştirilmesinin yolunu açtı.
Dönüşüm, çevreden DNA alımına bağlı olarak bir hücrede meydana gelen genetik değişimdir. Griffith'in deneyinde, S-suşu bakterilerinin koruyucu polisakkarit kaplamasını kodlayan DNA, ısı şokundan parçalanmadı ve R-suşuna sokuldu, bu da R-suşunun farenin bağışıklık sistemini atlamasına izin verdi. Bu süreç vahşi doğada organizmalar ve hatta farklı türler arasında sürekli olarak gerçekleşirken, bilim adamları bakterileri araştırma amacıyla laboratuvar ortamlarında dönüştürürler4.
Plazmitler Kullanılarak Bakteriyel Transformasyon
Bakteriler, eksojen genetik materyali genomlarına kolayca alabildikleri ve hızlı bir şekilde çoğaltabildikleri için transformasyon için ideal organizmalardır3,5. Bir dairesel kromozoma ve sitoplazma içinde plazmit adı verilen çok sayıda küçük dairesel çift sarmallı DNA parçasına sahiptirler. Bu plazmitler, kromozomal DNA'dan bağımsız olarak çoğalabilir ve genellikle antibiyotiklere direnç gibi belirli fonksiyonel faydalar sağlar6,7. Bakteriler, doğal ortamlarında, konjugasyon8 adı verilen bir işlemle diğer bakterilerden plazmitleri alarak "bakteri dönüşümüne" uğrarlar. Dahası, çoğaldıklarında, soylarının her biri yeni plazmitin bir kopyasını alır.
Deneysel amaçlar için kullanılan plazmitlere plazmit vektörleri denir. Bir laboratuvar ortamında, bilim adamları, DNA parçalarını bir plazmit vektörüne yerleştirerek yaklaşık 5.000-10.000 baz çifti uzunluğunda "rekombinant plazmitler" oluşturabilirler. Bu rekombinant plazmitler genellikle belirli bileşenlere sahiptir: bir replikasyon kökeni (ORI), bir antibiyotik direnç geni, bir çoklu klonlama bölgesi, bir promotör, bir seçim belirteci ve ilgilenilen gen. Çoğaltmanın kaynağı, çoğaltmanın başladığı yerdir. Antibiyotik direnç geni, plazmidi alan bakterilerin, belirli bir antibiyotik ilacın varlığında plakalar üzerinde hayatta kalmasını sağlar. Plazmitler nispeten küçük DNA parçaları olmasına rağmen, bilim adamlarının plazmidin hücre zarından nüfuz etmesini sağlamak için konakçı hücreleri tedavi etmeleri gerekir. Bu nedenle, dönüşümün verimliliği doğrudan konak zarının gözenekliliği ile ilgilidir. Yaygın bir yaklaşım, bir kalsiyum klorür çözeltisi9 ile muamele edilmiş bakterilere ısı şoku vermektir. Plazmidi içermeyen bakteriler dönüşmez ve bu nedenle plaka üzerinde hayatta kalmak ve görünür olmak için hiçbir direnci yoktur. Çoklu klonlama bölgeleri, ilgilenilen genin yerleştirilebileceği ve bağlanabileceği plazmiti kesmek için kısıtlama enzimleri için bölgeler içererek DNA eklemesine yardımcı olur. Promotör, ilgilenilen genin transkripsiyonunu yönlendirir. Genellikle yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir floresan proteini olan bir işaretleyici ile etiketlenir veya ek bir antibiyotik direnç geni olabilir. Antibiyotik direnç geni ve diğer seçim belirteçleri, toplanan bakterilerin ilgilenilen plazmidi içerip içermediğini belirlememize yardımcı olur.
