Name: Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Öğrenin, bakteriyel hücrelerin elektron kriyotomografi ile moleküler çözünürlükte 3D görüntülenmesini. Daldırma dondurma ve yüksek basınçlı dondurma teknikleriyle örnek hazırlama ve 3D rekonstrüksiyon süreçlerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sağlık Grants R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 ve P01 GM066521 GJJ National Institutes gibi Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Beckman Caltech&#39;te Enstitüsü&#39;nün, ve, Caltech hediye tarafından kısmen desteklenmiştir. Gordon ve Betty Moore Vakfı ve Agouron Enstitüsü. MSL Pamela S. Björkman NIH hibe 2R37-A1041239-06A1 tarafından desteklenmektedir. Leica Microsystems Inc lütfen cryosection toplama video içeriği sağladı. Treponema primitia temsilcisi sonuçları toplanır ve Gavin E. Murphy tarafından işlenmiş ve Moleküler Mikrobiyoloji &quot;Roman ultrastructures Treponema primitia ve motilite üzerindeki etkileri&quot; başlığı ile yayınlandı. (Murphy, G. ve ark. Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Bu video makalesinde, bakteri hücrelerinin EKT nasıl göstermektedir. Uzay ve zaman ile sınırlı, sadece genel bir protokol göstermektedir. Daha fazla bilgi kağıtları, online ya da diğer bilgi, donanım ve yazılım geliştiricilerin üreten tarafından sağlanan ve EKT araştırma grupları bulunabilir. Okudu farklı bakteri türlerinin bağlı olarak, kullanılan ekipman ve hücrelerde yapısal faiz, protokol ve deneysel parametreleri test ve optimize edilmiş olması gerekir.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>%0,1 çözelti</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Altın kolloid çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Sığır serum Albümini</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>%10</td></tr><tr><td>Nr 1 Filtre kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>%15-25, MW 39000</td></tr><tr><td>Pirinç kubbeli planşet</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 yüksek basınçlı dondurucu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriyo-ultra mikrotom UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static line II iyonizer</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 Kuru taşıyıcı</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH yükleme istasyonu</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B evirtilmiş mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Özel</td></tr><tr><td>Kriyo LM tablası</td><td>FEI</td><td></td><td>Özel</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Gatan UltraCam ile</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel hücre elektron cryotomography

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Bakteri hücrelerinin temel metabolizması hakkında çok önceden bilinmekle birlikte, pek çok temel sorular hala şaşırtıcı şekilde oluşturmak ve korumak, belirli bir hücre şekilleri, polarite kurmak, genomlarını ayırınız ve bölme nasıl dahil olmak üzere, örneğin cevapsız. Bu fenomenleri anlamak amacıyla, görüntüleme teknolojileri ihtiyaç vardır köprü, floresan ışık mikroskobu ve, X-ray kristalografisi ve NMR spektroskopisi gibi yüksek çözünürlüklü yöntemleri arasında çözünürlük boşluğu. Elektron cryotomography (EKT), sadece bu hücre ultrastrüktür &quot;makromoleküler&quot; çözünürlük (~ 4nm) ile, üç boyutlu (3D), yakın yerli bir devlet görüntülenebilmekte için izin gelişmekte olan bir teknoloji. 1, 2 EKT, hücreleri düşük ısıda cryo transmisyon elektron mikroskobu (cryoTEM) &quot;dondurulmuş sulu&quot; devlet, vitreus görüntülü (-180 ° C). Ince hücreler (kalınlığı 3 ~ 500 nm) için, sağlam hücreleri dalma, etan veya etan / propan karışımları gibi cryogens EM ızgaraları arasında medya içinde donmuş. Kalın hücreleri ve biyofilm sonra ilk &quot;yüksek basınçlı dondurma&quot; ve vitreus bir devlet görüntülü olabilir, onlara &quot;cryo-Kesit&quot;. Aşamalı olarak bir veya iki eksen boyunca hareket ettirildiğinde, iki boyutlu projeksiyon görüntüleri bir dizi örnek ile toplanır. Üç boyutlu rekonstrüksiyon veya &quot;tomogram&quot; sonra görüntüleri hesaplanabilir. EKT pahalı aletlerle ihtiyaç duyulurken, son yıllarda, çeşitli dış uzantıları yapıları ortaya çıkarmak için bir kaç laboratuvarlarında kullanılan olmuştur yapıları, farklı hücre zarflar, sitoskeletal filamentler ve yapıların konumları, yerleri ve büyük makromoleküler mimarileri flagellar motorlar, iç bölmeleri ve kemoreseptör dizileri gibi meclisleri 1, 2 Bu video makalede numune hazırlama süreçleri, veri toplama, tomogram yeniden yapılanma, ve segmentasyon ve ışık mikroskobu ile bazı durumlarda korelasyon sonuçların yorumlanması da dahil olmak üzere EKT ile görüntü hücreleri, nasıl çalıştığını göstermek.

