Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Bu videoda, elektron kriyo tomografisi ile moleküler çözünürlükte yakın doğal durumdaki bakteri hücrelerinin 3D görüntüleri oluşturulmuştur. Bu, ilk önce bozulmamış hücrelerin daldırılarak dondurulması veya alternatif olarak hücre peletlerinin yüksek basınçla dondurulması ve kriyoseksiyon ile gerçekleştirilir. Bir dizi M projeksiyon görüntüsü elde edilir ve bölümlere ayrılmış ve daha fazla hesaplamalı olarak analiz edilen bir 3D rekonstrüksiyon veya Tom Graham oluşturmak için kullanılır.

Merhaba, ben Caltech Biyoloji Bölümü'nden Grant Jensen ve ben Sonya Chen, sunumumuzu organize eden. Bugün size bakteri hücrelerinin elektron kriyo tomografisinin nasıl yapıldığını göstereceğiz. Tipik olarak, tek bir kişi tüm prosedürü yapar, ancak protokollerimiz paylaşılan deneyimlerle geliştirildiğinden, şu anda laboratuvarda çalışan herkesi dahil edeceğiz.

Videoda Sonya ve bana ek olarak Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky ve Jen'i göreceksiniz. Diğer laboratuvar üyeleri bilgisayar ekran görüntülerini ürettiler ve Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova ve Dylan Morris dahil olmak üzere eşlik eden yazılı protokolün hazırlanmasına yardımcı oldular. Ariana, bakteri hücrelerini nasıl dondurduğumuzu göstererek bize başlayacak.

İnce bakteri hücreleri için, sağlam hücrelerin bir süspansiyonu, bir EM ızgarası boyunca dondurulur. Burada, ticari bir otomatik daldırmalı dondurucu kullanılarak işlem gösterilmektedir: kirletici madde içermediklerinden emin olmak için bakteri kültürlerini inceleyerek başlayın ve uygun bir birleşme veya konsantrasyonda kızdırma karbon kaplı EM ızgarasını iki ila dört dakika boşaltın. Daha sonra, 100 mikrolitre kolloidal altın çözeltisini 25 mikrolitre% 5'lik bir BSA çözeltisi ile karıştırın.

Karışımı 18.000 G'de 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve altın peletini yeniden askıya alın. 20 mikrolitre hücre çözeltisinde, EM ızgarasını Vitra botuna %100 nemde yerleştirin.

Daha sonra dört mikrolitre hücre karışımını kızdırma deşarj edilen EM ızgarasına uygulayın. Izgara, fazla sıvıyı çıkarmak için her iki taraftan otomatik olarak filtre kağıdı ile lekelenir, daha sonra sıvı nitrojen ile soğutulan sıvı bir etan ve propan karışımına hızla daldırılır. Izgarayı etan propan karışımından dikkatlice çıkarın ve hızlı bir şekilde sıvı nitrojen altında tutulan bir ızgara saklama kutusuna aktarın Daha kalın hücreler için yüksek basınçlı dondurma, buzun kristalleşmesini önler.

Sonraki kriyoseksiyon, numuneleri em için yeterince ince hale getirir. Görüntüleme, 15 mililitre hücrenin üç dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjlenmesiyle başlar. Santrifüjlemeyi takiben, kalan kültür peletinin 0,5 mililitrelik süpernatan karışımını 0,5 mililitre %20 dekstrin kriyoprotektan ile çıkarın.

Daha sonra 15 saniye boyunca 13.000 RPM'de tekrar santrifüjleyin. Hücreler peletlendikten sonra, süper pelet macununun 0,1 mililitrelik süpernatan pipetini, halihazırda 0,2 mililitre %20 dekstrin kriyoprotektan santrifüj içeren ısıyla kapatılmış bir mikro pipet ucuna çıkarın. Mikro pipet ucundaki karışım 30 saniye boyunca 13.000 RBM'de tutulur.

Döndürme işleminden sonra süpernatanı çıkarın. Kapalı uçta beş ila 10 mikrolitrelik sıkı bir pelet görülür. Macunu, yüksek basınçlı dondurucu tutucu koluna önceden monte edilmiş Teflon kaplı pirinç kubbeli bir planchet'in yarım kubbesine aktarın, ardından düz ortağı pirinç şapka ile kapatın.

Ardından kol tertibatını derhal astarlanmış yüksek basınçlı dondurucuya yerleştirin. 2100 bar basınçta, hücreleri içeren birleşik pirinç planche ünitesi, yüksek basınçlı sıvı nitrojen jeti ile hızla soğutulur. Hücreler soğuduktan sonra, kol tertibatını hızla çıkarın ve planşetin ısınmasını önlemek için hızlı bir şekilde sıvı nitrojen banyosuna daldırın.

