Name: Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Keşfedin Neisseria meningitidis ile α-aktinin arasındaki hücre içi etkileşimleri konfokal mikroskopi ile görselleştirme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol bakteriyel patogenez araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışmalar Wellcome Trust ve Menenjit UK tarafından finanse edilmiştir. HBMEC hücre hattı Dr. KS Kim tarafından sağlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve elektron mikroskobu Wolfson bio Tesisi, University of Bristol yapıldı. Bay Alan Leard Dr Mark Jepson (University of Bristol), ve Sayın Alan Tilley (Perkin Elmer) Biz de onların yardım ve tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.

1. İmmünofloresan Protokolü Tohumculuk, Enfeksiyon ve immüno-boyama Aşağıdaki yordamlar, uygun güvenlik düzeyi doku kültürü ve mikrobiyolojik laboratuvar olanakları gerektirir. 1. GÜN A. enfeksiyon için hedef hücreler hazırlanması <ol><li> Tohum HBMECs cam lamelleri% 50 izdiham (~ 1.5x10 4 hücre / cm 2) (16 mm çapında), 12 plaka (iyi 3,8 cm 2 büyüme alanı /) içine yerleştirilir . Büyüme orta: RPMI 1640% 15 ısı ile inaktive edilmiş (56 ° C, 30dk) FBS, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin / streptomisin,% 1 (v / v) MEM elzem olmayan bir amino ile desteklenmiş asitler çözüm ve% 1 MEM vitaminleri çözüm. </li><li> 37 ° C gecelik (O / N) üzerinde Kültür,% 5 CO2 inkübatör. </li></ol> B. Bakteriyel kültürü <ol><li> 37% 10 ısıtılmış at kanı ile takviye gerekli orta örneğin Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) agar plaklarına faiz yükü büyümeye O / N% 5 CO 2 atmosfer 4 ° C (16-18 saat). </li></ol> 2. GÜN A. Of Bakteriyel (N. meningitidis) Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 10 mcL kültür döngüsü kullanarak, 2 mL PBSB (kalsiyum ve magnezyum ile PBS) gecelik bakteri kültürünün bir süspansiyon olun. </li><li> Büyük bakteriyel büyüklükler oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca stand süspansiyon bırakarak yerleşmek için izin verin. </li><li> Pelet bozmadan, steril bir tüpe süspansiyon üst 1 ml (hisse senedi inokulum) aktarın. </li><li> Stok inokulum bakteri sayıları tahmin etmek için, 1 ml hacimli 0.1M NaOH% 1 SDS içeren tüplere alikotları (20-50 mcL) ekleyin ve hafifçe karıştırın çözünebilmesi. </li><li> 260nm (A260) absorbans belirleyerek çözüm nükleik asit içeriği ölçün. Bizim ellerde, 1 tekabül A260 5x10 8 koloni birimleri şekillendirme / ml (kob / ml). Bu PBSB stok inokulum dilüsyonları bir dizi hazırlamak agar plakaları üzerinde kaplama ve O / N inkübasyondan sonra koloniler sayma kontrol edilebilir. </li><li> Enfeksiyon orta stok inokulum bir kısım sulandırınız [decomplemented (% 2 ile desteklenmiş M199 (56 ° C, 30dk) normal insan serumu (NHS)], hedef hücreleri enfeksiyon için gerekli olan bakteri yoğunluğu elde etmek için. <ol><li> Laboratuvarımızda, hedef hücre başına 200-300 bakteri enfeksiyon oranı rutin kullanılır. </li></ol></li></ol> B. Hücre Kültürü Enfeksiyonu <ol><li> Kültürlü hedef hücreleri 3 kez antibiyotiklerin herhangi bir iz kaldırmak için Hank orta lamelleri yıkayın. </li><li> % 5 CO 2, 3 saat 8 saat 37 taze hazırlanmış bakteri süspansiyonları (yukarıda açıklandığı gibi) ° C ile hücreleri enfekte. </li><li> Enfeksiyon döneminin sonunda, 4, 30-45 dakika süreyle RT veya O / N% 2 paraformaldehid 500 mcL (PFA) hücreleri PBS ile üç defa yıkamak ve düzeltmek ° C <ol><li> Yukarıda gösterilen konsantrasyon ve saatte Paraformaldehit fiksasyon, bakteriyel ve hücresel morfoloji korunması için uygun olduğu tespit edilmiştir. </li></ol></li><li> Paraformaldehid kapalı yıkadıktan sonra,% 0.1 Triton X-100 