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı &quot;makromoleküler&quot; (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Bakteriyel hücrelerin temel metabolizması hakkında halihazırda çok şey bilinse de, ... dahil olmak üzere birçok temel soru şaşırtıcı şekilde hâlâ yanıtsız kalmıştır.

Bu videoda, elektron kriyotomografi kullanılarak bakteriyel hücrelerin moleküler çözünürlükte, doğal durumlarına yakın 3D görüntüleri oluşturulmaktadır. Bu işlem, öncelikle sağlam hücrelerin daldırma dondurma yöntemiyle dondurulmasıyla veya alternatif olarak hücre peletlerinin yüksek basınçlı dondurma ve kriyokesitlenme işlemine tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bir dizi M projeksiyon görüntüsü elde edilir ve bunlar, segmentasyon işlemine tabi tutulup daha sonra bilgisayarlı analizlerin yapıldığı bir 3D yeniden yapılandırma veya tomogram oluşturmak için kullanılır.Merhaba, ben Caltech Biyoloji Bölümü'nden Grant Jensen, yanımda da sunumumuzu organize eden Sonya Chen var. Bugün size bakteriyel hücrelerin elektron kriyotomografisinin nasıl yapılacağını göstereceğiz. Tipik olarak, tüm prosedürü tek bir kişi yürütür; ancak protokollerimiz ortak deneyimlerle geliştirildiği için, şu anda laboratuvarda çalışan herkesi çalışmaya dahil edeceğiz.Videoda Sonya ve benim yanı sıra Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, mark Rodinsky ve Jen'i göreceksiniz. Bilgisayar ekran kayıtlarını hazırlayan ve Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova ve Dylan Morris'in de dahil olduğu diğer laboratuvar üyeleri, beraberindeki yazılı protokolün hazırlanmasına yardımcı olmuştur. Ariana, bakteriyel hücreleri nasıl şok dondurduğumuzu göstererek başlangıcı yapacak.İnce bakteriyel hücreler için, sağlam hücrelerden oluşan bir süspansiyon bir EM ızgarası üzerine daldırma dondurma yöntemiyle dondurulur. Burada işlem, ticari bir otomatik daldırma dondurucu kullanılarak gösterilmiştir; öncelikle bakteriyel kültürlerin kontaminasyondan arınmış olduğundan ve uygun konfluens veya konsantrasyonda olduğundan emin olmak için kültürleri inceleyerek başlayın. Karbon kaplı EM ızgarasına iki ila dört dakika boyunca glow discharge uygulayın. Ardından, 100 µL kolloidal altın çözeltisini 25 µL %5 BSA çözeltisi ile karıştırın.Karışımı 18,000 G'de 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve altın peletini yeniden süspande edin. EM ızgarasını, 20 µL hücre solüsyonu içerisinde %100 nemde Vitra bot'a yerleştirin.Ardından, hücre karışımından dört µL'yi glow discharge uygulanmış EM ızgarasına uygulayın. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için ızgara, filtre kağıdı ile her iki taraftan otomatik olarak blotlanır ve ardından sıvı nitrojen ile soğutulmuş etan ve propan sıvı karışımına hızla daldırılır. Izgarayı etan propan karışımından dikkatlice çıkarın ve hızla sıvı nitrojen altında tutulan bir ızgara saklama kutusuna aktarın. Daha kalın hücreler için, yüksek basınçlı dondurma buz kristalleşmesini önler.Ardından yapılan kriyoseksiyonlama, örnekleri EM için yeterince ince hale getirir. Görüntüleme, 15 mililitre hücrenin üç dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifüj edilmesiyle