Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Burada, fonksiyonel moleküler komplekslerin tespit edilmesini, izlenmesini ve miktarının belirlenmesini sağlamak için canlı bakteri hücreleri üzerinde tek moleküllü floresan mikroskobu gerçekleştirme protokolünü gösteriyoruz. Bu protokol, bir floresan boya molekülüne etiketlenmiş bir protein yapan bakterilerin büyümesiyle başlar. Dört ila altı saat sonra, kültürden küçük bir hacimde hücre ekstrakte edilir ve flagella filamentleri kesme ile kesilir.

Bir akış hücresinin içindeki bir cam kapak kayması, hücrelerin yüzeye yapışmasını sağlamak için kaplanır. Hücreler akış hücresine enjekte edilir ve lazer uyarma mikroskobu kullanılarak floresan olarak görüntülenen bir jel saplama yoluyla bağlanır. Yüksek kuantum verimliliğine sahip bir kamera daha sonra etiketli moleküler komplekslerin parlak parlak alan ve floresan görüntülerini kaydeder.

Merhaba, benim adım Ian Doy ve Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nde Mark Lee ile çalışıyorum. Ben Alex Robertson, fizik bölümünde Mark Lee ile birlikte çalışıyorum. Ben sızıntı laboratuvarından Nick De, yine fizik bölümünde çalışıyorum.

Bugün size gelişmiş floresan mikroskobu kullanarak canlı bakterilerdeki tek moleküler kompleksleri görselleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü şu amaçlarla kullanıyoruz: Bunu işlevsel bir durumda incelemek. Ayrıca doğal biyolojik makine ve nanometre lens ölçeğinin gerçek zamanlı dinamiklerini araştırmak için de kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Başlamak için 50 mikrolitre donmuş e coli bakteri sapını çözün. Bunlar genetik olarak değiştirilmiştir.

Bir proteini floresan boya molekülü ile etiketlemek için, beş mililitre LB büyüme ortamını aşılayın ve bakterileri gece boyunca 37 santigrat derecede aerobik olarak sallayarak büyütün. Ertesi sabah, doymuş kültürden 50 mikrolitre alın ve minimum M 63 Glikoz kültürü ortamına alt kültürleyin, dört ila altı saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Burada iki farklı hücre suşu kullanılır.

Biri, GFP'ye kaynaşmış sitokrom taşıyan bir elektronu ifade eder. Diğeri ise bakteri kamçı motorunda yer alan bir proteini ifade eder. GFP'ye kaynaşmış hücreler, hareketsiz hale getirilmiş numuneler olarak görüleceklerse doğrudan büyüyen alt kültürden hasat edilebilir veya bağlı koşullar altında görüntüleniyorlarsa bakteri kamçısını kesmek için kesilebilirler.

Bakterileri kesmek için, bir ila beş mililitre alt kültürü steril borularla iki steril şırıngadan oluşan bir cihaza yerleştirin. Elde edilen kesme derecesine bağlı olarak kültürü dar borudan yaklaşık 50 ila 100 kez zorlamak için her bir şırınga pompasında alternatif itme Daha sonra, hücreleri peletlemek için kültürü santrifüjleyin ve ardından flagella parçalarını çıkarmak için hücreleri minimal ortamda yeniden süspanse edin. Hücreler hazır olduğunda, 20 dakika boyunca doymuş bir potasyum hidroksit ve etanol çözeltisine batırarak temizlenmiş BK yedi cam kapak fişi hazırlayın.

Deiyonize su ve etanol ile iyice durulayın ve en az bir saat kurumaya bırakın. Ardından, hücreleri mikroskopta barındırmak için basit bir akış hücresi oluşturun. Bunu yapmak için, bir BK yedi cam mikroskop lamı üzerine parafin gresi çizgileri çizin ve ardından temizlenmiş lamel kızaklardan birini üstüne yerleştirerek bir tünel sandviçi oluşturun.

Bir çift forseps ile hafifçe bastırın. Bu, beş ila 10 mikrolitrelik bir akış hücresi hacmi vermelidir. İmmobilize hücreleri gözlemlemek için,% 0.1'lik bir poli L lizin çözeltisi enjekte ederek akış hücresini doldurun ve oda sıcaklığında en az bir dakika inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, akış hücresinin bir ucundan 100 mikrolitre minimal ortam enjekte ederek ve aynı anda ortamı diğer ucundan kağıt mendil ile akış hücresinden geçirerek akış hücresini yıkayın, WIC 20 mikrolitre attı 500'de bir seyreltme 200 nanometre çapında lateks mikroküreler kapak kayma yüzeyini işaretlemek için minimum ortamda. Akış hücresini basit bir nem odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Akış hücresi, kapak kaymağı aşağı bakacak şekilde ters çevrilir.