10 dakika süreyle PBS içinde seyreltilmesi kuluçka tarafından paraformaldehid sabit hücreler permeabilise. </li><li> Örnekleri PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Immüno-boyama geçin veya alternatif olarak, 4,% 1 BSA / PBST O / N 500 mcL örnekleri terk ° C </li></ol> 3. GÜN Immüno-boyama Hücre içi bakteri boyama ve aşağıdaki gibi α-aktinin uygun birincil ve ikincil antikor kullanımı ile sırayla veya aynı anda yapılabilir; tüm işlemleri 12 kuyucuğu yapılabilir. <ol><li> Blok 500 mcL% 3 ile permeabilised hücreleri içeren lamelleri RT 30-60 dakika BSA / PBST (PBS Triton X-100% 0.05 içeren) </li><li> PBS ile yıkadıktan sonra, 12 plaka her lamel yeni bir kuru, iyi transfer. </li><li> Bakteri ve α-aktinin karşı primer antikor ekleyin; lamel yüzeyini kapsayacak şekilde dikkatlice ilave seksen 100 mcL lamel ortalama antikor yeterli olacaktır. 1s için oda sıcaklığında inkübe edin. <ol><li> Biz aynı anda α-aktinin (Abcam) karşı Neisseria meningitidis (laboratuar kaldırılan) ve fare monoklonal antikor (mAb) karşı tavşan poliklonal antiserum kullanılır. Bazı deneylerde, anti-α-aktinin yerine, aktin ve vimentin karşı mAb (Sigma) kullanıldı. </li></ol></li><li> Inkübasyon sonunda, iyi PBS 200 mcL eklemek için yeni bir de içeren 500 mcL PBS lamel ve yer kaldırın. </li><li> 5 dakika sonra, pipetleme tarafından PBS çıkarın ve sonra taze PBS ekleyin. Iki kez tekrarlayın. Lamelleri bir aktarınyeni kuru kuyu. </li><li> Karanlıkta 1s için oda sıcaklığında inkübe;% 1 BSA / PBST seyreltilmiş farklı fluorochromes konjuge uygun sekonder antikor ekleyin. <ol><li> Bakteriyel tespiti için, biz TRITC ile konjuge anti-tavşan Ig kullanılan ve α-aktinin ve diğer iskelet protein tespiti için, konjuge anti-fare Ig kullanılan ya FITC (Sigma) veya Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Inkübasyon sonunda, 4 ve 5. adımları olarak yıkayın. </li><li> Sayaç karanlık RT az 5 dakika için 0.6 mg / ml PBS içinde DAPI (DNA leke) ile leke. </li><li> PBS ile durulayın. </li><li> Montaj orta bir damla slaytlar (e, g. Mowiol veya Vectashield) Mount lamelleri (hücreleri aşağı bakacak şekilde) </li><li> 4 ° C karanlıkta saklayın </li><li> Örnekler mikroskop altında gözlem için hazır. </li></ol> 2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) Gözlemlemek ve hücre içi bakteri ve iskelet elemanları görüntülerini yakalamak için, Leica DM I6000 ters Epifloresans mikroskop bağlı bir Leica SP5-Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak immunolabelled örnekleri ve çekilen görüntülerin kullandı. Tüm görüntüleri Leica yazılımı ile 63x NA 1.4 yağ daldırma amaç ve süreci kullanılarak toplanmıştır. CLSM prosedürü: <ol><li> CLSM prosedürü başlatmak için, objektif bir damla immersiyon yağı ekleyin ve mikroskop aşamasında örnek slayt, lamel-yüzü aşağı yerleştirin. </li><li> Mikroskop görsel moduna ayarlayın ve mikroskop göz parçaları kullanılarak ilgi alanı bulmak. </li><li> Leica Yazılım kullanarak, xyz satın alma modunu seçin. </li><li> 512 x 512 formatında (kare boyutu) seçin. Colocalisation çalışmalar için, yüksek çözünürlük, daha doğru görüntü; mikroskop çözünürlük sınırı göz önünde tutmak. Daha sonra çift yönlü X modunda, tarama hızı artacak seçin ve fotoğraf beyazlatma azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Sıralı tarama ayarlarını ayarlayın. "Sıra" fonksiyonu tıklayın ve tarama modlarından birini seçin. Biz modu "satırları arasındaki" kullanabilirsiniz. </li><li> DAPI (mavi), Alexa Fluor TRITC için 488 (yeşil) ve 561 nm (kırmızı) için 488 nm 405 nm: Seçiniz lazer sekonder antikor konjuge fluorochromes göre kirişler. Photomultiplier Tube (PMT) sırasıyla 1, 2, ve 3 etkinleştirin. Doğru emisyon dalga boyu algılamak için PMT ayarlarını yapın. </li><li> Z yığınları veya seri ("başlamak") üst ve alt ("son") ayarlayın. Sonra, gerekli "z adım boyutu" olarak ayarlayın. <ol><li> Neisseria meningitidis bir Diplococcus (Şekil 1G) ve her coccus yaklaşık çapı 0.5 mm yana, 0.20 mm z-adım boyutu en az iki kez her coccus tarama olasılığını artırmak için seçildi. 