Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan

Aşağıdaki deneyin genel amacı, içselleştirilmiş bakterilerin, RIA Meningitidis'in hücre iskeleti proteini Alpha Actinin ile kolokalizasyon seviyesini değerlendirmektir. Bu, bakterilerin hedef hücrelere girmesine izin vermek için kültürlenmiş insan beyni mikrovasküler hücrelerinin bir gece boyunca üç ila sekiz saat boyunca bakteri kültürü ile enfekte edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hücre içi bakterilere sahip hücreler yıkanır, sabitlenir ve daha sonra nüfuz edilir, bu da enfekte olmuş kültürü içselleştirilmiş bakterilerin ve hücre içi alfa aktinin'in immün boyaması için hazırlar.

Konfokal görüntüleme ve kolokalizasyon yazılımının uygulanmasını takiben, hücre içi kolokalizasyonun görüntüleri izlenebilmekte ve OPC eksprese eden Meninga Croci'nin ve ayrıca membran proteininin, konfokal mikroskobik görselleştirme ve kantitatif kolokalizasyon analizine dayalı olarak hücre içi alfa aktinin ile spesifik olarak etkileşime girebileceğini gösteren kantitatif sonuçlar elde edilmektedir. Merhaba, ben Bri Üniversitesi Hücresel Moleküler Tıp Bölümü'nde Profesör Mata TI Laboratuvarı'ndan ben Isel Maria. Bugün size hücre içi bakterilerin hücre iskeleti proteinleri ile oranı olan col seviyesinin tahmini için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, bir oto membran proteini OPC'yi eksprese eden miselyum menenjitinin hücre iskeleti proteini alfa aktin ile etkileşimini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu çalışmanın yeterli bir güvenlik laboratuvarında yapılması gerekir.

İmmün boyama işleminden iki gün önce, ilgilenilen bakteri lekesini beyin kalp infüzyonuna aşılayın. %10 ısıtılmış at kanı ile takviye edilmiş agar plakaları, immüno-boyamadan önceki gün %5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede gece boyunca büyür. Gece boyunca bakteri kültürünün süspansiyonunu yapmak için 10 mikrolitrelik bir kültür döngüsü kullanın.

İki mililitre PBSB'de, büyük bakteri agregalarının çökmesine izin vermek için süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Daha sonra, süspansiyonun üst bir mililitresini pelet çözünen bakterileri rahatsız etmeden steril bir tüpe aktarın 20 mikrolitre bakteri süspansiyonu içeren iki şişeye bir mililitre% 1 SDS 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyerek ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Bakteri sayılarını tahmin etmek.

Çözeltinin emilimini belirleyerek nükleik asit içeriğini ölçün. 216 anters, insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerini enfekte etmek için bakteriyel süspansiyonu enfeksiyon ortamında gerekli yoğunluğa ayarlar. İmmüno boyamadan iki gün önce tohumlanan insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri veya H-B-M-E-C-A, 12 oyuklu bir plakanın kuyularına 16 milimetre cam örtü kayar ve tohum HBME denizleri% 50 oranında Örtü kızakları üzerinde birleşim, ertesi gün% 5 karbondioksit atmosferinde% 37 santigrat derecede gece boyunca kuluçkaya yatırılır.

Laboratuvarımızda taze hazırlanmış bakteri süspansiyonu ile hücreleri enfekte edin. Hedef hücre başına 200 ila 300 koloni oluşturan birim enfeksiyon oranı rutin olarak kullanılmaktadır. Enfeksiyon süresinin sonunda% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede üç ila sekiz saat inkübe edin.

Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca 500 mikrolitre% 2 para formaldehiti sabitleyin Para formaldehiti yıkadıktan sonra, paradehit ile sabitlenmiş hücrelere PBS içinde seyreltilmiş %0.1 Triton X 100 içinde 10 dakika inkübe ederek geçirgenlik kazandırın. Son olarak, numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve gösterildiği gibi immün boyamaya devam edin. Daha sonra hücre içi bakteri ve dfor aktinin boyanması aynı anda yapılabilir.

