Sitogenetik

Sitogenetik, kromozomların yapısı ve özelliklerinin yanı sıra hücre bölünmesi sırasındaki davranışları ve kalıtımdaki rollerinin incelenmesidir. DNA ve onunla ilişkili proteinlerin bir molekülü olan bir kromozom, boyalar ve problar yardımıyla mikroskop altında gözlemlenebilir. Bu tür gözlemler, genellikle hastalıklar ve bozukluklarla ilişkili olan kromozom yapısı ve sayısındaki kusurları tespit etmek için güçlü bir yaklaşımdır.

Bu video, floresan in situ hibridizasyon olarak bilinen belirli kromozom özelliklerini vurgulamak için yaygın olarak kullanılan bir teknik için bir protokol olan sitogenetik ilkelerini ve bu tekniğin bazı uygulamalarını kapsayacaktır.

Sitogenetiğin önemini ve bu alandaki bazı klasik ve modern tekniklerin arkasındaki ilkeleri tartışarak başlayalım.

Sitogenetik, bir hücrenin "karyotip" olarak bilinen kromozom yapısının ve sayısının doğrudan gözlemlenmesini gerektirir. Anöploidi olarak adlandırılan normal diploid veya eşleştirilmiş kromozom sayısından sapmaları ve kromozom yapısındaki kusurları tespit etmek için kullanılabilir.

Birçok hastalık ve bozukluk kromozomal anormalliklerden kaynaklanır. Örneğin, kromozom 9 ve 22'nin parçaları arasındaki karşılıklı translokasyondan kaynaklanan Philadelphia kromozomu, kronik miyeloid lösemi ile ilişkilidir. Başka bir örnek, kromozom 21'in fazladan bir kopyasının kalıtsal olduğu Down sendromunun en yaygın nedeni olan Trizomi 21'dir.

Karyotipleme genellikle bölünmeye hazırlanan, kromozomları yoğunlaştığında ve kolayca ayırt edilebildiğinde hücreler üzerinde yapılır.

Bir karyotipteki kromozomlar, belirgin bantlama desenlerini ortaya çıkaran lekelerle tedavi edilebilir. Lekeli kromozomlar daha sonra karyotip analizi için boyut ve şekle göre düzenlenebilir. Spesifik kromozomal özellikleri vurgulamak için çeşitli boyalar uygulanabilir. Giemsa veya G-bandı ile boyama, yoğun bir şekilde paketlenmiş, genellikle A-T bazları açısından zengin, gen bakımından fakir bölgeleri işaretler. R-banding, GC bazları açısından zengin kromozomal bölgeleri vurgulayan ters bir Giemsa boyasıdır. C-bandı, kopyalanmış bir kromozomun aynı yarısını birleştiren yapı olan sentromerin etrafındaki en yoğun kromozomal bölgeleri vurgularken, T-bandı, kromozomların veya telomerlerin uçlarını vurgular.

Floresan in situ hibridizasyonu, veya FISH olarak adlandırılan başka bir teknik, belirli kromozomların, DNA bölgelerinin veya RNA transkriptlerinin saptanmasına izin verir. Bu, bir numunenin floresan olarak etiketlenmiş oldukça spesifik oligonükleotid probları ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Bu problar, bölünmeyen hücrelerde yoğunlaşmamış kromozomlara hibritlenebileceğinden, FISH klasik karyotipleme yöntemlerinden daha geniş bir şekilde uygulanabilir.

Son olarak, araştırmacılar eksik veya kopyalanmış kromozomal bölgeleri taramak için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon adı verilen bir yöntem de geliştirdiler. Bir test ve kontrol deneğinden alınan genomik DNA izole edilir, parçalanır ve farklı renkli floroforlarla etiketlenir. Parçalanmış genomik preparatlar daha sonra karıştırılır ve normal bir kromozom yayılımına rekabetçi bir şekilde hibritlenir. Elde edilen karyotip üzerindeki renkler, yayılmayı bağlamak için daha fazla parça oluşturan test numunesinde bir bölgenin kopyalanıp kopyalanmadığını veya bölgenin silinip silinmediğini gösterir, bu da daha bol kontrol parçalarına tercihli bağlanma ile sonuçlanır.