0.2 mm - 0.1 optimum çözümü için adım boyutu içinde de. </li></ol></li><li> Sinyal gürültü oranı artırmak için 3 hat ortalama seçerek son tarama parametrelerini ayarlayın. </li><li> "Start" tuşuna tıklayarak, çift ya da üçlü lekeli görüntüler farklı dalga boylarında farklı kromoforlar arasında çapraz tartışma ortadan kaldırmak için sıralı tarama elde edilir. </li><li> Iki fluorochromes colocalisation bir göstergesi için seçilen kanallar tek bir görüntü birleştirme "overlay" fonksiyonu seçin, örneğin, Alexa 488 (yeşil) ve (kırmızı) TRITC fluorochromes hem colocalise zaman, sarı renk kaplanan görüntü görünecektir . </li><li> Z yığınları veya seri mümkün colocalisation görselleştirmek için gerekli bir 2B görüntü yapımı için "maksimum projeksiyon" fonksiyonunu kullanarak derleyin. Colocalisation daha detaylı analiz, her optik bölümün analizi ile elde edilebilir. </li><li> Z yığınları veya seri aldıktan sonra, çeşitli unsurları içi lokalizasyonu (Şekil 1E) görselleştirilmesi için dik bir görüntü elde etmek için verileri işlemek. </li></ol> 3. Colocalisation, ölçümü İstatistiksel analizler konfokal tarama mikroskobu görüntüleri Volocity yazılım (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Bu yazılım Manders ve ark (1993) 5 açıklandığı gibi colocalisation analiz için özel olarak tasarlanmış bir araç sağlar. Colocalisation dijital floresan görüntüleme bağlamında her kanalda aynı voksel (piksel hacmi) yerde bir sinyal tespiti olarak tarif edilebilir. Iki kanal aynı örnek alan (Volocity kullanım kılavuzu) alınan iki farklı fluorochromes görüntüler oluşur. İstatistiksel analizler aşağıda açıklanan Kantitatif Colocalisation Analizi Volocity yazılım kullanarak (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Kantitatif Colocalisation Analizi <ol><li> Volocity yazılımı kullanarak CLSM görüntüleri ile bir kütüphane oluşturun. </li><li> Üst çubuktaki görüntü "genişletilmiş odak" ı seçin. Bu araç, analiz edilmesi gereken bir 2B görüntü z yığınları derlemek. </li><li> "Ko" aracını seçin. Analiz edilmesi için iki kanal aynı renk derinliğine sahip olmalıdır. </li><li> Sayısallaştırılmış olacak bu bölgeyi seçin. Herhangi bir arka plan çıkarmak için eşik değerlerini ayarlayın. </li><li> "Ko oluşturmak" seçerek colocalisation çıktı oluşturun. Colocalisation istatistikler, daha önce seçilen ilgi bölgeler için oluşturulur. </li><li> Seç Manders 'katsayıları R (üst üste katsayısı) ve (colocalisation katsayısı). <ol><li> Manders 'katsayıları toplam piksel yoğunluğu karşı normalize olarak boyanma yoğunluğu duyarlı değildir; böylece bir antijen boyama diğerinden daha güçlüdür istihdam edilebilir. </li><li> Manders 5,6 katsayısı R bindirme gerçek colocalisation derecesi temsil eder, yani piksel piksel sayısı ile karşılaştırıldığında colocalise sayısı. </li><li> Öte yandan, colocalisation katsayısı, Benim, daha bol benzer parçaları (bu durumda bakterilerin, kırmızı) daha bol benzer parçaları (bu durumda α-aktinin, yeşil) floresan katkı açıklar, yani kırmızı piksel sayısı kırmızı piksel sayısı ile karşılaştırıldığında, yeşil piksel ile örtüşüyor. </li><li> Manders 'katsayıları, 1, 0 hiçbiri yüksek colocalisation olan, 1 ve 0 arasında değişir, ancak daha kolay yorumlanması için yüzdesi olarak ifade edilebilir. </li></ol></li><li> Veri sunumu için bir Excel belgesi ihracat istatistikleri değerleri. