Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Burada, fonksiyonel moleküler komplekslerin tespit edilmesini, izlenmesini ve nicelendirilmesini sağlamak amacıyla, canlı bakteri hücreleri üzerinde tek molekül floresan mikroskobisi gerçekleştirme protokolünü gösteriyoruz. Bu protokol, floresan bir boya molekülü ile etiketlenmiş bir protein üreten bakterilerin büyütülmesiyle başlar. Dört ila altı saat sonra, kültürden küçük bir hacimde hücre alınır ve flagella filamentleri makaslama yoluyla kısaltılır.

Bir akış hücresinin içindeki cam lamel, hücrelerin yüzeye yapışmasını sağlamak için kaplanır. Hücreler akış hücresine enjekte edilir ve lazer eksitasyon mikroskopisi kullanılarak floresan altında görüntülenen bir gellar stub aracılığıyla sabitlenir. Ardından, yüksek kuantum verimliliğine sahip bir kamera, işaretlenmiş moleküler komplekslerin parlak alan ve floresan görüntülerini kaydeder.

Merhaba, benim adım Ian Doy ve Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Mark Lee ile birlikte çalışıyorum. Ben Alex Robertson, fizik bölümünde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben de fizik bölümünde bulunan Leak laboratuvarından Nick De.

Bugün size, gelişmiş floresan mikroskobu kullanarak canlı bakterilerdeki tekil moleküler komplekslerin görüntülenmesi prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, bunları fonksiyonel bir durumda incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca, doğal biyolojik makinelerin gerçek zamanlı dinamiklerini nanometre ölçeğinde araştırmak için de kullanmaktayız.

Öyleyse başlayalım. Başlamak için, genetik olarak modifiye edilmiş, dondurulmuş 50 µL e coli bakterisi stoklarını çözdürün.

Bir proteini floresan boya molekülü ile işaretlemek için, beş mililitre LB besiyerini inoküle edin ve bakterileri 37 °C'de gece boyunca çalkalayarak aerobik olarak büyütün. Ertesi sabah, doygun kültürden 50 µL alın ve minimal M 63 Glikoz kültür besiyerine alt kültür olarak aktarıp 30 °C'de dört ila altı saat inkübe edin. Burada iki farklı hücre suşu kullanılmıştır.

Birinde GFP ile birleştirilmiş elektron taşıyıcı bir sitokrom eksprese edilir. Diğerinde ise bakteriyel kamçı motorunda görev alan bir protein eksprese edilir. GFP ile birleştirilmiş hücreler, immobilize örnekler olarak inceleneceklerse doğrudan büyüyen alt kültürden hasat edilebilir veya bağlanmış koşullar altında inceleneceklerse bakteriyel kamçıkları kısaltmak için kesme işlemine tabi tutulabilirler.

Bakterileri parçalamak için, subkültürden bir ila beş mililitreyi steril borulama yoluyla iki steril şırıngadan oluşan bir düzeneğe yerleştirin. Elde edilen parçalanma derecesine bağlı olarak, kültürü dar tüplerden geçirmek için her iki şırınganın pompasını sırayla yaklaşık 50 ila 100 kez itin. Ardından, hücreleri çöktürmek için kültürü santrifüjleyin ve flagella fragmanlarını uzaklaştırmak için hücreleri minimal medyada yeniden süspanse edin. Hücreler hazır olduğunda, BK 7 cam lamelini doygun potasyum hidroksit ve etanol çözeltisine 20 dakika daldırarak temizleyin.

Deiyonize su ve etanol ile iyice durulayın ve en az bir saat boyunca havada kurumaya bırakın. Ardından, hücreleri mikroskoba yerleştirmek için basit bir akış hücresi oluşturun. Bunu yapmak için, BK seven cam mikroskop lamı üzerine parafin gresi ile çizgiler çizin ve ardından temizlenmiş lamel kapaklardan birini üzerine yerleştirerek tünel şeklinde bir sandviç yapı oluşturun.

Bir pens yardımıyla nazikçe bastırın. Bu işlem, beş ila 10 µL'lik bir akış hücresi hacmi sağlamalıdır. İmmobilize hücreleri gözlemlemek için, %0,1'lik poli-L-lizin çözeltisi enjekte ederek akış hücresini doldurun ve oda sıcaklığında en az bir dakika inkübe edin.

Ardından, akış hücresinin bir ucundan 100 µL minimal besiyeri enjekte ederken aynı anda diğer ucundan kağıt havlu ile besiyerini çekerek akış hücresini yıkayın; sonrasında, lamel yüzeyini işaretlemek için minimal besiyerinde 1/500 dilüsyonunda hazırlanmış 200 nm çapındaki lateks mikrokürelerden 20 µL çekerek geçirin. Akış hücresini basit bir nem odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Akış hücresi, lamel aşağı bakacak şekilde ters çevrilir.