Uygulama
Etkili dönüşüm yöntemleri, bilim adamlarının genleri ve gen ürünlerini izole etmelerini ve profillemelerini sağladı ve etkili ilaçların geliştirilmesi, genetiği değiştirilmiş ürünlerin üretilmesi ve gelişmiş teşhis araçları gibi yaşam bilimleri ve tıpta birçok ilerlemeye yol açtı10. Ayrıca teknolojik gelişmelerle birlikte yeni dönüşüm yöntemleri ortaya çıkmıştır. Örneğin, Ağ Geçidi Klonlama, birden fazla DNA parçasının farklı vektörlere yerleştirilmesine ve ayrıca DNA dizilerinin plazmitler11 arasında transferine izin verir. Ayrıca, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas9, genomdaki nükleotidleri doğrudan değiştiren ve plazmitlerin12 kullanılmasını gerektirmeyen bir gen düzenleme tekniğidir. Dönüşümden sonra, araştırmacılar genellikle ilgilenilen geni ve ürünlerini izole eder ve profilini çıkarır. Daha sonra, tüm genetik klonlama süreci yeni bir genetik manipülasyon alanı açtı. Genetik klonlama sayesinde, araştırmacılar diyabet hastalarını tedavi etmek için insülin gibi büyük miktarlarda spesifik insan proteinleri üretmek için bakterileri manipüle edebilirler10. Klonlama, günümüz tarımında da büyük önem kazanmıştır. Genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO), genetik klonlama ve bakteri dönüşümünün doğrudan bir sonucudur10. Örneğin, bilim adamları, gıda üretimini artırmak ve gübre kullanımını azaltmak için genomlarına dahil edilen azot bağlayıcı genlerle genetiği değiştirilmiş ürünler üretmek için çalışıyorlar, böylece gübrelerin ekonomik ve çevresel etkilerini azaltıyorlar13. Özetle, bakteriyel dönüşüm, günümüz biyoteknolojisinin ilk adımı ve gelecekteki araştırma keşiflerinin temelidir.
Başvuru
- GL, Armstrong, LA, Conn ve RW, Pinner. 20. Yüzyılda Amerika Birleşik Devletleri'nde Bulaşıcı Hastalık Ölümlerindeki Eğilimler. JAMA. 1999, Cilt 281, 1 (61-66).
- F, Griffith. Pnömokok Tiplerinin Önemi. J Hyg (Londra). . 1928 , 2 (113-59).
- Lorenz, MG ve Wackernagel, F. Çevrede doğal genetik dönüşüm ile bakteriyel gen transferi. Mikrobiyol Rev. . 1994 Eylül;, Cilt 58, 3: (563-602).
- S, Domingues ve ark. Doğal Dönüşüm, Bakteri Türleri Arasında Transpozon, İntegron ve Gen Kasetleri Transferini Kolaylaştırır. PLOS Patojenleri. 2012, 8(8): e1002837.
- Dubnau, D. Bakterilerde DNA alımı. Annu Rev Mikrobiyol. . 1999, 53: (217-44).
- Güneş, G del, et al. Dairesel bakteri plazmitlerinin replikasyonu ve kontrolü. Mikrobiyol Mol Biol Rev. . 1998 , Cilt 62, 2: (434-64).
- Bennett, Başbakan. Plazmid kodlu antibiyotik direnci: bakterilerde antibiyotik direnç genlerinin edinilmesi ve transferi. Br J Farmakol. 2008 , Cilt 153, S1: (S347-S357).
- MLlosa ve ark. Bakteriyel konjugasyon: DNA taşınması için iki aşamalı bir mekanizma. Mol Mikrobiyol. 2002 Temmuz;, Cilt 45, 1: (1-8).
- Roychoudhury, A, Basu, S ve Sengupta, DN. İki yaygın plazmit vektörü kullanılarak E. coli'nin farklı transformasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı verimliliklerinin analizi. Hint J Biochem Biyofiz. .2009 , Cilt 46, 5: (395-400).
- Han, S, et al. Yaşamı İyileştirmede Rekombinant DNA Teknolojisinin Rolü. I. nt J Genomik. . 2016, 2016:2405954.
- Marsischky, G ve LaBaer, J. Birçok klona giden birçok yol: Yüksek verimli klonlama yöntemlerine karşılaştırmalı bir bakış. Genom Arş. 2004, Cilt 14, 2020-28.
- Doudna, JA ve Charpentie, E. CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliğinin yeni sınırı. bilim. 2014, Cilt 346, 6213-1258096.
- İyi, A. Azot sabitleyici bitkilere doğru. bilim. 2018, Cilt 359, 6378: 869-70.