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Hücre içi yerelleştirme Opc ifade Neisseria meningitidis ve α-aktinin Α-aktinin (gösterilmemiştir), 3 ve 8 saat, 3 saat enfeksiyon deneylerde daha az olduğu ortaya çıktı Nm belirtilen colocalisation yukarıda açıklandığı için Nm ile enfekte insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri Konfokal görüntüleme, 8 saat boyunca enfekte kültürleri ile karşılaştırıldığında ( Şekil 1 AF). Opc ifade Meningokoklar α-aktinin kanıtlanabilir colocalisation&gt; 5 çoğaltmak deneylerde her zaman gözlendi. Yukarıda açıklandığı gibi birkaç konfokal görüntüleri kullanarak colocalisation istatistiksel analizi gerçekleştirildi. Genel olarak, HBMEC ile enfekte Opc-ifade Meningokoklar, yeşil (α-aktinin) ve kırmızı (Nm) piksel&gt;% 25 örtüşme (Şekil 2B, katsayısı R Overlap) elde edildi. Vimentin nadir içselleştirilmiş bakteri ve ya aktin ve vimentin etiketlenmesi yapıldı α-aktinin, deney aksine, zaman zaman colocalisation aktin ama gözlenmiştir (Figure. 2B). Bu veriler de her kısmın göreceli bolluk dikkate alır katsayısı My kullanılarak analiz edildi. Daha bol sinyali (bu durumda yeşil, α-aktinin) daha az bol sinyali (kırmızı, bakteri bu durumda) ortaya her zaman ortaya çıkma sıklığı bir ölçüsüdür. Bu önlem, içselleştirilmiş Meningokok (Şekil 2A ve C) çevresinde α-aktinin, ortaya çarpıcı bir seviyesini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. N. içi etkileşimleri değerlendirmek için Konfokal lazer tarama mikroskopisi α-aktinin ile meningitidis. AH. Lamelleri yetişen konfluent endotel mono tabakaları Opc-ifade (AF) N. ile enfekte olmuş meningitidis. 8 saat sonra, yapışık olmayan bakteriler yıkandı, hücreleri paraformaldehid ile sabit ve% 0.1 Triton X-100 ile permeabilised. Daha sonra, yukarıda açıklandığı gibi bakteri ve α-aktinin (bakteri, kırmızı α-aktinin, yeşil) boyandı. AC. Nm (A) veya α-aktinin (B) yerini xy resimlerini gösteren bir alan. (C) Bindirme görüntüsünün sarı-turuncu renkli colocalisation düşündüren göründüğü çeşitli bölgelerinde gösterir. Oklar (A) ve (B) α-aktinin birikimi yüksek derecede bakterilerin çevresinde meydana gelmiş görünüyor bölgelerde gösterir. D., bir hücrenin üssünde bulunan, hücre içi bakteri çevresinde virüslü bir HBMEC tek tabaka belirten colocalisation Optik diseksiyonu. Yine, bu bölgede genel α-aktinin leke olarak bu colocalisation düşük, α-aktinin yanlışlıkla yakınlığı nedeniyle değildir. E ve F Üç boyutlu görüntüleri, yukarıdaki gibi işlenmiş enfekte HBMEC mono tabakaları. Apikal yüzey (E) oblik bir görünüm yapışkan bakteri gösterir lekeli kırmızı (kırmızı ok) endotel hücreleri (sarı ok) bazal yüzeyler doğru bulunan birkaç bakteri belirgin turuncu / sarı renkli ise. (F) bir son on XZ kesit. Bazal konumu daha net bir şekilde görülebilir. G. N. olumsuz lekeli bir elektron mikroskobu görüntü onun gösteren meningitidisgelen baskın diplococcal. Her coccus çapı yaklaşık 0,5 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. HBMEC hücrelerin yerleri ve α-aktinin, aktin ve vimentin dağıtım. A. HBMEC, Etkilenmiş mono tabakaları efsanesi yukarıda açıklanan ancak α-aktinin için ek olarak, bazı lamelleri α-aktinin için benzer bir prosedür aktin ve vimentin tespiti için kullanılan tedavi edildi. Yukarıdaki gibi, α-aktinin birkaç içselleştirilmiş bakteriler (beyaz oklar) etrafında yoğunlaştı. Vimentin ve aktin kayda değer seviyelere bakteri ile colocalise vermedi. Bar 20 mikron temsil eder. Katsayıları R ve My B. ve C. değerleri üçten fazla deneyler yukarıda açıklandığı gibi Volocity yazılımı kullanılarak elde edilmiştir.

