Name: Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin canlı bakteri hücrelerinde tek molekül floresan mikroskobisi ile fonksiyonel moleküler kompleksleri görselleştirme, izleme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol hücre biyolojisi araştırmaları için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Prof. Judith Armitage (Oxford Üniversitesi, İngiltere) ve Prof. Conrad Mullineaux (Londra Queen Mary Üniversitesi, UK) grupları bakteri suşlarının tür bağışlar kabul etmiş oluyorsunuz. IMD Biyokimya Bölümü (Oxford Üniversitesi) ve OCISB tarafından ortaklaşa finanse edilen AR Mühendislik ve Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) DTC öğrencilikle tarafından finanse edilmektedir; ND Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) finanse edilmektedir; MCL Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu tarafından finanse edilmektedir.

<ol><li> Bu yordamı başlamak için, Escherichia coli bakteri hücrelerinin ifade floresan protein dondurulmuş stoklarının 50 ul ilk çözülmüş ve C. sabah 37 derece gecede 5 ml LB büyüme ortamı sallayarak aerobik yetiştirilen, bu doymuş kültür 50 ul ayıklanır 4 ila 6 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe minimal M63 glikoz kültür ortamı, alt-kültür. Burada, biri bir elektron taşıma ifade iki farklı hücre suşları, açıklamak GFP, GFP için erimiş bakteriyel flagellar motor yer alan bir protein ifade diğer erimiş sitokrom. </li><li> Hücreler, büyüyen alt-kültür immobilize örnekleri olarak varsa da doğrudan hasat, ya da &quot;gergin&quot; koşullar altında görüntülerken, bakteri kamçısı kesecek makaslanmış olabilir. </li><li> Kırpma, steril boru ile birleştirilmiş iki steril şırıngalar oluşan bir cihazın içine alt-kültür genellikle 1-5ml yerleştirerek içerir. Kesme dar bir boru aracılığıyla kültür itmek için her şırınga pompası iterek alternatif ile yapılır. Bu gerekli kesme ölçüde bağlı olarak, 50-100 kez yapılır. Kültür kamçı parçalarını kaldırmak için asgari medya yeniden süspanse pelet hücreler, daha sonra santrifüj edilir. </li><li> Daha sonra 20 dakika için etanol KOH doymuş bir çözüm çeker, sonra de-iyonize su ve etanol iyice durulama ve en az 1 saat boyunca kurumaya bırakarak BK7 cam lamelleri temizlenir hazırlamak </li><li> Biz hücrelerin mikroskop evine basit bir akış hücresi oluşturmak. Bu parafin yağ hatları BK7 cam mikroskop lamı üzerine çizim ve daha sonra bir tünel sandviç oluşturarak üstüne temizlenir coverlips birini koyarak ve forseps bir çift ile hafifçe aşağı doğru bastırarak, 5-10 ul bir akış hücresi hacmi veren içerir . </li><li> Immobilize hücreler gözlemlemek için% 0.1 w / v poli-L-lisin bir çözüm akış hücre enjeksiyonu ile doldurmak ve en az 1 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin. Daha sonra 100 ul minimal medya akışını hücrenin bir ucundan, medya enjekte ve diğer kağıt mendil ile esneklik kullanarak dışarı floş. </li><li> Daha sonra lamel yüzey işaretlemek için minimum medya, 200 nm çaplı lateks mikroküreler (Polysciences) bir 1:500 dilüsyon 20 ul fitil. Akış hücre lamel aşağıya doğru, basit bir nem odası yüzey açık bir platform