20. yüzyılın başlarında, Frederick Griffith adlı bir İngiliz bakteriyolog, zatürreye neden olan bakteri Streptococcus pneumoniae ile çalışıyordu. İki farklı suş kullanarak basit bir deney yaptı. Bir suş, oluşturduğu kolonilerin veya kümelerin pürüzsüz görünmesini sağlayan ve aynı zamanda onu öldürücü veya zararlı hale getiren koruyucu bir kapsül nedeniyle S suşu olarak bilinir. İkincisi, bakterilerin koruyucu kapsülden yoksun bir versiyonu olan R suşu idi, kolonilere pürüzlü bir görünüm veriyor ve onu öldürücü olmayan hale getiriyordu.
İlk olarak, Griffith S suşu bakterilerinin bir kısmını aldı ve ısıttı ve S suşunun ısıyla öldürülmüş bir versiyonunu üretti. Sonra birkaç fare topladı ve onları dört gruba ayırdı. İlk gruba virülan S suşu, ikincisine ise virülan olmayan R suşu enjekte etti. Üçüncü gruba ısıyla öldürülen S suşu ile doz verdi ve son olarak, ısıyla öldürülen S suşu ile R suşu birleştirildi ve bu karışımı dördüncü gruba enjekte etti. Beklendiği gibi, ilk gruptaki fareler öldü ve ikinci ve üçüncü gruptakiler yaşadı. Ancak Griffith'i şaşırtan bir şekilde, son gruptaki fareler de öldü.
Çalışmasını 1928'de yayınladığında, daha önce öldürücü olmayan suşun ölümcül hale gelmesine izin veren altta yatan bir dönüşüm ilkesinin varlığını tahmin ettiği için bu gizemli süreç dönüşümü adını verdi. Daha sonra, 1943'te Avert, MacLeod ve McCarty, bu dönüştürücü ilkenin muhtemelen desoksiribonükleik asit veya şu anda kalıtım materyali olduğunu bildiğimiz DNA olduğunu bildirdi. Esasen Griffith'in deneyinde olan şey, bakteriler birleştiğinde, bir miktar DNA'nın ısıyla öldürülen S suşundan R suş hücrelerine sızması, bu öldürücü olmayan bakterileri dönüştürmesi ve koruyucu kapsülü yapmak için bilgiyi aktarması, R türünü öldürücü bir suşa dönüştürmesiydi, şimdi dördüncü gruptaki hayvanları öldürebilir.
Günümüze hızlı bir şekilde ilerleyin ve bilim adamları, bakteri E. coli ve plazmit adı verilen küçük, dairesel DNA halkalarını kullanarak bakteriyel dönüşümü incelemek için çok daha basit bir yol geliştirdiler. Genellikle, transformasyon deneylerinde kullanılan plazmit, antibiyotik direnci gibi özel bir işlev için bir gen içerir. E. coli, dönüşüm için mükemmel bir konudur, çünkü çevreden DNA alma yeteneği olan yeterlilik adı verilen bir özellik gösterebilirler. Esasen bu, bir kimyasal veya elektrik veya ısı şoku gibi belirli çevresel koşullar altında, E. coli'nin hücre duvarının geçici olarak geçirgen hale gelebileceği ve DNA'nın çevreden alınmasına izin verebileceği anlamına gelir. Plazmid E. coli'nin içine girdikten sonra, ya yeni konakçı hücresinin sitoplazmasında takılabilir ve genomun yanında nesiller boyunca kopyalanabilir ve eksprese edilebilir ya da kendisini konakçının genomuna tamamen dahil edebilir. Bakteriler herhangi bir noktada plazmidi kaybederse, hücre antibiyotik direncini de kaybeder ve bu nedenle bilim adamları, hayatta kalanların sadece ilgilenilen plazmidi içerenler olduğundan emin olmak için bakterileri antibiyotik içeren bir ortamda büyütürler.
Bu laboratuvarda, steril mikrobiyolojik teknikleri uygularken, E. coli hücrelerini antibiyotik direnç geni içeren bir plazmit ile nasıl dönüştüreceğinizi öğreneceksiniz.