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

Bağlayıcı olasılığı içselleştirilmiş Opc HBMEC ifade α-aktinin Neisseria meningitidis bakteri colocalisation muayene ve sitoskeletal 3 ve 8 saat kuluçka süresinden sonra enfekte hücrelerde protein kullanılarak incelendi. Konfokal mikroskopi, Neisseria meningitidis ile α-aktinin colocalisation göstermiştir olabilir. Özellikle, bakteriler 3 saat içselleştirmiş olmasına rağmen, bu zaman noktasında α-aktinin küçük colocalisation vardı. Sitoskeletal protein ile Bakteriyel dernek intrasellüler ikamet 8 saat enfeksiyon döneminden sonra uzun bir süre gerektirir, bakteri sayısının önemli ölçüde yakın ilişki görünüşte α-aktinin vardı. Alfa-aktinin, çok fonksiyonlu bir protein ve sitoskeletal elemanı ile bakteriyel etkileşimleri, mevcut çalışmaların bir konudur hedef hücre fonksiyonu üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Colocalisation Kantitasyonu yukarıda açıklandığı gibi, titiz bir örnek hazırlık gerektirir. Özellikle dikkat süresi ve antikor dilüsyonları engelleme, sabitleme örnek verilmelidir. En iyi sinyal gürültü oranı için optimum konsantrasyonlarını belirlemek için ön deneyler, her birincil ve ikincil antikor titre edilmesi gerekir. Deneyimlerimize göre, montaj orta Mowiol Daha iyi görüntü üretti.

1. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM): Leica SP5 konfokal görüntüleme sistemi: Bu sistem, AOTF bir kombinasyonu (acousto optik arasında ayarlanabilir filtre) ve Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor (acousto optik demeti splitter) kullanarak, belirli dalga boyları ile uyarma kolaylaştırır. 2-Yazılım: Leica konfokal yazılımı LCS, Leica Microsystems, Almanya. Volocity 5, Doğaçlama, Perkin Elmer, ABD.

görselleştirme ve miktar hücre içi etkileşimleri neisseria meningitidis</emkonfokal görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) Opc protein adhesin ve insan epitel ve endotel hücreleri için etkili bir invasin olarak hareket edebilir bir yüzey ifade ayrılmaz dış membran proteini,. Biz Opc, integrin ligandlar gibi vitronectin olarak ilk bağlamak için Opc gerektiren bir süreç için önemli reseptörleri ve bu hücre ifade reseptörleri 1 ile endotel yüzeyinde bulunan integrinler belirledik. Bu süreç endotel hücreleri bakteri istilası 2 yol açar. Daha yakın zamanda, biz, insan hücrelerinde 3 tüm hücre lizatları bulunan bir 100kDa protein Opc bir etkileşim gözlemlenmiştir . Konak hücre proteinlerinin elektroforezi ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen Opc eksprese Nm ile kaplanmış olduğu başlangıçta bu etkileşim gözlenmemiştir. Etkileşim doğrudan ve ara moleküller dahil etmedi. Kütle spektrometresi, α-aktinin olarak protein kimliği kurdu. Α-aktinin, incelenen sekiz hücre hatları herhangi bir ifade ettiği gibi herhangi bir yüzey bulundu, ve hedef hücre içine bakteri girişini serum kurşun varlığında endotel hücreleri ile Opc etkileşimleri gibi, intraselüler etkileşen iki protein olasılığını inceledi. Bunun için, kültürlü insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) ile enfekte Opc uzun süre ve içselleştirilmiş bakteri ve α-aktinin yerleri için Nm ifade konfokal mikroskobu ile incelendi. Biz, bakteriyel internalizasyonunda sekiz saatlik bir süre sonra önemli sitoskeletal protein, Nm colocalisation zamana bağımlı bir artış gözlenmiştir. Buna ek olarak, kantitatif görüntüleme yazılımı kullanımı α-aktinin ve diğer hücre iskeleti proteinleri Nm colocalisation göreceli bir önlem almak için olanak sağladı. Işlem aynı zamanda insan epitel hücreleri için geçerli olmasına rağmen, biz burada, görselleştirme ve bakteriyel insan endotel hücre içine girmesinden sonra hücre içi proteinler bakterinin colocalisation ölçümü için bir protokol mevcut.