üzerine yerleştirilen karşı karşıya olduğu gibi ters ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Unbound boncuk sonra 100 ul minimal medya aracılığıyla esneklik yıkanır. </li><li> Gergin hücreleri gözlemlemek isterseniz, poli-L-lisin adım ihmal ve 5 mg / ml anti-flagellin antikor yerine akış hücre doldurun. Akış hücresi, 10 dakika nem odası yer ve sonra esneklik tarafından temizlendi. </li><li> Hücre kültürü 20 ul immobilize hücreleri inceleyen gergin hücreleri veya unsheared numune gözlemleyerek, ya makaslanmış örnek kullanarak, akış hücresi ile sonra kötülerin. </li><li> Akış hücre ters ve 20 dakika boyunca nem odasında yerleştirilir. Unbound hücreler daha sonra 100 ul minimal medya aracılığıyla esneklik tarafından yıkanır. </li><li> Bir damla immersiyon lamel üst yüzey merkezinde yerleştirilir ve akış-hücreli yüksek sayısal diyafram objektif lens ile optik temas eden, özel inşa edilmiş floresan mikroskop numune tutucu hafifçe yerleştirilir. </li><li> Elektron mikroskobu çarparak kamera açık ve kamera -70 ° C ye soğutulmalıdır. Ayarlamak, yazılım, başlangıçta kazanç kontrolü disenabling çerçeve transfer modunda 25 Hz tipik bir kare hızında görüntüler elde etmek için ayarlanır kamera. </li><li> Aydınlık aydınlatma açık ve görüntü lamel yüzey uzun eksenine paralel çakılı olmanın temelinde görüntülü hücreleri uygun bir hücre veya grup seçerek, odak noktası haline getirdi. Odak ince lamel yüzeyine yapışmış 200 nm lateks boncuk sadece odak noktası olmasını sağlamak için ayarlanabilir. </li><li> Hücre gövdesi taslağını kaydetmek için aydınlık bir görüntü dizisi elde edilir. Aydınlık aydınlatma kapalı ve kamera kazanç maksimum etkindir. </li><li> Toplam iç yansıma floresan (veya TIRF) uygun dalga boyu üzerinde bir lazer ışını (Burada, yeşil flüoresan protein uyarma, 473 nm lazer) kullanarak, standart bir satın alma için arka odak düzlemi odaklı olacak şekilde önceden ayarlanmıştır. objektif lens ama hücre örneği içine floresans uyarma için kaybolan bir alan oluşturmak üzere optik ekseni yanal yerinden. </li><li> Kamera alımına başlanması ve lazer deklanşör bakteri içinde floresan proteinleri heyecanlandırmak için açıldı. Lazer yoğunluk ve hız için satın alma parametreleri farklı değerler ile denemeler tarafından soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem için optimize edilmiş olması gerekir, ancak tipik bir aralığı r5-40 ms kare başına bir pozlama süresi ile, hücre zarı mobil protein kompleksleri okuyan elevant çapı ~ 30 mikron dairesel bir uyarım alana 1-10 mW lazer güç vardır. Örnekleri photobleached, genellikle ~ 10 sn kadar aydınlatılmış </li><li> Bu protokol hem vücut hücre lamel ve flagellar saplama arasında ek bir nokta etrafında dönen gergin hücreleri ve katı lamel yüzey sabit hareketsiz hücreler için kullanılabilir. </li><li> Kompleksleri yüksek bir kopya sayısı bazı hücre suşları TIRF görüntüleme önce hücre tek kutuplu bir başlangıç ​​kırınım sınırlı odaklı lazer çamaşır suyu yarar. Bu çamaşır suyu (ya da sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma kullanılan eşdeğerdir. Bizim özel mikroskop kullanarak ikaz