12 oyuklu plakalarda, geçirgen hücreleri içeren kapak kızaklarını 500 mikrolitre %3 B-S-A-P-B-S-T ile 30 ila 60 dakika bloke eder. PBS transferi ile yıkandıktan sonra oda sıcaklığında, her bir örtü kayması, bakteri ve alfa aktinin'e karşı primer antikorlarda 12 oyuklu plakada aynı anda yeni bir kuru kuyuya yeterlidir, kapak kaymasının yüzeyini kaplamak için dikkatlice eklenirse, kapak kaymasının yüzeyini kaplamak için dikkatlice eklenirse, oda sıcaklığında bir saat inkübe edin İnkübasyon sonunda, içine 200 mikrolitre PBS ekleyin, kapak fişini iyice kaldırın ve 500 mikrolitre PBS içeren yeni bir kuyuya yerleştirin Beş dakika sonra, PBS'yi pipetleyerek çıkarın ve ardından taze PBS ekleyin. İki kez tekrarlayın ve kapak fişlerini yeni bir kuru kuyuya aktarın.

Daha sonra,% 1 B-S-A-P-B-S-T içinde seyreltilmiş farklı florokromlara konjuge edilmiş uygun ikincil antikorları ekleyin, inkübasyonun sonunda oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin, yıkama daha önce gösterilmiştir, daha sonra DNA'yı DPI ile karşı boyayın, oda sıcaklığında karanlıkta beş dakika boyunca bu inkübasyonun sonunda kapak fişlerini PBS'de bir kez yıkayın ve ardından bir damla montaj ile monte edin. Orta monteli kapak fişleri, gözlem için hazır olana kadar karanlıkta saklanmalıdır. Mikroskop altında, ters çevrilmiş bir epi floresan mikroskobuna bağlı konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immün etiketli örneklerimizi gözlemliyor ve görüntülerini yakalıyoruz.

Objektife bir damla daldırarak CLSM prosedürüne başlamak ve numune slayt kapağını yerleştirmek, mikroskop tablasına kaymak, mikroskobu görsel moda ayarlamak ve mikroskobun göz parçalarını kullanarak ilgilenilen alanı bulmak için artık Leica yazılımını kullanmaya hazırız. XY zed edinme modunu seçin. Birlikte yerelleştirme çalışmaları için beş 12'ye beş 12 formatını seçin.

Çözünürlük ne kadar yüksek olursa, görüntü o kadar doğru olur. Ardından, tarama hızını artıracak ve fotoğraf ağarmasını azaltmaya yardımcı olacak çift yönlü X modunu seçin. Sıralı tarama ayarlarını yapın.

SEC işlevine tıklayın ve ardından satırlar arasında seçim yapın. İkincil antikorlara konjuge edilmiş florokromlara göre lazer ışınlarını seçin. DPI için 4 0 5 nanometre Alexa, Fluor 4 88 ve 5 61 nanometre için 88 nanometre.

Trixy için sırasıyla bir, iki ve üç fotoçoğaltıcı tüpü etkinleştirin. Z yığınının veya serisinin üstünü ve altını ayarlayın. Sonraki set, Zed adım boyutu 0.2 mikrometreye.

RIA Mencius bir diplo occus'tur ve her bir grubun çapı yaklaşık 0.5 mikrometre olduğundan, 0.2 mikrometrelik bir Z adım boyutu, her bir grubu en az iki kez tarama olasılığını artırır. Başlat'a tıklayarak sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için üç satır ortalamasını seçerek son tarama parametrelerini ayarlayın. Çift veya üçlü lekeli görüntüler, farklı dalga boylarında sıralı tarama ve farklı kromoforlar arasındaki karışmayı ortadan kaldırmak için her kanal için satır arası modunun kullanılmasıyla elde edilir.

İki florokromun birlikte lokalizasyonunun bir göstergesi için, seçilen kanalları tek bir görüntüde birleştirmek için kaplama işlevini seçin. Örneğin, hem Alexa 4 88 hem de trissy Fluor Chromes birlikte yerelleştirildiğinde, üst üste binen görüntüde sarı renk görünecektir: Olası yerelleştirmeyi görselleştirmek için gerekli olan bir 2D rekonstrüksiyon, maksimum projeksiyon işlevini kullanarak Zed yığınını veya serisini derler. Z yığınını veya serisini aldıktan sonra, çeşitli öğelerin hücre içi lokalizasyonunun görselleştirilmesi için ortogonal bir görüntü elde etmek üzere verilerinizi işleyin.