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) Opc proteini, bir adhezin ve ... olarak işlev görebilen, yüzeyde eksprese edilen integral bir dış membran proteinidir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre içine alınmış bakterilerin, RIA Meningitidis'in,le hücre iskeleti proteini Alpha Actinin ile kolokalizasyon düzeyini değerlendirmektir. Bu işlem, bakterilerin hedef hücrelere girmesine izin vermek için kültürlenmiş insan beyin mikrovasküler hücrelerinin, bakterilerin gece boyu süren kültürüyle üç ila sekiz saat boyunca enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, hücre içi bakteriler içeren hücreler yıkanır, tespit edilir (fikse edilir) ve ardından permeabilize edilir; bu işlem, enfekte kültürün hücre içine alınmış bakterilerin ve hücre içi alpha actinin'in immün boyaması için hazırlanmasını sağlar.Konfokal görüntüleme ve kolokalizasyon yazılımının uygulanmasının ardından, hücre içi kolokalizasyon görüntüleri gözlemlenebilir ve konfokal mikroskobik görselleştirme ile kantitatif kolokalizasyon analizi sayesinde, Meninga Croci eksprese eden OPC'nin ve ayrıca membran proteininin, hücre içi alfa aktinin ile spesifik olarak etkileşime girebildiğini gösteren kantitatif sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Bri Üniversitesi Hücresel Moleküler Tıp Bölümü'nden Profesör Mata TI Laboratuvarı'ndan Isel Maria. Bugün size, hücre içi bakterilerinlelele sitoskeletal proteinlerin kolokalizasyon oranının düzeyinin tahmini için bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda, oto membran proteini OPC eksprese eden mycelium meningitis ile sitoskeletal protein alfa aktin arasındaki etkileşimi incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu çalışma, uygun bir güvenlik laboratuvarında gerçekleştirilmelidir.İmmün boyama prosedüründen iki gün önce, ilgili bakteri suşunu beyin kalp infüzyonuna ekleyin. %10 ısıtılmış at kanı ile desteklenmiş agar plaklarını, immün boyamadan önceki gün, %5 karbon dioksit atmosferinde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu büyütülen bakteri kültüründen bir süspansiyon hazırlamak için 10 µL'lik bir kültür özesi kullanın.Büyük bakteri agregatlarının çökmesini sağlamak için, iki mililitre PBSB içindeki süspansiyonu beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Ardından, pellete dokunmadan süspansiyonun üstteki bir mililitresini steril bir tüpe aktarın. 20 mikrolitre bakteri süspansiyonu içeren iki viyale bir mililitre %1 SDS 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyerek bakterileri çözün ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Bakteri sayılarını tahmin etmek için.Çözeltinin absorbansını belirleyerek nükleik asit içeriğini ölçün. 216 anters'te, bakteriyel süspansiyonu insan beyin mikrovasküler endotel hücrelerini enfekte etmek için enfeksiyon ortamındaki gerekli yoğunluğa ayarlayın. İmmün boyamadan iki gün önce ekilmiş insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri veya H-B-M-E-C-A için 16 mm'lik cam lamelleri 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve HBME hücrelerini lameller üzerine %50 konfluensta ekleyin; ertesi güne kadar 37 °C'de, %5 karbondioksit atmosferinde gece boyunca inkübe edin.Laboratuvarımızda taze hazırlanan bakteriyel süspansiyon ile hücreleri enfekte edin. Hedef hücre başına 200 ila 300 koloni oluşturan birimlik bir enfeksiyon oranı rutin olarak kullanılır. Enfeksiyon süresinin sonunda, 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren ortamda üç ila sekiz saat boyunca inkübe edin.Hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca 500 microliters %2 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehidi yıkadıktan sonra, paraformaldehit ile sabitlenmiş hücreleri PBS ile seyreltilmiş %0,1 Triton X 100 