lazer ışığı, sıkı bağlamak-tipi beyazlatma için kullanılan ikinci bir bağımsız yoluna beslenebilir. Genellikle 1-10mW lazer güç aralığı 10-300 ms tipik bir çamaşır suyu zaman kullanılır. Bu sonuçlar, daha sonra bu alana daha kolay görüntülenebilmekte diffüz bireysel kompleksleri sağlayan hücre ağartılmış bölge çok daha yüksek görüntüleme kontrast. </li><li> &quot;Slimfield&quot; olarak adlandırılan farklı bir aydınlatma modu istihdam hücre zarının dışında çok daha hızlı diffüz hücre sitoplazma kompleksleri görselleştirme. Burada odaklanmış bir lazer yanal sadece tek bir hücre kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Bu tipik bir milisaniyeden daha hızlı pozlama alınacak izin çok yoğun bir alan üretir. </li><li> Veri toplama, görüntüler, özel yazılmış yazılım (LabVIEW 8.5 kodlu) beslenir. Bu hücreleri genellikle birkaç nanometre hassas bir floresan noktalar pozisyonları otomatik olarak algılar ve kendi büyüklüğü ve parlaklığı ayıklar. Brightnessof, paletli bir moleküler kompleks zaman saygı ile photobleaching iz sonra stokiyometri tahmin etmek için kullanılan tek bir moleküler kompleks oluşturan kaç bireysel floresan proteinleri yani. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Protokol yapılır aydınlık içinde görüntülenen hücrelerin düzgün görüntüleri koyu bir beyaz / gri hücre gövdesi (Şekil 1a) karşı hücre gövdeleri çevrelerinin, çok farklı. Floresan immobilize hücreler kullanarak, farklı noktalar genellikle genişliği 250-300 nm (Şekil 1b) yoğunluğu, görebilirsiniz. Sağlıklı, gergin hücreleri aydınlık görüntüler halata eki nokta etrafında döndürmek için görülecektir. Floresans uyarma altında bizim durumumuzda bazı moleküler kompleksler flagellar motor etiketli protein lokalizasyonu gösteren eki noktada olabilir. Bu lekeler, bireysel moleküler kompleksler ve sayıda görülen onları aydınlatma modu ve komplekslerin çoğu aslında herhangi bir zamanda hücrede bulunur bağlıdır. Noktalar hareketlilik çalışma altında belirli bir biyolojik sistem bağlıdır. Lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksek ise, sonra bir ilk sıkı bağlamak çamaşır suyu görüntü kontrastı artırabilir gerçekleştirerek, burada kullanılan etiketli sitokromlar durumda. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. (A) aydınlık ve (B) hareketsiz bir Escherichia coli hücre için TIRF (sahte renk) bakteri flagellar motorlar yer olarak bilinen yeşil floresan protein (GFP) erimiş bir protein ifade. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">buraya tıklayınız</a> .

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bakım bu yana gergin bakteri bakarak &quot;flagellar motorlar üzerine kesme&quot; hücre işlevlerini bozabilir değil alınmalıdır. Oksijen tükenmiş olabilir hücreleri mikroskop lamı üzerine bir kez bir saat daha uzun kullanmak için önemlidir. Önemli bir optimizasyon en iyi mikroskop görüntüleme koşulları soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem yiyecek ve içecek bulmak için gerekli olabilir. Özellikle mikroskop sistemi için gerekli olan doğru yoğunluklu lazer uyarma tespit etmek için tek başına saflaştırılmış GFP k...

