Name: Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Keşfedin: Aktin ve mikrotübül dinamiklerini aynı reaksiyonda görselleştirmek için TIRF mikroskobu kullanan bu yöntem, düzenleyici proteinlerin ortaya çıkan özelliklerini değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marc Ridilla'ya (Repair Biotechnologies) ve Brian Haarer'e (SUNY Upstate) bu protokol hakkındaki yararlı yorumları için minnettarım. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM133485) tarafından desteklenmiştir.

1. Kapak kapaklarının yıkanması
NOT: Smith ve ark., 201328'e göre kapak kapaklarını yıkayın (24 mm x 60 mm, #1.5).
<ol><li>Kapak fişlerini plastik bir slayt posta kabına yerleştirin.</li>
	<li>Kapakları aşağıdaki çözeltilerde sırayla daldırır ve 30-60 dakika boyunca sonikat yapar, her çözelti arasında ddH 2 O 10kez durulayın: ddH2O bir damla bulaşık sabunu ile; 0,1 M KOH. Kapakları 6 aya kadar 0 etanol içinde saklayın. NOT: Cam yüzeylere sevilmeyen parmaklarla dokunmayın. Bunun yerine forseps kullanın.</li>
</ol>2. Kaplama temizlenmiş (24 mm x 60 mm, #1,5) kapaklar mPEG- ve biotin-PEG-silan ile
NOT: Bu protokol, aktin ve mikrotübülleri TIRF görüntüleme düzlemi içinde konumlandırmak için özel olarak bir biyotin-streptavidin sistemi kullanır. Diğer kaplamalar ve sistemler kullanılabilir (örneğin, antikorlar, poli-L-lizin, NEM miyosin, vb.).
<ol><li>PEG-silan ve biotin-PEG-silan tozlarının alikotlarını çözün.</li>
	<li> </li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li><li></li><li></li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li> <ol><li></li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><ol><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li><li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li></ol><ol><li></li><li></li><li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li><ol><li><li></li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><ol><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li><li></li></ol></li></ol></li><li><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li></li><li></li></ol></li></ol>

Açıklanacak çıkar çatışması yoktur.

Görselleştirilmiş saflaştırılmış proteinler için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunun kullanılması, sitoiskelet regülasyonunun benzersiz mekanizmalarını incelemek için verimli ve zorlayıcı bir yaklaşım olmuştur 5,23,24,25,26,27,35. Geleneksel biyokimyasal analizlerle karşılaştırıldığında, TIRF reaksiyonları çok küçük hacimler (50-100 μL) gerektirir ve sitoiskelet dinamiklerinin nicel ölçümleri bireysel bir tahlilden toplanabilir. Sitoiskelet dinamiği üzerine yapılan çalışmaların çoğu, tek bir polimer sistemine (yani, aktin filamentleri veya mikrotübüller) odaklanır, bu nedenle tipik olarak hücrelerde görülen aktin filamentleri ve mikrotübüller arasındaki çapraz konuşma veya ortaya çıkan davranışların ayrıntılı ölçümleri, test tüpünde özetlenmesi zor ve zor kalmıştır. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, aynı biyokimyasal reaksiyonda dinamik aktin ve mikrotübül polimerlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan tek filamentli bir TIRF mikroskopi sistemini tanımlamaktadır. Böylece, bu yöntem tek başına aktin filamentlerinin veya mikrotübüllerin dinamik davranışını özetleyen geleneksel testlerin ötesine geçer. Bu teknik, bir sitoiskelet bağlantı faktörünün varlığında birkaç dinamik özelliğin nasıl değiştiğine bir örnek olarak Tau ile de gerçekleştirildi. Bu protokol, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası dahil (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) aktin veya mikrotübül dinamiklerini koordine ettiği bilinen veya şüphelenilen ek proteinlerle kullanılabilir. Son olarak, sağlanan örnek analizler, bu protokolle elde edilen verileri ölçmek için bir rehber olarak kullanılabilir.