içerisinde 10 dakika inkübe ederek permeabilize edin. Son olarak örnekleri üç kez PBS ile yıkayın ve gösterildiği gibi immün boyamaya geçin. Ardından, hücre içi bakterilerin ve dfor aktininin boyaması eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir.12 kuyucuklu plaklarda, geçirgen hücreleri içeren lamelleri 30 ila 60 dakika boyunca 500 µl %3 B-S-A-P-B-S-T ile bloke edin. Oda sıcaklığında, PBS ile yıkadıktan sonra her bir lameli 12 kuyucuklu plaka içindeki yeni ve kuru bir kuyucuğa aktarın; bakterilere karşı primer antikorları ve alfa aktininle aynı anda uygulayın. Dikkatlice eklendiğinde, lamelin yüzeyini kaplamak için lamel başına 80 ila 100 µl antikor yeterlidir; oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda kuyucuğa 200 µl PBS ekleyin, lameli kaldırın ve 500 µl PBS içeren yeni bir kuyucuğa yerleştirin. Beş dakika sonra PBS'yi pipetleme yoluyla uzaklaştırın ve ardından taze PBS ekleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın ve lamelleri yeni, kuru bir kuyucuğa aktarın.Ardından, %1 B-S-A-P-B-S-T içinde seyreltilmiş, farklı florokromlarla konjuge edilmiş uygun sekonder antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyon sonunda yıkama işlemi daha önce gösterildiği gibi uygulanır; ardından DNA'yı, oda sıcaklığında ve karanlıkta beş dakika boyunca DPI ile karşı boyayın. Bu inkübasyonun sonunda lamel camları bir kez PBS ile yıkayın ve ardından bir damla mount etme medyumu ile monte edin. Monte edilen lamel camlar, mikroskop altında gözlem aşamasına gelene kadar karanlıkta saklanmalıdır. Bir evirtilmiş epi-floresan mikroskoba bağlı konfokal lazer taramalı mikroskop kullanarak, immün olarak işaretlenmiş örneklerimizi gözlemleyip görüntülerini alırız.CLSM prosedürüne başlamak için objektife bir damla immersiyon sıvısı damlatın ve numune lamının üzerindeki kapatma camını mikroskop tablasına yerleştirin; mikroskobu görsel moda getirip mikroskobun okülerlerini kullanarak ilgilenilen bölgeyi bulun, artık Leica yazılımını kullanmaya hazırız. XY z ekseni görüntüleme modunu seçin. Kolokalizasyon çalışmaları için 512 x 512 formatını seçin.Çözünürlük ne kadar yüksek olursa, görüntü o kadar doğru olur. Ardından, tarama hızını artıran ve fotobleşin azaltılmasına yardımcı olan çift yönlü X modunu seçin. Ardışık tarama ayarlarını yapılandırın.SEC fonksiyonuna tıklayın ve ardından hatlar arasından seçim yapın. Sekonder antikorlara konjuge olan florokromlara göre lazer ışınlarını seçin. DPI için 405 nanometre, Alexa Fluor 488 için 488 nanometre ve 561 nanometre.Trixy için sırasıyla bir, iki ve üç numaralı fotomultipliyer tüpleri aktifleştirin. Z yığınının veya serisinin üst ve alt sınırlarını belirleyin. Ardından, Z adım boyutunu 0.2 micrometers olarak ayarlayın.RIA Mencius diplo oküslüdür ve her bir oküsün yaklaşık çapı 0,5 µm olduğundan, 0,2 µm'lik bir Z adım boyutu, her bir oküsün en az iki kez taranma olasılığını artırır. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için üçlü hat ortalamasını seçerek nihai tarama parametrelerini ayarlayın ve başlat'a tıklayın. Farklı kromoforlar arasındaki çapraz etkileşimi ortadan kaldırmak için, farklı dalga boylarında ardışık tarama yaparak ve her kanal için hatlar arası modu kullanarak çift veya üçlü boyanmış görüntüler elde edilir.İki florokromun kolokalizasyonunu belirlemek için, seçilen kanalları tek bir görüntüde birleştirmek üzere üst üste bindirme (overlay) işlevini seçin. Örneğin, hem Alexa 488 hem de trissy florokromlar kolokalize olduğunda, üst üste bindirilmiş görüntüde sarı renk görünecektir. Olası kolokalizasyonu görselleştirmek için gerekli olan 2D rekonstrüksiyon işlemi, maksimum projeksiyon işlevi kullanılarak Z-stack veya serilerle gerçekleştirilir. Z-stack veya seriler elde edildikten sonra, çeşitli elementlerin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek amacıyla ortogonal bir görüntü elde etmek için verilerinizi işleyin.Kolokalizasyon nicemlemesi, IMP tarafından sağlanan Vol City yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Başlamak için CLSM görüntüleriyle bir kütüphane oluşturun ve üst çubuktaki görüntüden genişletilmiş odak (extended focus) seçeneğini belirleyin. Bu araç, analiz edilecek olan 2D görüntüde Z-yığınlarını (Z-stacks) birleştirecektir.