başlar. Santrifüjlemeden sonra, süpernatan uzaklaştırılır ve kalan kültür peleti 0,5 mililitre %20 dekstrin kriyoprotektan ile 0,5 mililitre oranında karıştırılır.Ardından 13,000 RPM'de 15 saniye boyunca tekrar santrifüjleyin. Hücreler pellet haline geldikten sonra süpernatantı uzaklaştırın ve pellet macunundan 0,1 mililitreyi, halihazırda 0,2 mililitre %20'lik dekstrin kriyoprotektan içeren ısı ile mühürlenmiş bir mikro pipet ucuna pipetleyin. Mikro pipet uçtaki karışımı 13,000 RPM'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın. Mühürlü uçta 5 ila 10 µL boyutunda sıkı bir pelet görülür. Pastayı, yüksek basınçlı dondurucu tutucu koluna önceden monte edilmiş Teflon kaplı pirinç kubbeli bir planşetin bir yarım kubbesine aktarın ve ardından düz eşlikçi pirinç kapakla mühürleyin.Ardından kol düzeneğini hızla önceden hazırlanmış yüksek basınçlı dondurucuya yerleştirin. 2100 bar basınçta, hücreleri içeren birleşik pirinç planş ünitesi, yüksek basınçlı sıvı azot jetle hızla soğutulur. Hücreler soğutulduktan sonra, kol düzeneğini hızla çıkarın ve planşetin ısınmasını önlemek için hemen sıvı azot banyosuna daldırın.Ardından, hücrelerin dondurulmuş kubbesini kesim işlemi için açığa çıkarmak amacıyla, planşeti kriyomikrotom odasına güvenli bir şekilde monte edilmiş ve önceden soğutulmuş kriyomikrotom mengene benzeri tutucuya aktarın. İki pirinç planşet sıvı azot altında dikkatlice birbirinden ayrılır. Kusursuz şekilde dondurulmuş bir hücre kubbesi, camsı bir görünüme sahip olacak, çatlaklar ve buz çekirdeklenmesi yarıkları içermeyecektir.Kriyo mikrotom kullanarak, hızlı bir kesitleme hızıyla elmas düzeltme aracını kullanarak dış kubbe bölgesini 0,2 square millimeters'dan daha küçük bir alana getirin; düşük açılı bıçağa ve bakır destek ızgaralarına antistatik sprey yönelterek yaklaşık 200 micrometer derinliği koruyun. Elmas bıçağı, yaklaşık 0,4 millimeters per second kesme hızı ve dar bir kesme penceresi kullanarak cilalanmış blok yüzeyine dikkatlice yaklaştırın. 50 ila 350 nanometer kalınlığında dilimler kesmeye başlayın.Erken kesitleri yakalamak için ince bir kirpik aplikatörünü dikkatlice hareket ettirin, düşük açılı elmas bıçağın kenarından kaydırın ve kesit şeritlerini bakır ızgara desteği boyunca destekleyip yönlendirin. Izgara yüklendiğinde, şeritlere sıkıca bastırmak için soğutulmuş cilalı gümüş bir prob kullanın. Mikroskop hazır olana kadar ızgaraları sıvı azot ile soğutulan kuru taşıyıcı içindeki ızgara kutularında saklayın.Izgara üzerindeki bakteri hücreleri, bir kriyo ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Burada, modifiye edilmiş bir FEI kriyo tablasına sahip olan özel bir Nikon ters mikroskobu, TIB kullanılacaktır. Izgaraları kriyo istasyonundaki kartuşlara yerleştirin ve bakır klips halkalarıyla sabitleyin, ardından transfer için kartuşu sıvı azot içindeki bir tüpe yerleştirin.