tek moleküler kompleksleri görselleştirme in vivo gelişmiş floresan mikroskopi

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Sadece hücresel düzeyde olayları ortaya çıkarmak ve doğrudan temel süreçleri araştıran, canlı hücrelerin mekanizmalarını içine tam fikir elde edilebilir. Yerine nispeten ham dökme topluluk ortalamanın ölçümler kullanılarak yapılan çalışmalarda tek sistemleri odaklanarak, biyolojik sistemlerin kayma karmaşıklığı Bugüne kadar çok talep olması kesin tek molekül deneyler neden oldu. Ancak, çok önemli süreçler, sadece bir düzeyinde yaşayan hücre ya da birkaç molekül oluşur; topluluk ölçümleri genellikle bu olayların stokastik ve heterojen doğası maske. Burada, gelişmiş optik mikroskop ve analitik görüntü analiz araçları kullanarak, tek bir canlı bakteri tek moleküllerin hassas bir hücre ve biyolojik makineleri işleyen moleküler kompleksler içinde dinamiklerini izleyebilirsiniz içinde proteinler izlemek için nasıl gösterilmektedir. Teknikleri fizyolojik doğrudan ilgili. Minimal pertürbatif ve biyolojik örnek çalışma altında non-invaziv ve yaşam malzemesi araştırmalar için tamamen uydurulmuş, biyofizik diğer tek-molekül yaklaşımlara hazır özellikleri. Buna ek olarak, biyolojik örneklerin hepsi doğal olarak ortaya daha belirgin olarak daha fazla protein üretmek için, daha sık ama daha az ideal bir yaklaşım karşı değiştirilmemiş hücre suşları (&quot;genomik kodlama&quot;), hemen hemen aynı seviyelerde floresan etiketli proteini üretmek okudu (&quot;plazmid ifade&quot;). Böylece, gerçek biyolojik örnekler ele alınacaktır doğal organizmalar için önemli ölçüde yakın ve gerçek fizyolojik süreçleri nedenle gözlemler daha uygun.

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Canlı hücrelerin mekanizmalarına dair tam bir anlayış, ancak hücresel düzeydeki olayları tetikleyen ve yönlendiren temel süreçlerin incelenmesiyle elde edilebilir...

Burada, fonksiyonel moleküler komplekslerin tespit edilmesini, izlenmesini ve miktarının belirlenmesini sağlamak amacıyla, canlı bakteri hücreleri üzerinde tek molekül floresan mikroskopisi gerçekleştirme protokolünü sunuyoruz. Bu protokol, floresan boya molekülüyle işaretlenmiş bir protein üreten bakterilerin büyütülmesiyle başlar. Dört ila altı saat sonra, kültürden küçük bir hacimde hücre alınır ve kamçı filamentleri kesme yöntemiyle kısaltılır.Akış hücresi içindeki bir cam lamel, hücrelerin yüzeye yapışmasını sağlamak için kaplanır. Hücreler akış hücresine enjekte edilir ve bir gellar sapı aracılığıyla sabitlenir; bu yapı, lazer uyarımı mikroskopisi kullanılarak floresan altında incelenir. Daha sonra, yüksek kuantum verimliliğine sahip bir kamera, işaretlenmiş moleküler komplekslerin parlak alan ve floresan görüntülerini kaydeder.Merhaba, benim adım Ian Doy; Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben Alex Robertson, fizik bölümünde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben de fizik bölümünde yer alan Leak laboratuvarından Nick De.Bugün, gelişmiş floresan mikroskobisi kullanarak canlı bakterilerdeki tekil moleküler komplekslerin görselleştirilmesi prosedürünü size göstereceğiz. Bu prosedürü, bunları fonksiyonel durumdayken incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca, doğal biyolojik makinelerin gerçek zamanlı dinamiklerini nanometre ölçeğinde araştırmak için de kullanmaktayız.Hadi başlayalım. Başlamak için, genetik olarak modifiye edilmiş dondurulmuş e coli bakterisi stoklarından 50 µL çözündürün.Bir proteini floresan boya molekülü ile işaretlemek