Şimdi COLOCALIZATION aracını seçin. Analiz edilecek iki kanalın renk derinlikleri aynı olmalıdır. Kantifikasyon yapılacak alanı seçin.Herhangi bir arka planı temizlemek için eşik değerini ayarlayın. "Generate colocalization" seçeneğini belirleyerek kolokalizasyon çıktısını oluşturun. Daha önce seçilen ilgi alanları için kolokalizasyon istatistikleri oluşturulacaktır.Ardından, Mander katsayıları R ve ny'yi seçin. Son olarak, veri sunumu için istatistik değerlerini bir Excel belgesine aktarın; burada sekiz saat boyunca meningokokla enfekte edilmiş insan beyin endotelyal hücrelerinin temsili konfokal görüntüleme sonuçları gösterilmektedir. Bakterilerin konumu kırmızı renkle gösterilmiştir.Alfa aktininin konumu gösterilirken, yeşil oklar bakterilerin çevresinde yüksek derecede alfa aktinin birikiminin meydana geldiği bölgeleri belirtmektedir. Bu üst üste bindirme görüntüsünde, meninga occi ile alfa aktinin arasında kolokalizasyon olduğunu düşündüren sarı turuncu rengin görüldüğü birkaç bölge bulunmaktadır. Bir sonraki görüntüde, enfekte bir H-B-M-E-C monotabakasının optik diseksiyonu, bir hücrenin tabanında yer alan hücre içi bakterilerin çevresinde kolokalizasyon olduğunu göstermektedir.Enfekte H-B-M-E-C monokatmanlarının üç boyutlu görüntüleri işlendiğinde, apikal yüzeyin eğik görünümü, kırmızı okla belirtilen kırmızıya boyanmış bir Durant bakterisini gösterirken, sarı okla belirtilen bölgelerde birçok bakteri endotel hücrelerinin bazal yüzeylerine doğru konumlanmıştır. Belirgin şekilde turuncu ve sarı renkli bir bazal konum, bu endon XZ kesitinde daha net bir şekilde görülebilir. İçselleştirilmiş bakteriler ile ya menton ya da aktinin etiketlendiği actinin deneylerinin aksine, H-B-M-E-C hücrelerinde aktin ile ara sıra kolokalizasyon görülse de fermente olanlarla kolokalizasyon nadirdir.Önceki deneylerde gözlemlendiği gibi, Retin beyaz oklarla belirtilen birkaç internalize bakteri etrafında yoğunlaşmıştır. Göreceli örtüşmeyi elde etmek için veriler ayrıca analiz edilmiştir. Manda'ya göre, kolokalizasyonun gerçek derecesini temsil eden Katsayı R (toplam piksel sayısına kıyasla kolokalize olan piksel sayısı) ve OPC eksprese eden meningokoklar ile enfekte edilmiş H-B-M-E-C'lerdeki alfa aktinin, mentin ve aktin genelindeki NY değerleri için, meningokoklarda Retin'in %25'ten fazla örtüşme gösterdiği elde edilmiştir.Katsayı Y, daha az bol olan meninga cocoa sinyali her oluştuğunda, daha bol olan rein sinyalinin frekansının bir ölçüsüdür. Bu ölçüm, internalize edilmiş meninga cockeye yakınında alfa aktininin çarpıcı bir düzeyde bulunduğunu göstermektedir. Bu deneyde, internalize edilmiş bakterilerinle hücre iskeleti elementlerinin nasıl görselleştirileceğini ve nicelendirileceğini size göstermekteyiz.Yapıların bütünlüğünü korumak ve yüksek arka plan gürültüsünü önlemek için tespit ve immün boyama protokollerine kesinlikle uyulması gerektiğini unutmamak önemlidir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Keşfedin Neisseria meningitidis ile α-aktinin arasındaki hücre içi etkileşimleri konfokal mikroskopi ile görselleştirme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol bakteriyel patogenez araştırmalarında kullanılabilir.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan

Daha fazla video keşfet