Yerelleştirmenin niceliksel olarak belirlenmesi, IMP provizyonundan Vol City yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. CLSM görüntüleriyle bir kitaplık oluşturmaya başlamak için, üst çubuktaki görüntüden genişletilmiş odağı seçin. Bu araç, Zacks'i analiz edilecek bir 2B görüntüde birleştirecektir.

Şimdi COLOCALIZATION aracını seçin. Analiz edilecek iki kanal aynı renk derinliğine sahip olmalıdır. Ölçülecek alanı seçin.

Herhangi bir arka planı kaldırmak için eşiği ayarlayın. Yerelleştirme oluştur'u seçerek yerelleştirme çıktısı oluşturun. Yerelleştirme İstatistikleri, daha önce seçilen ilgi alanları için oluşturulacaktır.

Ardından, mander'in R ve ny katsayılarını seçin. Son olarak, burada sekiz saat boyunca meninga cockeye ile enfekte olmuş insan beyni endotel hücrelerinin temsili bir konfokal görüntüleme sonuçlarını gösteren veri sunumu için değerleri bir Excel belgesine aktarın veya istatistik edin. Bakterilerin yeri kırmızı ile gösterilmiştir.

Alfa aktinin'in yeri yeşil oklarla gösterilirken, oklar bakteri çevresinde yüksek derecede alfa aktinin birikiminin meydana geldiği bölgeleri göstermektedir. Bu bindirme görüntüsünde, meninga oksi ve alfa aktinin arasında kolokalizasyonu düşündüren sarı turuncu rengin göründüğü birkaç bölge vardır. Bu sonraki görüntüde, enfekte olmuş bir H-B-M-E-C tek tabakasının optik diseksiyonu, bir hücrenin tabanında bulunan hücre içi bakterilerin etrafındaki kolokalizasyonu gösterir.

Enfekte H-B-M-E-C Tek tabakalarının üç boyutlu görüntüleri işlendiğinde, apikal yüzeyin eğik bir görünümü, sarı okla gösterilen endotel hücrelerinin bazal yüzeylerine doğru yerleşen birkaç bakterinin kırmızı okla gösterilen kırmızıya boyanmış bir Durant bakterisini gösterir. Bu endon XZ kesitinde belirgin bir şekilde turuncu, sarı renkli bir bazal konum daha net görülebilir. Afar'ın aksine, içselleştirilmiş bakterilerin ve menton veya aktinin etiketlendiği aktinin deneyleri, aktin ile ara sıra kolokalizasyonu, ancak H-B-M-E-C hücrelerinde fermantasyon ile nadir kolokalizasyonu ortaya koymaktadır.

Önceki deneylerde gözlemlendiği gibi, Retin, beyaz oklarla gösterilen birkaç içselleştirilmiş bakteri etrafında yoğunlaştı. Veriler ayrıca göreceli örtüşme elde etmek için analiz edildi. Manda'ya göre, gerçek kolokalizasyon derecesini temsil eden R katsayısı, yani toplam piksel sayısı ve alfa aktinin için NY değerleri ile karşılaştırıldığında birlikte lokalize olan piksel sayısı, meningokokları eksprese eden OPC ile enfekte olmuş H-B-M-E-C'de genel olarak menting ve aktin, bir meningokokta %25'ten fazla dizgin örtüşmesi elde edildi.

Katsayı ve Y, daha az miktarda bulunan meninga kakao sinyali her meydana geldiğinde daha bol olan dizgin sinyalinin bir para biriminin frekansının bir ölçüsüdür. Bu ölçüm, içselleştirilmiş meninga cockeye civarında çarpıcı bir alfa aktinin oluşum seviyesini göstermektedir. Bu deneyde size içselleştirilmiş bakterilerin hücre iskeleti elemanlarıyla girişini nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi gösteriyoruz.

Yapıların bütünlüğünü korumak ve yüksek bir arka plandan kaçınmak için sabitleme ve bağışıklık sapı protokollerini sıkı bir şekilde takip etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.