"Görmek inanmaktır", mikroskopi tabanlı tahliller yapmak için zorlayıcı bir nedendir. Bununla birlikte, TIRF mikroskopi deneylerinin yürütülmesinde ve yorumlanmasında dikkatli olunması gerekmektedir. Sitoiskelet birlikte montaj testlerinin en büyük zorluklarından biri, yaygın olarak kullanılan birçok görüntüleme koşulunun her polimerle uyumlu olmamasıdır. Mikrotübüller ve aktin tipik olarak polimerizasyon için farklı tampon, sıcaklık, tuz, nükleotid ve konsantrasyon gereksinimlerine sahiptir. Aktin, tübülin, ilgili düzenleyici proteinler ve bu protokolde kullanılan tamponlar donma-çözülme döngülerine duyarlıdır. Bu nedenle, bu protokolü başarılı bir şekilde yürütmek için proteinlerin ve tamponların dikkatli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu endişelerin çoğunu hafifletmek için, taze geri dönüştürülmüş tübülin (<6 hafta boyunca dondurulmuş) kullanılması ve ultrasantrifüjleme yoluyla dondurulmuş / yeniden askıya alınmış aktinlerin önceden temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu hususlar, bu prosedürle değerlendirilecek sayısız düzenleyici protein için de geçerlidir; bunlar donma-çözülme döngülerine veya tampon tuzlarının konsantrasyonuna duyarlı olabilir 5,11,36.
Ne yazık ki, deneysel ödünleşimler olmadan tek bedene uyan tüm tamponlar mevcut değildir. Daha düşük konsantrasyonlu proteinler için daha fazla hacim elde etmek için, ATP ve GTP 2x TIRF tampon çözeltisine dahil edilebilir (Şekil 1C). Bununla birlikte, bu nükleotidler donma-çözülme döngülerine karşı son derece hassas olduklarından, tavsiye edilmez. Burada kullanılan oksijen süpürücü bileşikler (yani, katalaz ve glikoz-oksidaz), proteinleri uzun süre (dakikalar ila saatler) görselleştirmek için gereklidir, ancak mikrotübül polimerizasyonunu yüksek konsantrasyonlarda kısıtladığı bilinmektedir5. Bu tampon hususlarla ilgili olarak, bu protokolün bir sınırlaması, bazı kanonik mikrotübül ile ilişkili düzenleyici proteinlerin, hücrelerde bulunan işlevleri veya tahlilleri tek başına mikrotübülleri kullanarak (aktin olmadan) özetlemek için az ya da çok tuz gerektirebilmesidir. Bu endişeleri gidermek için tuzun doğasını veya konsantrasyonunu değiştirmek, aktin filament polimerizasyon oranlarını ve / veya mikrotübül dinamiklerinin parametrelerini muhtemelen etkileyecektir. Çoklu tanımlayıcı parametrelerin ölçümleri (minimum, çekirdeklenme, uzama oranları ve stabilite) (Şekil 3), protokol başarısını doğrulamak veya spesifik tamponların veya düzenleyici proteinlerin etkilerini açıkça belgelemek için gereklidir. Örneğin, çok fazla aktin filament polimerizasyonu, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını saniyeler içinde gizleyebilir. Sonuç olarak, aktinin genel konsantrasyonunu düşürerek veya aktin nükleasyonunu (yani profilin) baskılamak için ek proteinler ekleyerek deneysel koşullara ince ayar yapmak, koordineli aktin-mikrotübül aktivitelerinin açıkça görülebildiği genel süreyi uzatacaktır. Bu önkoşulları ele alan denetimler ve teknik çoğaltmalar (birden çok görüş alanının ötesinde), kullanıcıların güvenilir ve yeniden üretilebilir sonuçlar üretmesi için kritik öneme sahiptir.