Ön soğutmalı kriyojenik sahneye iki adede kadar kartuş yükleyin ve ızgarayı görüntüleme penceresine taşıyın. Ardından kondanser lensini indirin ve objektif lensini ızgara üzerine odaklayın. Hücreleri bulun ve görüntüler alın.Korele LM ve EM çalışması için. Hücrelerin daha sonra EM'de konumlandırılabilmesi için ızgara, hücrelerin bulunduğu alan çevresinden taranır. Izgara görüntülendikten sonra, kartuşu tüpe geri yerleştirin ve bakteriyel hücrenin 3D TOM'sini elde etmek için EM'de görüntülenmeye hazır olana kadar tüpü sıvı azot içinde saklayın.Buradaki cryo TEM'de, örnek bir veya iki eksen boyunca kademeli olarak eğilirken bir dizi projeksiyon görüntüsü alınır; prosedür, cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polar ile legon kullanılarak gösterilmiştir. Cryo istasyonundaki çoklu seçim tutucuya altı adede kadar kartuş yükleyin. Ardından bunu TF 30 Polar'a bağlayın, bir kartuş seçin ve EM kolonuna yerleştirin. EM bilgisayarındaki istemci yazılımında legend'ı başlatın.Oturumdaki lejant için görüntü koşullarını girin. Görüntüler üzerindeki hedefleri en düşük büyütmeden başlayarak seçin ve bunları daha yüksek büyütmeli bir sonraki adıma gönderin. Ardından, tüm hedefleri eğim serisi toplama işlemi için sıraya alın ve hepsini final tomografi adımına gönderin.Bir dizi görüntü elde edin. Numune, kriyojenik TEM içerisinde bir veya iki eksen boyunca kademeli olarak eğilecektir. Deney tamamlandıktan sonra, tamamlanmış eğim serisini yeniden yapılandırma işlemi için yerel bir iş istasyonuna indirin.Bakteri hücrelerinin tomogramları özel yazılımlar kullanılarak hesaplanır. Tomogramların otomatik olarak yeniden yapılandırılması için Raptor programı, yarı otomatik olarak yapılması için ise etomo kullanılabilir. Eğim serisini IMOD'un 3D mod görüntüleyicisi ile inceleyin ve izleme veya diğer hatalar nedeniyle sonuç verme olasılığı düşük olanları ayıklayın.Uygun bir tommo raptor, temel ayarlar kullanılarak laboratuvardaki Linux makineleri üzerinde dağıtık olarak çalıştırılır. Tomografın oluşturulması, dosyanın boyutuna bağlı olarak 20 dakika ile iki saat arasında sürer. Raptor başarısız olduğunda veya bir araştırmacı yeniden yapılandırmanın optimal olduğundan emin olmak istediğinde, görüntüleri elle dikkatli bir şekilde hizalamak için EMO kullanılabilir.Tilt serisinden tomogramı yeniden oluşturmak için e tomo GUI'sindeki her sekmenin adımlarını izleyin. Tomografik verileri düzenlemek, depolamak, aramak ve dağıtmak için web tabanlı kurum içi bir veritabanı kullanıyoruz. Ana gözatma sayfası, küçük bir resim ve öne çıkan YouTube benzeri bir video sunar.Her bir tomografik görüntü için. Tomografik görüntüler elde edildikten sonra, şekillerinin görselleştirilmesine yardımcı olmak amacıyla bireysel özellikler segmente edilebilir. 3D segmentasyon, 3D görüntünün her bir vokselini belirli bir bölgeye veya materyale atama sürecidir.Burada, her bölgenin farklı bir renkle gösterildiği bir yüzey modeli oluşturmak ve tomo'nun 3D filmleri ile animasyonlarında görüntülemek için bir ayna yazılımı kullanılır. Projeleri özetlemek ve bulguları 3D grafiklerle örneklendirmek için Grahams oluşturulabilir. Filmin ve ticari videonun tekil durağan karelerini oluşturmak için Amira veya Kymera gibi yazılımlar kullanılabilir.Film reklam yazılımını düzenlemek için Adobe Premier gibi video düzenleme yazılımları kullanılabilir. Animasyon oluşturmak için Maya kullanılır. Maya, Amira'dan yüzeyleri alabilir, anahtar kareler oluşturabilir ve bunları bir filme dönüştürebilir.Burada