Daha sonra, planşeti, kesitleme için iyi donmuş hücre kubbesini ortaya çıkarmak için kriyo mikrotom odasına güvenli bir şekilde monte edilmiş önceden soğutulmuş kriyo mikrotom mengene benzeri bir aynaya aktarın. İki pirinç planç, sıvı nitrojen altında dikkatlice ayrılır. Mükemmel donmuş bir hücre kubbesi görünüşte camsı olacak ve çatlaklar ve buz çekirdeklenme çatlakları içermeyecektir.

Kriyo mikrotomu kullanarak, dış kubbe bölgesini 0,2 milimetre kareden daha az olacak şekilde şekillendirin, elmas kırpma aletini kullanarak, hızlı bir kesit hızı tutma ve düşük açılı bıçak ve bakır destek ızgaralarına yönlendirilen antistatik sprey ile yaklaşık 200 mikrometre derinlikte tutun. Yakın mesafede, saniyede yaklaşık 0,4 milimetrelik bir kesme hızı ve dar bir kesme penceresi kullanarak elmas bıçağı cilalı blok yüzüne dikkatlice ilerletin. 50 ila 350 nanometre kalınlığında dilimler ayırmaya başlayın.

Düşük açılı elmas bıçak kenarından kaydırarak ve bölümlerin şeritlerini bakır ızgara desteği boyunca desteklemek ve yönlendirmek için erken bölümleri yakalamak için ince bir kirpik aplikatörü manevra yapın. Izgara yüklendikten sonra, şeritleri sıkıca bastırmak için soğutulmuş cilalı gümüş bir prob kullanın. Mikroskop hazır olana kadar ızgaraları ızgara kutularında sıvı nitrojen soğutmalı kuru bir göndericide saklayın.

Izgaradaki bakteri hücreleri, bir kriyo ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Burada, özel bir Nikon ters mikroskop, modifiye FEI kriyo aşamasına sahip TIB kullanılacaktır. Izgaraları kriyo istasyonundaki kartuşlara yükleyin ve bakır klips halkalarını kullanarak klipsleyin, ardından kartuşu aktarmak için sıvı nitrojen içinde bir tüpe yerleştirin.

Ön soğutmalı kriyo aşamasına en fazla iki kartuş yükleyin ve ızgarayı görüntüleme penceresine taşıyın. Ardından kondansatör merceği indirin ve objektif merceği ızgaraya odaklayın. Hücreleri bulun ve görüntü çekin.

İlişkili LM ve EM çalışması için. Izgara, hücreleri daha sonra em'de bulmak için hücrelerin alanı etrafında taranır. Izgarayı görüntüledikten sonra, kartuşu tekrar tüpe yerleştirin ve bakteri hücresinin 3D TOM'unu elde etmek için EM'de görüntülenmeye hazır olana kadar tüpü sıvı nitrojen içinde tutun.

Numune kriyo TEM'de bir veya iki Es boyunca kademeli olarak eğilirken bir dizi projeksiyon görüntüsü alınır, burada prosedür, kriyo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polar yük ile legon kullanılarak gösterilir kriyo istasyonundaki bir çoklu seçim tutucusuna altı kartuşa kadar. Ardından TF 30 Polar Select bir kartuşa bağlayın ve EM sütununa yerleştirin. EM bilgisayarındaki istemci yazılımında göstergeyi başlatın.

Oturumdaki gösterge için görüntü koşullarını girin. En düşük büyütmeden başlayarak görüntülerdeki hedefleri seçin ve bunları daha yüksek büyütmeli bir sonraki adıma gönderin. Ardından, tilt serisi koleksiyonu için tüm hedefleri sıraya koyun ve hepsini son tomografi adımına gönderin.

Bir dizi görüntü elde edin. Numune, kriyo TEM'de bir veya iki eksen boyunca kademeli olarak eğilecektir. Deney tamamlandıktan sonra, tamamlanan eğim serisini yeniden yapılandırma için yerel bir iş istasyonuna indirin.

Bakteri hücrelerinin Tomo Grahams'ı özel bir yazılım kullanılarak hesaplanır. Raptor programı, Tom'ları otomatik olarak yeniden yapılandırmak için kullanılır ve e tomo bunu yarı otomatik olarak yapmak için kullanılabilir. Im MOD'un 3D mod görüntüleyicisini kullanarak eğim serisini inceleyin ve izleme veya diğer hatalar nedeniyle üretme olasılığı düşük olanları atın.