Hücre bazlı çalışmalar, doğrudan protein-protein ilişkilerini veya düzenleyici komplekslerin etkisini gözlemlemek için sınırlı fırsat sağlar. Buna karşılık, in vitro tahlillerden toplanan mekanizmaların bazıları her zaman hücrelerde görülen proteinlerin kesin davranışlarını yansıtmaz. Bu klasik biyokimyacı ikilemi bu tekniğin gelecekteki uygulamalarında spesifik modifikasyonlarla ele alınabilir. Örneğin, fonksiyonel floresan olarak etiketlenmiş kuplaj proteinlerinin eklenmesi, bu yöntemi tek filament çalışmalarından tek moleküllü çalışmalara genişletir. Tahliller, hücre benzeri fenomenleri özetlemek için gereken "eksik" bilinmeyen anahtar faktörleri ekleyebilecek hücre ekstraktlarını kullanmak için daha da değiştirilebilir. Örneğin, maya veya Xenopus ekstraktlarını kullanan TIRF bazlı testler, kontraktil aktomiyozin halkaları 37, mitotik iğler 26,38, aktin veya mikrotübül düzeneğinin bileşenleri39,40 ve hatta sentrozom ve kinetochores 36,41,42,43'teki dinamikleri yeniden yapılandırmıştır. . Dahası, bu tür sistemler, lipitlerin veya sinyal faktörlerinin mevcut olduğu yapay hücre sistemlerine giden yolu açabilir44,45,46.

Tarihsel olarak, aktin ve mikrotübüller, her biri kendi düzenleyici proteinleri, dinamik davranışları ve farklı hücresel konumları olan ayrı varlıklar olarak görülmüştür. Bol miktarda kanıt, aktin ve mikrotübül polimerlerinin, göç, mitotik iğ konumlandırma, hücre içi taşıma ve hücre morfolojisi 1,2,3,4 dahil olmak üzere çok sayıda hücre işlemini yürütmek için gerekli olan fonksiyonel çapraz konuşma mekanizmalarına girdiğini göstermektedir. Bu örneklerin altında yatan çeşitli koordineli davranışlar, bağlantı faktörlerinin, sinyallerin ve fiziksel özelliklerin karmaşık bir dengesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu mekanizmaları destekleyen moleküler detaylar hala büyük ölçüde bilinmemektedir, çünkü çoğu çalışma 1,2,5 seferde tek bir sitoiskelet polimerine odaklanmaktadır.
Aktin ve mikrotübüller 6,7,8 ile doğrudan etkileşime girmez. Hücrelerde görülen aktin ve mikrotübüllerin koordineli dinamiklerine ek faktörler aracılık eder. Aktin-mikrotübül çapraz hareketini düzenlediği düşünülen birçok protein tanımlanmıştır veaktiviteleri tek başına sitoiskelet polimeri 1,2 ile ilgili olarak iyi karakterize edilmiştir. Artan kanıtlar, bu tek polimer yaklaşımının, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını 7,8,9,10,11,12,13 sağlayan bazı proteinlerin / komplekslerin ikili işlevlerini gizlediğini göstermektedir. Her iki polimerin de mevcut olduğu deneyler nadirdir ve genellikle tek bir dinamik polimer ve diğer 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18'in statik stabilize edilmiş versiyonuna sahip mekanizmaları tanımlar. . Bu nedenle, aktin-mikrotübül koordine proteinlerinin ortaya çıkan özelliklerini araştırmak için yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da sadece her iki dinamik polimeri kullanan deneysel sistemlerde tam olarak anlaşılabilir.
Doğrudan protein etiketleme yaklaşımları, genetik olarak kodlanmış afinite etiketleri ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kombinasyonu, biyomimetik sulandırma sistemlerinde büyük bir başarı ile uygulanmıştır 19,20,21,22,23. Birçok aşağıdan yukarıya şema, hücrelerdeki proteinleri düzenleyen tüm faktörleri içermez. Bununla birlikte, "kapak camı üzerinde biyokimya" teknolojisi, polimer montajı veya sökülmesi için gerekli bileşenler ve motor protein hareketi 5,12,23,24,25,26,27 dahil olmak üzere yüksek mekansal ve zamansal ölçeklerde birçok aktin ve mikrotübül dinamiği mekanizmasını rafine etmiştir. . Burada in vitro aktin-mikrotübül kuplajını araştırmak için minimal bileşenli tek filament yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen veya yüksek oranda saf saflaştırılmış proteinler, floresan olarak etiketlenmiş proteinler, perfüzyon odaları ile kullanılabilir ve hücre ekstraktları veya sentetik sistemler içeren daha karmaşık şemalara genişletilebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, bir aktin-mikrotübül eşleşme proteininin varlığında sitoiskelet dinamiklerinin nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır, ancak diğer varsayılan aktin-mikrotübül koordinasyon faktörlerinin yerine geçebilir. Bu sistemin diğer yaklaşımlara göre en büyük avantajı, bir reaksiyonda çoklu sitoiskelet polimerlerinin dinamiklerini aynı anda izleme yeteneğidir. Bu protokol ayrıca kullanıcılara sitoiskelet polimerlerindeki değişiklikleri ölçmek için örnekler ve basit araçlar sunar. Böylece, protokol kullanıcıları, çeşitli düzenleyici proteinlerin aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğinin altında yatan mekanizmaları tanımlamak için güvenilir, kantitatif, tek filament çözünürlüklü veriler üretecektir.