Artık sitogenetiğin ilkelerini anladığınıza göre, bunları uygulamaya koyalım ve FISH'in nasıl yapıldığına daha yakından bakalım.

İlk olarak, izole edilen dokular veya hücreler, kromozom morfolojisini ve bütünlüğünü korumak için paraformaldehit gibi bir fiksatif ile muamele edilir. Daha sonra, örneğin materyali mekanik olarak bozarak bir kromozom yayılımı hazırlanır. Kromozomlar daha sonra artan etanol konsantrasyonlarına sahip bir çözelti serisinde kurutulur ve hedef dizileri problar için daha erişilebilir hale getirmek için bir pepsin çözeltisi içinde geçirgenleştirilir. Kromozomlar daha sonra yıkanır ve bir postfix ile stabilize edilir, formamid ile denatüre edilir, böylece şimdi tek sarmallı DNA probları bağlayabilir ve ikinci bir dizi giderek konsantre etanol çözeltisinde kurutulur.

Floresan etiketli, oldukça spesifik DNA probları hazırlanır ve spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için etiketlenmemiş tekrarlayan DNA fragmanları ile karıştırılır. Prob daha sonra kromozom yayılımına uygulanır, burada hedef dizisine hibritleşir ve bağlanmamış prob bir dizi yıkama ile çıkarılır.

Son olarak, kromozomlar, numuneyi koruyan ve arka plan genomik DNA'sını etiketleyen DAPI gibi genel bir DNA karşı lekesi içeren bir ortama monte edilir ve bir lamel uygulanır. Bu noktada, numuneler, genomik DNA'yı ve diziye özgü özellikleri görselleştirmek için uygun filtre setleri kullanılarak bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir.

FISH'in nasıl yapıldığını gördükten sonra, bu güçlü tekniğin bazı uygulamalarına bakalım.

FISH, implantasyondan önce bir embriyonun karyotipinin normal olduğunu doğrulamak için kullanılabilir. Burada, blastomer olarak bilinen tek bir hücre, döllenmeden üç gün sonra bir embriyodan biyopsi yapıldı, daha sonra parçalandı ve doğrudan bir mikroskop lamı üzerine sabitlendi. Kromozom yayılımı daha sonra potansiyel kromozomal bozuklukları tanımlamak için özel olarak seçilen problara hibridize edildi. Bu durumda, beklenen hibridizasyon sinyalleri modelinden sapmalar, kromozom sayısında veya yapısında bozulmaları gösterir.

Tek bir biyolojik numuneden alınan tüm kromozomları etiketlemek için yenilikçi teknikler de geliştirilmiştir. Böyle bir yöntem, floresan problarla önceden yüklenmiş sekiz hücreli bir cam slayt olan Octochrome cihazını içerir. Özom adı verilen 22 cinsiyet belirleyici olmayan kromozomun tümü ve iki cinsiyet kromozomu, her biri üç kromozoma özgü florofor içeren sekiz pencere arasında dağıtılarak etiketlendi. Bu, tüm kromozomların tek bir hibridizasyondan eşzamanlı olarak taranmasına izin verdi.

Son olarak, probları bir slayt üzerinde farklı pencerelere ayırmak yerine, tüm kromozomlar etiketlenebilir ve daha sonra spektral karyotipleme veya SKY adı verilen bir yaklaşım kullanılarak birlikte tespit edilebilir. Farklı floresan etiketlere sahip çoklu kromozoma özgü problar, her kromozoma hibritlendi ve her birine benzersiz bir spektral renk verildi. Kombine kromozom karışımının eşzamanlı gözlemleri, karyotip kusurlarını tanımlamak için özellikle yararlıdır ve anöploidinin yanı sıra kromozomal delesyonlar ve translokasyonları tanımlamak için kullanılabilir.

Az önce JoVE'nin sitogenetik hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda sitogenetiğin prensipleri, belirli kromozom özelliklerini vurgulamak için kullanılan karyotipleme ve FISH gibi teknikler ve bu tekniklerin uygulamaları hakkında bilgi edindiniz. Sitogenetikteki son gelişmeler, hem araştırma hem de patoloji laboratuvarlarında yeteneklerini artırmıştır ve hastalık araştırma ve teşhisinin ön saflarında yaygın kullanım alanı bulmaya devam edecektir. İzlediğiniz için teşekkürler!