İyi bir tommo raptor, temel ayarlar kullanılarak laboratuvardaki Linux makineleri üzerinden dağıtılmış olarak çalıştırılır. Tomografiyi oluşturmak için dosyanın boyutuna bağlı olarak 20 dakika ila iki saat sürer. Raptor başarısız olduğunda veya bir araştırmacı rekonstrüksiyonun en uygun olduğundan emin olmak istediğinde, görüntüleri elle dikkatlice hizalamak için EMO kullanılabilir.

Tilt serisinden Tom Graham'ı yeniden oluşturmak için e tomo GUI'deki her sekmenin adımlarını izleyin. Tomografi verilerini düzenlemek, depolamak, aramak ve dağıtmak için web tabanlı bir şirket içi veri tabanı kullanıyoruz. Ana tarama sayfası, bir küçük resim ve öne çıkan bir YouTube benzeri film sunar.

Her tomo Graham için. Tommo, Graham'lar elde edildikten sonra, şekillerini görselleştirmeye yardımcı olmak için bireysel özellikler bölümlere ayrılabilir. 3D segmentasyonda, 3D görüntünün her bir vle'sini belirli bir bölgeye veya malzemeye atama işlemidir.

Burada, her bölgenin farklı bir renkle gösterildiği ve tomonun 3B filmlerinde ve animasyonlarında görüntülendiği bir yüzey modeli oluşturmak için bir ayna yazılımı kullanılır. Grahams, projeleri özetlemek ve bulguları 3D grafiklerde göstermek için yapılabilir. Temsil. Amira veya Kymera gibi yazılımlar, filmin ve reklamın tek tek hareketsiz karelerini oluşturmak için kullanılabilir.

Film reklam yazılımını düzenlemek için Adobe Premier gibi film düzenleme yazılımları kullanılabilir. Maya, animasyonu oluşturmak için kullanılır. Amira'dan yüzeyleri alabilir, anahtar kareler oluşturabilir ve bir filme dönüştürebilir.

Burada, Spiro Treponema Promesa için tam hücre verilerinin temsili bir eğim serisi gösterilmekte ve ardından yeniden yapılandırılmış Tom Agram'ın dilim dilim görünümü gösterilmektedir. T Promesa hücresinin segmentasyonu, dış zarını, iç zarını ve yüzey çanakları ve yüzey kancası çarşısı dahil olmak üzere yüzey yapılarını ayırt eder. Bakteriler flagella ve ular motor, peri plazmik koni ve pillai'dir.

Bu mekanik model, spiroket treponema Promesa'nın nasıl yüzdüğünü ve iç silindirin veya çekirdeğin bir dış kılıfla nasıl çevrelendiğini gösterir. Flagella, iç silindir ile dış kılıf arasında boya silindirleri gibi hareket eder. Flagella döndükçe, iç silindir sayacı dış kılıf içinde döner.

Viskoz olmayan bir ortamda, hücre işe yaramaz bir şekilde döner, ancak T Promesa'nın doğada bulunduğu gibi viskoz ortamlarda, dış lifler veya diğer nesneler dış kılıfın dönüşüne direnir, iç silindirin dönüşünü hızlandırır ve hücrenin kendini ileri doğru delerken itebileceği malzemeler sağlar. Burada gösterilen, ışık mikroskobu ile gözlemlenen gerçek T promeus hücreleridir. Size bakteri hücrelerinin elektron kriyo tomografisinin nasıl yapıldığını gösterdik.

Tabii ki, bu tür bir çalışmanın büyük yatırımlar gerektirdiğinin farkındayız. Kriyo-elektron mikroskopları ve floresan mikroskopları sofistike ve pahalıdır ve ayrıca uygun şekilde alıntılanmaları gerekir. Örneğin, bu odanın temeli, özel olarak sıkıştırılmış bir zemin üzerinde duran, birkaç metre kalınlığında, mekanik olarak izole edilmiş bir beton levhadır.

Klima sistemi ayrıca herhangi bir hava akımı veya türbülans olmadan sabit bir sıcaklığı korumak için büyük kanallar ve yumuşak eğrilerle özel olarak tasarlanmıştır. Gördüğünüz perdeler akustik gürültüyü azaltmak için yerleştirilmiştir. Ve son olarak, bu odanın parazit yapan elektromanyetik alanlardan arınmış olduğunu doğruluyoruz.

Size mikroskopta gösterdiğimiz işlemler artık büyük ölçüde otomatik olsa da, sorunlar hala sık sık ortaya çıkıyor ve uzman teşhisi gerektiriyor. Bununla birlikte, bu filmi izlemenin, bu tür işlerde yer alan prosedürleri ve enstrümantasyonu takdir etmenize yardımcı olduğunu umuyoruz. İlginiz için teşekkür ederiz.