<table><tbody><tr><td>%1 BSA (w/h)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Bu amaçla (TIRF odalarını bloke ederek), BSA ddH20'da yeniden askıya alınır ve 0.22 & mikro; m filtresi.</td></tr><tr><td>1&kez; BRB80</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>80 mM BORULAR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 KOH</td></tr><tr><td>ile 10 mg / mL (1000 U) glikoz oksidaz</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>G2133-50KU</td><td>Katalaz ile birlikte, alikot ve -80 oC'de</td></tr><tr><td>100 & mikro kullanıma kadar saklayın; M tubulin</td><td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td><td>T240</td><td>Ev yapımı tübülinler, polimerizasyona yetersiz tübülini çıkarmak için kullanılmadan önce geri dönüştürülmelidir (Hyman ve ark. (1992)29; Li ve Moore (2020)30). Ticari olarak temin edilebilen tübülinler genellikle geri dönüştürülemeyecek kadar seyreltiktir, ancak üreticiye göre yeniden askıya alındığında iyi işlev görür. talimatlar ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme (278.000 & kez; g) ile önceden temizlenmiştir.</td></tr><tr><td>100 mM ATP</td><td>Altın Biyoteknoloji A.Ş., Olivette, MO</td><td>A-081</td><td>ddH 20 (pH 7.5) içinde yeniden askıya alındı ve filtre sterilize edildi.</td></tr><tr><td>100 mM GTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC226250010</td><td>1 kez yeniden askıya alındı; BRB80 (pH 6.8) ve filtre sterilize edilmiştir.</td></tr><tr><td>120-150 mW katı hal lazerleri</td><td>Leica Microsystems</td><td>11889151; 11889148</td><td></td></tr><tr><td>2 mg / mL katalaz</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>C40-100</td><td>Glikoz oksidaz ile birlikte, alikot ve -80 oC'de 2 kez kullanıma kadar saklayın</td></tr><tr><td>; TIRF tamponu</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>2 kez; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glikoz, %0,5 (h/h) metilselüloz (4.000 cp); Not: 1 & 0.1M GTP ve 1 & mikro L; Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için TIRF reaksiyonlarına ayrı olarak eklenen L 0.1M ATP.</td></tr><tr><td>24 & kez; 60 mm, # 1.5 kapak camı</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>22-266882</td><td>Kapak camı kullanımdan önce iyice yıkanmalıdır (Smith ve ark. (2014)22)</td></tr><tr><td>37 oC ısı bloğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mg/mL Streptavidin (600x stok)</td><td>Avantor, Philadelphia, PA</td><td>RLS000-01</td><td>Tris-HCl'de (pH 8.8) yeniden askıya alındı; alikotu 1 kez seyreltin; kullanım gününde HEK tamponunda</td></tr><tr><td>5 dk Epoksi reçine ve sertleştirici</td><td>Loctite, Rocky Hill, CT</td><td>1365736</td><td>Kombine reçine ve sertleştiricinin kürlenmesi 30 dakika kadar sürebilir.</td></tr><tr><td>% 50 biyotinillenmiş-GpCpp mikrotübül tohumları</td><td>Cytoskeleton Inc; Ev yapımı</td><td>T333P</td> <td>(isteğe bağlı) GppCpp veya Taxol stabilize mikrotübül tohumları, mikrotübül polimerizasyonuna daha verimli bir şekilde aracılık edebilir. Taxol ve GppCpp, mikrotübül kafes yapısını ve belirli düzenleyici proteinlerin mikrotübülün stabilize edilmiş kısmına bağlanma yeteneğini etkileyebilecek farklı şekillerde mikrotübülleri stabilize eder. Çeşitli mikrotübül tohumları yapmak için bir yöntem Hyman ve ark. (1992).