için, beş mililitre LB büyüme besiyerini inoküle edin ve bakterileri 37 °C'de gece boyunca çalkalayarak aerobik koşullarda büyütün. Ertesi sabah, doygun kültürden 50 µL alın ve minimal M 63 Glikoz kültür besiyerine alt kültüre aktararak 30 °C'de dört ila altı saat inkübe edin. Burada iki farklı hücre suşu kullanılmıştır.Bunlardan biri, GFP ile kaynaştırılmış bir elektron taşıyıcı sitokrom ifade eder. Diğeri ise bakteriyel kamçı motorunda yer alan bir protein ifade eder. GFP ile kaynaştırılmış hücreler, immobilize örnekler olarak incelenecekse doğrudan büyüyen alt kültürden hasat edilebilir veya bağlanmış koşullar altında inceleneceklerse bakteriyel kamçıkları kısaltmak için kesme işlemine tabi tutulabilirler.Bakterileri parçalamak için, steril borulama yöntemiyle bir ila beş mililitre alt kültürü, iki steril şırıngadan oluşan bir düzeneğe yerleştirin. Elde edilen parçalanma derecesine bağlı olarak, kültürü dar tüplerden geçirmek için her bir şırınga pompasını sırayla yaklaşık 50 ila 100 kez itin. Ardından, hücreleri çöktürmek için kültürü santrifüjleyin ve kamçı fragmanlarını uzaklaştırmak amacıyla hücreleri minimal medyada yeniden süspanse edin. Hücreler hazır olduğunda, BK 7 cam lamellerini 20 dakika boyuncale potasyum hidroksit ve etanolün doygun bir çözeltisine daldırarak temizleyin.Deiyonize su ve etanol ile iyice durulayın ve en az bir saat boyunca havada kurumaya bırakın. Ardından, hücreleri mikroskopta barındırmak için basit bir akış hücresi oluşturun. Bunu yapmak için, bir BK seven cam mikroskop lamı üzerine parafin gresi ile çizgiler çizin ve ardından temizlenmiş lamel örtülerden birini üzerine yerleştirerek bir tünel sandviç yapısı oluşturun.Bir pens yardımıyla nazikçe aşağı bastırın. Bu işlem, 5 ila 10 µL hacminde bir akış hücresi oluşturmalıdır. İmmobilize edilmiş hücreleri gözlemlemek için, akış hücresini %0,1'lik poly L lysine çözeltisi enjekte ederek doldurun ve oda sıcaklığında en az bir dakika inkübe olmasını sağlayın.Ardından, akış hücresinin bir ucundan 100 µL minimal besiyeri enjekte ederek ve eş zamanlı olarak diğer uçtan kağıt havlu ile besiyerini çekerek akış hücresini yıkayın. Sonrasında, lamine cam yüzeyini işaretlemek için minimal besiyeri içinde 1/500 oranında dilüe edilmiş 200 nm çapındaki lateks mikrokürelerden 20 µL çekin. Akış hücresini basit bir nemlendirme kabına yerleştirin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Akış hücresi, lamine cam aşağı bakacak şekilde ters çevrilir.Bağlanmamış boncuklar daha sonra, doku kağıdıyla 100 µL minimal besiyeri üzerinden emdirme yapılarak yıkanır. Bağlanmış hücreleri gözlemlemek için bunun yerine poli L lizin inkübasyon adımını atlayın; akış hücresini 5 µg/mL Anti-Flag gellan antikor çözeltisi ile doldurun ve ardından 10 dakika boyunca nem odasına yerleştirin. İnkübasyon sonrası, doku kağıdıyla emdirme yaparak akış hücresini yıkayın.Ardından, ya bağlanmış hücreleri gözlemlemek için kesilmiş örneği ya da immobilize hücreleri görüntülemek için kesilmemiş örneği kullanarak, doku kağıdı aracılığıyla akış hücresinden 20 µL hücre kültürü emdirilir; akış hücresi ters çevrilir ve 20 dakika boyunca nem odasında bekletilir. Daha sonra, 100 µL minimal medya emdirilerek bağlanmamış hücreler yıkanır. Lamelin üst yüzeyinin merkezine bir damla immersiyon yağı damlatın.Akış hücresini, özel olarak yapılmış floresan mikroskobunun numune tutucusuna nazikçe yerleştirin. Bu işlem, yüksek sayısal açıklıklı objektif lens ile optik temas sağlanmasını sağlayacaktır. Ardından, mikroskobun elektron