Bağlanmamış boncuklar daha sonra doku kağıdı ile 100 µL minimal besiyeri üzerinden emdirilerek yıkanır. Bağlı hücreleri gözlemlemek için poly L lysine inkübasyon adımını atlayın, bunun yerine akış hücresini 5 µg/mL Anti-Flag gellan antikor çözeltisi ile doldurun ve ardından 10 dakika boyunca nem odasına yerleştirin. İnkübasyonun ardından, doku kağıdı ile emdirme yaparak akış hücresini temizleyin.

Ardından, ya bağlanmış hücreleri gözlemlemek için kesme işlemine tabi tutulmuş örneği ya da immobilize hücreleri görüntülemek için kesme işlemine tabi tutulmamış örneği kullanarak, doku kağıdı yardımıyla akış hücresinden 20 microliters hücre kültürü emdirilir; akış hücresi ters çevrilir ve 20 dakika boyunca nem odasına yerleştirilir. Daha sonra, 100 microliters minimal medyum emdirilerek bağlanmamış hücreler yıkanır. Lamelin üst yüzeyinin merkezine bir damla immersiyon yağı damlatın.

Akış hücresini, özel yapım floresan mikroskobunun numune tutucusuna nazikçe yerleştirin. Bu işlem, yüksek sayısal açıklıklı objektif lens ile optik temas sağlanmasını sağlamalıdır. Ardından, mikroskobun elektron çarpanlı kamerasını açın ve kamerayı -70 °C sıcaklığa soğutulacak şekilde ayarlayın.

Yazılım, tipik olarak 25 hertz'lik bir kare hızında görüntü alacak şekilde ayarlanmıştır. Kare aktarım modunda, parlak alan aydınlatmasını açın ve görüntüyü odaklayın.

Uzun eksenleri boyunca yapışmış olmalarına dayanarak, görüntülenecek uygun bir hücre veya hücre grubu seçin. Lamel yüzeyine paralel olarak, lamel yüzeyine yapışmış 200 nanometre lateks boncukların tam odakta olduğundan emin olmak için odağı ayarlayın. Hücre gövdesinin ana hatlarını kaydetmek için parlak alan modunda bir görüntü dizisi elde edin.

Ardından aydınlık alan aydınlatması kapatılır ve TIRF (total internal reflection fluorescence) olarak da bilinen toplam internal yansıma floresan görüntüleme için kamera kazancı maksimuma getirilir. Kamera görüntülemesini başlatın ve bakterilerin içindeki floresan proteinleri uyarmak için lazer kepenklerini açın. Lazer yoğunluğu ve görüntüleme hızı parametrelerinin, söz konusu biyolojik sisteme göre optimize edilmesi gerekir.

İncelenen örnekler, tipik olarak yaklaşık 10 saniye süren fotobeyazlama gerçekleşene kadar aydınlatılır. Veriler toplandıktan sonra görüntüler, hücrelerdeki floresan lekelerin konumlarını birkaç nanometrelik hassasiyetle otomatik olarak tespit eden ve boyutları ile parlaklıklarını çıkaran özel yazılmış bir analiz programına aktarılır. Ardından, çekici moleküler kompleksin zamana bağlı fotobeyazlama izinin parlaklığı, stokiyometri tahmini için kullanılır.

Bu yöntem kullanıldığında, parlak alan altında görüntülenen hücrelerin görüntüsü oldukça belirgindir; öyle ki, immobilize edilmiş hücrelerle floresan kullanıldığında hücre gövdelerinin çevreleri, beyaz-gri hücre gövdesine karşı koyu görünür. Genellikle 250 ila 300 nanometre genişliğinde olan belirgin yoğunluk noktaları, burada yalancı renkte gösterilmiştir. Sağlıklı sabitlenmiş hücrelerin, floresan uyarımı altındaki parlak alan görüntülerinde, sabitleme bağlantı noktası etrafında döndükleri görülebilir.

Bazı moleküler kompleksler, tanklenmiş proteinin Geller motoru ile lokalizasyonuna işaret edecek şekilde tutunma noktasında da görülebilir. Bu noktalar bireysel moleküler komplekslerdir. Bunlardan kaç tanesinin görüleceği, kullanılan aydınlatma moduna ve herhangi bir anda hücrede gerçekte kaç kompleksin bulunduğuna bağlıdır.

Burada kullanılan işaretli sitokromlarda olduğu gibi, lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksekse, ön bir FRAP ağartması yapmak görüntüleme kontrastını artırabilir. Lekelerin mobilitesi incelenen spesifik biyolojik sisteme bağlıdır. Gelişmiş floresan mikroskopisi kullanarak tekil moleküler komplekslerin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, kamçı motorunun işlevselliğini bozabileceği için hücrelerin makaslama kuvvetine maruz kalmamasına dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, oksijen tükenmesi yaşanabileceği için hücrelerin mikroskop lamları üzerinde bir saatten fazla bırakılmaması gerekir. En iyi görüntüleme koşullarını belirlemek için otomasyon gereklidir.

Kullandığınız mikroskop sistemine uygun doğru lazer gücünü belirlemek için tek başına saflaştırılmış GFP kullanmak faydalı olabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.