Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Bu in vitro yöntemin genel amacı, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu için mevcut standart veya deneysel tedavi rejimlerinin test edilmesini sağlayan üç boyutlu hücre kültürü sferoidlerini üretmektir. Bu yöntem, radyasyon veya kemoterapi radyasyon tedavisine maruz kaldıklarında baş ve boyun kanseri hücrelerinin üç boyutlu tümör büyümesini anlamamıza yardımcı olur. Primer tümör hücrelerinin ele alınmasının zor olduğu ve her zaman güvenilir üç boyutlu sferoid oluşumuna yol açmadığı söylenmelidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Sabina Schwenk-Zieger olacaktır. Bir tümör örneğinden alınan birincil hücreleri kullanırken, örneği uygun ve steril bir yüzeye yerleştirin ve steril, tek kullanımlık bir neşter ile çok küçük parçalar halinde iyice kesin. Birincil dokunun yeterli mekanik olarak ayrılmasından sonra, kollajenaz 1 ve 2 içeren bir şişeye aktarın ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Daha sonra, karışımı 70 mikrometrelik bir Falcon hücre süzgecinden geçirin ve süspansiyonu HBSS ile yıkayın. Başarılı bir şekilde ayrıldıktan ve ardından yıkandıktan sonra, bir ila iki milyon hücre içeren süspansiyonu, on güne kadar 37 santigrat derecede alt birleşime kadar büyümek için bir T75 hücre kültürü şişesine aktarın. Mikroskop altında, tümör hücresi büyümesini onaylayın.

Kültürdeki hücreleri sayın. İçbükey yuvarlak tabanlı ultra düşük yapışma özelliğine sahip 96 oyuklu bir plaka kullanarak, 5.000 primer tümör hücresi veya 1.000 ila 2.000 ara hücre hücresi, 200 ila 300 mikrolitre ortamda kuyucuklara koyun. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede kültürleyin.

Her gün medya değişiklikleri yapın. Ortam değişiklikleri sırasında sferoidi pipetle aspire etmemeye dikkat edin. Üç boyutlu küre şeklindeki hücre konglomeraları gözlenene kadar sferoidleri kültürleyin.

Düzensiz veya çoklu küresel oluşumlu kuyuları daha fazla araştırmadan hariç tutmayı unutmayın. Daha sonra, ortamı istenen konsantrasyonlarda kemoterapötikler ve / veya monoklonal antikorlar içeren ortama değiştirin. 2.5, beş veya 10 mikromolar konsantrasyonlarda Cisplatin veya 30 mikromolar'da 5-Fluorourasil ekleyin.

Bu prosedürde, altıncı gün, 10. gün ve 16. günlerde bir grafik yazılımı ile dijital fotoğraf dokümantasyonundan sonra küresel boyutu ölçün. Plakanın 520 g'da 2,5 dakika santrifüjlenmesinden sonra süpernatanı çıkarın. Daha sonra, hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve plakayı tekrar santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın.

Daha sonra, sferoidlerin çözünmesini sağlamak için her şişeye 100 mikrolitre enzimatik hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Daha sonra, plakayı 37 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. Mikroskop altında sferoidlerin başarılı bir şekilde çözülüp çözülmediğini kontrol edin.

100 mikrolitre DMEM ekleyin. Ardından, plakayı 520 g'da 2,5 dakika santrifüjleyin. Sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre DMEM'de askıya alın.

Daha sonra, gerekirse, ticari olarak temin edilebilen bir kolorimetrik proliferasyon testi yapın ve testi bir ELISA okuyucusunda okuyun. Tüm hücre hatları, boyut ve okuma süresinde farklılıklar olan güvenilir sferoidler üretebilir. Birincil hücreler, ultra düşük bağlantı plakalarında tekrarlanabilir sferoidler oluşturdu.

Ki-67 boyama, genellikle nekrotik çekirdekler gösteren katı mukozal tümörlerde besin dağılımını taklit ederek, merkezi hücrelerden çok daha yüksek proliferasyon oranları gösteren kültürün çevresini ortaya çıkarır. Burada, çeşitli kemoterapi terapötiklerinin ve radyasyonun sferoid boyutu üzerindeki etkisi. Cisplatin ile tedaviden önce iki gri ile radyasyon, tek başına Cisplatin'e kıyasla sferoid boyutunda önemli bir azalmaya yol açar.

Birincil insan hücrelerinden sferoid üretmenin daha da kurulmasıyla, tedavi testi kavramı bu şekilde uygulanabilir. Spheroidler, tümör biyopsisinden sonra üretilecek ve daha sonra moleküler özellikler ve tedaviye yatkınlık açısından test edilecektir. Hem hücre hatları hem de birincil insan tümör hücreleri için hücre süspansiyonlarından tekrarlanabilir sferoidler üretmek için bir protokol oluşturabildik.

Bu multimodal tahlil, gruplar arasındaki küçük farklılıkları tanımlamak için yeterince hassastır. Gelecekte, test ilk olarak, standart ve deneysel tedavi protokollerine bireysel yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir. İkincisi, tümör hücrelerini taze örneklerden daha fazla karakterize edin.

Üçüncüsü, tedavi yanıtını moleküler modellerle ilişkilendirin. Primer hücrelerin kullanımı ve sferoidlerin oluşturulması, bireysel tedavi yanıtını incelemek için uygun maliyetli bir test ile birlikte in vivo tümör büyümesinin mümkün olduğunca çok özelliğinin korunmasına izin verecektir.