Spiro Treponema Promesa için tüm hücre verilerinden oluşan temsilci bir eğim serisi ve ardından yeniden yapılandırılan Tom Agram'ın dilim dilim görünümü gösterilmiştir. T Promesa hücresinin segmentasyonu; dış membranını, iç membranını ve yüzey çukurları ile yüzey kanca arkadı dahil olmak üzere yüzey yapılarını ayırt eder. Bakteri, flagella ve ular motor, periplazmik koni ve pillai içerir.Bu mekanik model, spiroket treponema Promesa'nın nasıl yüzdüğünü göstermektedir; iç silindir veya çekirdek, dış bir kılıfla çevrelenmiştir. Kamçılar, iç silindir ile dış kılıf arasında boya ruloları gibi hareket eder. Kamçılar döndükçe, iç silindir dış kılıf içerisinde ters yönde döner.Viskoz olmayan bir ortamda hücre faydasızca döner, ancak T Promesa'nın doğada bulunduğu viskoz ortamlar gibi ortamlarda, dış lifler veya diğer nesneler dış kılıfın dönmesine direnç göstererek iç silindirin dönmesini hızlandırır ve hücrenin ileriye doğru delerek ilerlerken karşıt kuvvet uygulayabileceği materyaller sağlar. Burada, ışık mikroskobu aracılığıyla gözlemlenen gerçek T promeus hücreleri gösterilmektedir. Size az önce bakteriyel hücrelerin elektron kriyo tomografisinin nasıl yapılacağını gösterdik.Elbette, bu tür çalışmaların büyük yatırımlar gerektirdiğinin farkındayız. Kriyoelektron mikroskoplar ve floresan mikroskoplar gelişmiş ve pahalı cihazlardır ve ayrıca uygun şekilde konumlandırılmaları gerekir. Örneğin, bu odanın temeli, özel olarak sıkıştırılmış zemin üzerine oturtulmuş, birkaç fit kalınlığında, mekanik olarak izole edilmiş bir beton plakadır.Klima sistemi, herhangi bir hava akımı veya türbülans oluşmadan sabit bir sıcaklığı korumak için büyük kanallar ve yumuşak kavislerle özel olarak tasarlanmıştır. Gördüğünüz perdeler, akustik gürültüyü azaltmak için yerleştirilmiştir. Ve son olarak, bu odanın girişime neden olabilecek elektromanyetik alanlardan arındırıldığını doğruluyoruz.Mikroskop üzerinde size gösterdiğimiz işlemler artık büyük ölçüde otomatikleştirilmiş olsa da, hâlâ sıkça sorunlar ortaya çıkmakta ve uzman teşhisi gerektirmektedir. Yine de, bu videoyu izlemenin, bu tür çalışmalarda yer alan prosedürleri ve kullanılan cihazları anlamanıza yardımcı olduğunu umuyoruz. İlginiz için teşekkür ederiz.

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Chetrit, D., ve diğerleri. Legionella pneumophila nokta/icm salgı sisteminin uzay-zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisinin uygulanması. J. Vis. Uzm. (2020)Videoda bakteri kültürü, altın nanopartikül işaretleme ve vitrifikasyon teknikleri birleştirilerek kriyo-elektron tomografisi için Legionella pneumophila örneklerinin nasıl hazırlanacağı anlatılmaktadır. İşlem, doğal hücresel yapıları korur ve zarla ilişkili salgı sistemi...

Legionella pneumophila'nın Kriyojenik Elektron Tomografisi için Hazırlanması

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

Öğrenin, bakteriyel hücrelerin elektron kriyotomografi ile moleküler çözünürlükte 3D görüntülenmesini. Daldırma dondurma ve yüksek basınçlı dondurma teknikleriyle örnek hazırlama ve 3D rekonstrüksiyon süreçlerini keşfedin.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Daha fazla video keşfet