Bağlanmamış boncuklar daha sonra kağıt mendil ile 100 mikrolitre minimum ortamdan geçirilerek yıkanır. Bağlı hücreleri gözlemlemek için, bunun yerine poli L lizin inkübasyon adımını atlayın, akış hücresini mililitre Anti-Flag gellan antikor çözeltisi başına beş mikrogram ile doldurun ve ardından 10 dakika boyunca bir nem odasına koyun. İnkübasyondan sonra, akış hücresini kağıt mendil ile fitilleyerek yıkayın.

Daha sonra, WIC 20 mikrolitre hücre kültürü, doku kağıdı ile akış hücresi boyunca, ya bağlı hücreleri gözlemlemek için kesilmiş numuneyi ya da hareketsiz hücreleri görüntülemek için paylaşılmamış numuneyi kullanarak, akış hücresi ters çevrilir ve 20 dakika boyunca nem odasına yerleştirilir. Bağlanmamış hücreler daha sonra 100 mikrolitre minimum ortamdan geçirilerek yıkanır. Kapak kaymasının üst yüzeyinin ortasına bir damla daldırma yağı koyun.

Akış hücresini, özel yapım floresan mikroskobunun numune tutucusuna nazikçe yerleştirin. Bu, yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip objektif lensi ile optik temas sağlamalıdır. Ardından, mikroskobun elektron çarpma kamerasını açın ve kamerayı eksi 70 santigrat dereceye kadar soğutulacak şekilde ayarlayın.

Yazılım, görüntüleri 25 hertz'lik tipik bir kare hızında elde edecek şekilde ayarlanmıştır. Çerçeve aktarım modunda. Parlak alan aydınlatmasını açın ve görüntüyü netleyin.

Uzun eksenlerine takılıp kalmalarına göre görüntülenecek uygun bir hücre veya hücre grubu seçin. Kapak kayma yüzeyine paralel olarak, kapak kayma yüzeyine yapışan 200 nanometre lateks boncukların tam odakta olduğundan emin olmak için odağı ayarlayın. Hücre gövdesinin ana hatlarını kaydetmek için parlak alanda bir görüntü dizisi elde edin.

Daha sonra parlak alan aydınlatması kapatılır ve kamera kazancı, çim olarak da bilinen toplam dahili yansıma floresansı kullanılarak görüntüleme için maksimuma ayarlanır. Kamera alımını başlatın ve bakterilerin içindeki floresan proteinleri uyarmak için lazer deklanşörünü açın. Lazer yoğunluğu ve alım hızı parametrelerinin belirli biyolojik sistem için optimize edilmesi gerekir.

Çalışma altında numuneler, tipik olarak yaklaşık 10 saniye süren fotoğraf ağartılana kadar aydınlatılır. Veriler toplandıktan sonra, görüntüler, hücrelerdeki floresan noktaların konumlarını birkaç nanometre hassasiyetle otomatik olarak algılayan ve boyutlarını ve parlaklıklarını çıkaran özel bir yazılı analiz programına beslenir. Foto ağartma izinin moleküler kompleksi çekme zamanına göre parlaklığı daha sonra stokiyometri kullanımını tahmin etmek için kullanılır.

Bu yöntemi kullanarak, parlak alanda görüntülenen hücrelerin görüntüsü çok belirgindir, öyle ki hücre gövdelerinin çevresi, hareketsiz hücrelerle floresan kullanan beyaz gri bir hücre gövdesine karşı karanlıktır. Tipik olarak 250 ila 300 nanometre genişliğinde farklı yoğunluk noktaları burada yanlış renkte gösterilebilir. Sağlıklı bağlı hücrelerin, floresan uyarımı altında parlak alan görüntülerinde bağ bağlanma noktası etrafında döndüğü görülebilir.

Bazı moleküler kompleksler, bağlanma noktasında da görülebilir, bu da tanklanmış proteinin Geller motoru ile lokalizasyonunu gösterir. Bu lekeler bireysel moleküler komplekslerdir. Görülenlerin sayısı, kullanılan aydınlatma moduna ve herhangi bir zamanda hücrede kaç tane kompleksin gerçekten bulunduğuna bağlı olacaktır.

Burada kullanılan etiketli sitokromlarda olduğu gibi, lekelerin yoğunluğu başlangıçta çok yüksekse, ilk frap ağartıcı işlemi yapmak görüntüleme kontrastını iyileştirebilir. Lekelerin hareketliliği spesifik biyolojik sisteme bağlıdır. Çalışma altında, Gelişmiş floresan mikroskobu kullanarak tek moleküler kompleksleri nasıl görselleştireceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, bayrak motorunun işlevselliğini bozabileceğinden, bir kesme hücresine sahip olmamak önemlidir. Hücreleri mikroskop slaytları üzerinde bir saatten fazla bırakmamak da önemlidir, çünkü oksijensiz kalabilirler. En iyi görüntüleme koşullarını bulmak için otomasyon gereklidir.

Özel mikroskop sisteminiz için doğru lazer gücünü belirlemek için saflaştırılmış GFP'nin tek başına kullanılmasına yardımcı olabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.