20. yüzyılın başlarında, Frederick Griffith adlı bir İngiliz bakteriyolog, zatürreye neden olan bakteri Streptococcus pneumoniae ile çalışıyordu. İki farklı suş kullanarak basit bir deney yaptı. Bir suş, oluşturduğu kolonilerin veya kümelerin pürüzsüz görünmesini sağlayan ve aynı zamanda onu öldürücü veya zararlı hale getiren koruyucu bir kapsül nedeniyle S suşu olarak bilinir. İkincisi, bakterilerin koruyucu kapsülden yoksun bir versiyonu olan R suşu idi, kolonilere pürüzlü bir görünüm veriyor ve onu öldürücü olmayan hale getiriyordu.
İlk olarak, Griffith S suşu bakterilerinin bir kısmını aldı ve ısıttı ve S suşunun ısıyla öldürülmüş bir versiyonunu üretti. Sonra birkaç fare topladı ve onları dört gruba ayırdı. İlk gruba virülan S suşu, ikincisine ise virülan olmayan R suşu enjekte etti. Üçüncü gruba ısıyla öldürülen S suşu ile doz verdi ve son olarak, ısıyla öldürülen S suşu ile R suşu birleştirildi ve bu karışımı dördüncü gruba enjekte etti. Beklendiği gibi, ilk gruptaki fareler öldü ve ikinci ve üçüncü gruptakiler yaşadı. Ancak Griffith'i şaşırtan bir şekilde, son gruptaki fareler de öldü.
Çalışmasını 1928'de yayınladığında, daha önce öldürücü olmayan suşun ölümcül hale gelmesine izin veren altta yatan bir dönüşüm ilkesinin varlığını tahmin ettiği için bu gizemli süreç dönüşümü adını verdi. Daha sonra, 1943'te Avert, MacLeod ve McCarty, bu dönüştürücü ilkenin muhtemelen desoksiribonükleik asit veya şu anda kalıtım materyali olduğunu bildiğimiz DNA olduğunu bildirdi. Esasen Griffith'in deneyinde olan şey, bakteriler birleştiğinde, bir miktar DNA'nın ısıyla öldürülen S suşundan R suş hücrelerine sızması, bu öldürücü olmayan bakterileri dönüştürmesi ve koruyucu kapsülü yapmak için bilgiyi aktarması, R türünü öldürücü bir suşa dönüştürmesiydi, şimdi dördüncü gruptaki hayvanları öldürebilir.
Günümüze hızlı bir şekilde ilerleyin ve bilim adamları, bakteri E. coli ve plazmit adı verilen küçük, dairesel DNA halkalarını kullanarak bakteriyel dönüşümü incelemek için çok daha basit bir yol geliştirdiler. Genellikle, transformasyon deneylerinde kullanılan plazmit, antibiyotik direnci gibi özel bir işlev için bir gen içerir. E. coli, dönüşüm için mükemmel bir konudur, çünkü çevreden DNA alma yeteneği olan yeterlilik adı verilen bir özellik gösterebilirler. Esasen bu, bir kimyasal veya elektrik veya ısı şoku gibi belirli çevresel koşullar altında, E. coli'nin hücre duvarının geçici olarak geçirgen hale gelebileceği ve DNA'nın çevreden alınmasına izin verebileceği anlamına gelir. Plazmid E. coli'nin içine girdikten sonra, ya yeni konakçı hücresinin sitoplazmasında takılabilir ve genomun yanında nesiller boyunca kopyalanabilir ve eksprese edilebilir ya da kendisini konakçının genomuna tamamen dahil edebilir. Bakteriler herhangi bir noktada plazmidi kaybederse, hücre antibiyotik direncini de kaybeder ve bu nedenle bilim adamları, hayatta kalanların sadece ilgilenilen plazmidi içerenler olduğundan emin olmak için bakterileri antibiyotik içeren bir ortamda büyütürler.
Bu laboratuvarda, steril mikrobiyolojik teknikleri uygularken, E. coli hücrelerini antibiyotik direnç geni içeren bir plazmit ile nasıl dönüştüreceğinizi öğreneceksiniz.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved