$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Floresans, bir maddenin belirli bir dalga boyunda ışığı soğurup başka bir dalga boyunda ışık yaymasıyla gerçekleşen bir fenomendir. Floresans, daha yüksek ve daha kararsız bir enerji durumuna uyarılmış bir elektronun, temel durumuna geri dönerken bir ışık fotonu yaymasıyla meydana gelir. Elektronu daha yüksek bir enerji durumuna taşıyan, yani uyarılmadan sorumlu olan ışık, daha uzun dalga boyuna, daha düşük enerjiye ve farklı bir renge sahip olan floresans emisyonuna göre daha kısa dalga boyuna ve daha yüksek enerjiye sahiptir.
Floresans mikroskobu, ışık mikroskobunun büyütme özelliklerini, floresan kimyasal bileşikler olan floroforların uyarılmasını ve emisyonlarının tespitini sağlayan floresans teknolojisi ile birleştirir. Floresans mikroskobu sayesinde bilim insanları, dokular içindeki belirli hücre tiplerinin veya hücreler içindeki moleküllerin konumlarını gözlemleyebilirler.
Floresan mikroskobun ana bileşenleri, geleneksel ışık mikroskobuyla büyük ölçüde örtüşür. Ancak temel iki fark, ışık kaynağının türü ve özel filtre elemanlarının kullanımıdır.
Floresan mikroskobu, burada gösterilen xenon veya cıva ark lambası gibi çok güçlü bir ışık kaynağı gerektirir. Cıva ark lambasından yayılan ışık, çoğu akkor lambadan 10-100 kat daha parlaktır ve ultraviyole'den kızılötesine kadar geniş bir dalga boyu aralığında ışık sağlar. Bu yüksek güçlü ışık kaynağı, floresan mikroskop düzeneğinin en tehlikeli kısmıdır; çünkü filtresiz ışığa doğrudan bakmak retinalarınıza ciddi şekilde zarar verebilir ve ampullerin yanlış kullanımı bunların patlamasına neden olabilir.
Floresan mikroskobinin arkasındaki prensip basittir. Işık ark lambasından çıktığında, uyarım dalga boyunu seçen bir uyarıcı filtreden geçirilir.
Bu ışık, yalnızca uyarım dalga boyundaki ışığı yansıtacak şekilde tasarlanmış, dikroik ayna adı verilen özel bir ayna tarafından numuneye doğru yansıtılır. Yansıyan ışık, objektiften geçerek floresan örneğe odaklanır. Örnekten gelen emisyonlar ise sırasıyla tekrar objektiften geçer -burada görüntünün büyütülmesi gerçekleşir- ve ardından dikroik aynadan geçer.
Bu ışık, emisyon dalga boyunu seçen ve ark lambasından veya mikroskop bileşenlerinden yansıyan diğer kaynaklardan gelen kirletici ışıkları filtreleyen bariyer filtresi tarafından filtrelenir. Son olarak, filtrelenen floresan emisyonu, görüntünün dijitalleştirilebileceği bir dedektöre gönderilir veya optik gözlem için okülerle iletilir.
Uyarıcı filtre, dikroik ayna ve bariyer filtresi, filtre küpü olarak bilinen bir bileşen şeklinde bir araya getirilebilir. Örnek incelemesi sırasında uyarım dalga boyunu değiştirmek için farklı filtre küpleri değiştirilebilir ve uyarım yoğunluğunu değiştirmek için bir dizi diyafram kullanılabilir.
Floresan mikroskopi uygulamalarına gelince, florofor en az mikroskobun kendisi kadar önemli olabilir ve görüntülenen florofor türü, kullanılan uyarım dalga boyunu ve tespit edilen emisyon dalga boyunu belirler. Uyarım dalga boyları, florofor tarafından absorbe edilebilen ve onun uyarılmış bir duruma geçmesine neden olan dar bir enerji aralığını içerir. Uyarıldıktan sonra, düşük enerji durumuna geri dönüşleri temsil eden geniş bir emisyon aralığı mümkün olur ve bu da bir emisyon spektrumu ile sonuçlanır.
Absorpsiyon veya uyarım eğrisinin tepe noktası ile emisyon eğrisinin tepe noktası arasındaki fark, Stokes Kayması olarak bilinir. Bu kaymadaki mesafe ne kadar büyükse, iki farklı dalga boyunu ayırmak o kadar kolay olur. Ayrıca, arka planı azaltmak ve görüntü kalitesini artırmak için çakışan herhangi bir spektrumun filtre küpü bileşenleri tarafından giderilmesi gerekir.
Floroforun uzun süre uyarılmaya maruz kalması, floresansın zayıflaması veya kaybı olan fotobeyazlamaya (photobleaching) neden olur. Fotobeyazlamayı azaltmak için lam üzerine solma önleyici (anti-fade) bir kapatma medyumu ekleyebilir ve kenarları oje ile mühürleyebilirsiniz. Lam, görüntüleme yapılmadığı zamanlarda ayrıca karanlıkta tutulmalıdır.
Floresan görüntülemeye başlamak için ksenon veya cıva ışık kaynağını açın ve sabit aydınlatmaya ulaşması için 15 dakikaya kadar ısınmasına izin verin.
Ardından, örneğinizi sahneye yerleştirin ve sabitleyin. Daha sonra, mikroskobunuzun beyaz ışık kaynağını açın. Kaba ve ince odaklama düğmelerini ayarlayarak en düşük büyütmeli objektif ile örneğinize odaklanın. Ardından, ilgi alanınızı bulmak için sahne ayar düğmelerini kullanın.
Sonrasında, arka planı azaltmak için beyaz ışık kaynağını ve gereksiz oda ışıklarını kapatın.
Görüntülediğiniz boya için doğru filtre küpünü seçin ve örneğinizi aydınlatmak için dekansörü açın.
Son olarak, ince odak ayarlarını yapın ve çıkış ışığını görüntüleme kamerasına yönlendirin. Kullanılan her farklı florofor veya floresan boya için pozlama süresinde ayarlamalar yapmanız gerekecektir. Ancak, farklı örnekler üzerindeki aynı boyaya sahip özellikleri karşılaştırırken pozlama süresini sabit tutmak önemlidir.
Aynı örnek üzerindeki birden fazla boyayı görüntülemek için, filtre küpünü her bir florofora uygun şekilde değiştirin ve yeni görüntüyü kaydedin.
Örnekteki her bir boya görüntülendikten sonra, bireysel görüntüler üst üste bindirilebilir ve birleştirilebilir.
Birçok farklı deney türü floresan mikroskobundan yararlanabilir ve farklı türde floroforlar içerebilir. Floresan mikroskobunun en yaygın uygulamalarından biri, floresan bileşiklere bağlanmış veya bunlarla “konjug edilmiş” antikorlarla işaretlenmiş proteinlerin görüntülenmesidir. Burada, leptospiral yüzey proteinlerine karşı bir antikor, uyarıldığında yeşil floresan yayan alexafluor-488 ile konjug edilmiş bir sekonder antikor kullanılarak tespit edilmiştir.
Floresan ile belirli bir özelliği vurgulamanın bir başka yolu da, yeşil floresan protein veya GFP gibi bir floresan proteinin kodunu bir organizmanın DNA'sına entegre etmektir. GFP geni başlangıçta denizanasından izole edilmiştir ve kültürlenmiş hücreler tarafından belirli tetikleyicilere yanıt olarak veya bu görüntüde parladığı görülen tümör hücreleri gibi belirli bir hücre tipinin parçası olarak eksprese edilebilir veya üretilebilir.
Floresan görüntülemenin bir başka uygulaması da, burada görülen F-actin ağı gibi floresanla işaretlenmiş makromoleküler düzenekleri kullanarak, bu önemlile sitoskelet proteininin hareketini ve turnover kinetiğini inceleyen bir teknoloji olan Floresan Benek Mikroskobisi'dir.
Fotobeyazlamadan sonra floresan geri kazanımı veya FRAP olarak bilinen gelişmiş bir teknik, floresanla işaretlenmiş moleküllerin fotobeyazlamış bölgeye geri difüzyon hızını izlemek amacıyla, örneğin küçük bir bölgesinin kasıtlı olarak fotobeyazlatılmasıyla gerçekleştirilir.
JoVE'nin Floresans Mikroskobisiye giriş videosunu izlediniz.
Bu videoda floresans kavramını, floresans mikroskobisinin ışık mikroskobisinden nasıl ayrıldığını ve mikroskop aracılığıyla nasıl floresan görüntü alınacağını öğrendik. Ayrıca floresans kullanan bazı temel ve ileri düzey uygulamalar hakkında bilgi edindik. İzlediğiniz için teşekkürler ve unutmayın, fotobleyking (fotobeleyme) dişlerinizde harika görünse de örnekleriniz için pek iyi değildir.