çarpanlı kamerasını açın ve kamerayı eksi 70 °C'ye soğutulacak şekilde ayarlayın.Yazılım, kare aktarım modunda, tipik olarak 25 hertz'lik bir kare hızında görüntü alacak şekilde ayarlanmıştır. Aydınlık alan aydınlatmasını açın ve görüntüyü odaklayın.Uzun eksenleri boyunca yapışık oldukları temelinde, görüntüsü alınacak uygun bir hücre veya hücre grubu seçin. Lamel yüzeyine paralel olarak, lamel yüzeyine yapışmış 200 nanometre latex boncukların tam odak noktasında olduğundan emin olmak için odağı ayarlayın. Hücre gövdesinin ana hattını kaydetmek için aydınlık alanda bir görüntü dizisi elde edin.Ardından parlak alan aydınlatması kapatılır ve toplam internal yansıma floresan (TIRF olarak da bilinir) kullanılarak görüntüleme yapmak için kamera kazancı maksimuma getirilir. Kamera çekimini başlatın ve bakterilerdeki floresan proteinleri uyarmak için lazer kepenklerini açın. Lazer yoğunluğu ve çekim hızı parametrelerinin, söz konusu biyolojik sisteme göre optimize edilmesi gerekir.İncelenen örnekler, genellikle yaklaşık 10 saniye süren fotobağlama (photo bleaching) gerçekleşene kadar aydınlatılır. Veriler toplandıktan sonra görüntüler, hücrelerdeki floresan lekelerin konumlarını birkaç nanometre hassasiyetle otomatik olarak tespit eden ve bunların boyutunu ve parlaklığını çıkaran özel olarak yazılmış bir analiz programına aktarılır. Ardından, çekici moleküler kompleksin zamana göre fotobağlama izinin parlaklığı, stokiyometriyi tahmin etmek için kullanılır.Bu yöntem kullanıldığında, parlak alan altında görüntülenen hücrelerin görüntüsü oldukça belirgindir; öyle ki, immobilize edilmiş hücrelerle floresan kullanıldığında, hücre gövdelerinin çevreleri beyaz gri hücre gövdesine karşı koyu görünür. Burada yalancı renkte gösterilen, tipik olarak 250 ila 300 nanometre genişliğinde belirgin yoğunluk noktaları görülebilir. Floresan uyarımı altındaki parlak alan görüntülerinde, sağlıklı sabitlenmiş hücrelerin bağlantı noktasının etrafında döndüğü görülebilir.Bazı moleküler kompleksler, bağlanma noktasında da görülebilir ve bu durum, etiketlenmiş proteinin Geller motoru ile lokalizasyonuna işaret eder. Bu noktalar, bireysel moleküler komplekslerdir. Bunlardan kaç tanesinin görüleceği, kullanılan aydınlatma moduna ve herhangi bir anda hücrede gerçekte kaç kompleksin bulunduğuna bağlıdır.Burada kullanılan işaretli sitokromlarda olduğu gibi, lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksekse, başlangıçta bir FRAP ağartma işlemi uygulamak görüntüleme kontrastını artırabilir. Lekelerin mobilitesi, incelenen spesifik biyolojik sisteme bağlıdır. Gelişmiş floresan mikroskopisi kullanarak tekil moleküler komplekslerin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk.Bu prosedür uygulanırken, kamçı motorunun işlevselliğini bozabileceği için hücrelerin makaslanmamasına dikkat edilmesi önemlidir. Ayrıca, oksijensiz kalabilecekleri için hücrelerin mikroskop lamları üzerinde bir saatten fazla bırakılmaması gerekir. En iyi görüntüleme koşullarını belirlemek için optimizasyon gereklidir.Kendi mikroskop sisteminiz için doğru lazer gücünü belirlemek amacıyla yalnızca saflaştırılmış GFP kullanmak faydalı olabilir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Öğrenin canlı bakteri hücrelerinde tek molekül floresan mikroskobisi ile fonksiyonel moleküler kompleksleri görselleştirme, izleme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol hücre biyolojisi araştırmaları için güçlü bir araç sunar.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Daha fazla video keşfet