</td></tr><tr><td>70 oC inkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aktin karışımı stok</td><td>Ev yapımı; bu protokol</td><td></td><td>A 12.5 & mikro; Altı reaksiyona kadar etiketli (floresan ve biyotinillenmiş) ve etiketlenmemiş aktinden oluşan M aktin karışımı. 2 ve mikro; Son TIRF reaksiyonunda L stok kullanılır. Her reaksiyonda kullanılan son aktin konsantrasyonu 0.5 &'dir; M (%10 Alexa-647; %0,09 biyotin etiketli).</td></tr><tr><td>Uygun tampon kontrolleri</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Değerlendirilen tüm proteinlerden elde edilen tamponların kombinasyonu</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-silan (MW 3,400)</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>biotin-PEG-SIL-3400</td><td>2-5 mg alikotlara dağıtılır, nitrojenle doldurulur, parafilme alınır ve kullanıma kadar kurutucu ile -20 oC'de saklanır</td></tr><tr><td>Biyotinile aktin</td><td>Hücre İskeleti A.Ş; Ev yapımı</td><td>AB07</td><td>Biotin-actin, lizin kalıntıları üzerinde etiketleme ile yapılır ve bu nedenle en az% 100 etiketli olduğu varsayılır, ancak farklı lotlar / preparatlara göre değişir. Optimal biyotinile aktin konsantrasyonları, belirli kullanımlar/deneysel tasarımlar için ampirik olarak belirlenmelidir. Daha yüksek konsantrasyonlar daha verimli izlemeye izin verir, ancak polimerizasyonu veya düzenleyici proteinlerle etkileşimleri engelleyebilir. Burada, son TIRF reaksiyonunda küçük bir yüzde (% 0.09 veya 900 pM) biyotinile aktin bulunur.</td></tr><tr><td>Bulaşık Sabunu</td><td>Şafak, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td><td></td><td>Bilinmeyen nedenlerden dolayı, mavi versiyon lamelleri mevcut diğer renklerden daha verimli bir şekilde temizler.</td></tr><tr><td>Kuru buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI Yazılımı</td><td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>Schneider ve ark. (2012)31.</td></tr><tr><td>Floresan etiketli aktin</td><td>Hücre İskeleti, Inc; Ev yapımı</td><td>AR05</td><td>Ev yapımı floresan etiketli aktin, -20 oC'de %50 gliserol ile desteklenmiş G-tamponunda saklanır (Spudich ve ark. (1971)47; Liu ve ark. (2022)48). Floresan etiketli aktin, G-tamponuna karşı diyalize edilir ve 278.000 > kullanmadan önce g.</td></tr><tr><td>Floresan etiketli tübülin</td><td>Hücre İskeleti Inc</td><td>TL488M, TLA590M, TL670M</td><td>20 & mikroda yeniden askıya alındı; L 1 ve kez; BRB80 (10 ve mikro; M nihai konsantrasyonu) ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme (278.000 & kez; g) ile önceden temizlenir.</td></tr><tr><td>G-tampon</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl<alt>2</alt>, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP</td></tr><tr><td>HEK Tampon</td><td>Ev Yapımı</td><td></td><td>20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl</td></tr><tr><td>Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme odaları</td><td>IBIDI, Fitchburg, WI</td><td>80666</td><td>Farklı lamel kaplamaları kullanmak için tabanı olmayan hazneler sipariş</td></tr> edin <tr><td>iXon Life 897 EMCCD kamera</td><td>Andor, Belfast, Kuzey İrlanda</td><td>8114137</td><td></td></tr><tr><td>LASX Premium mikroskop yazılımı</td><td>Leica Microsystems</td><td>11640611</td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz (4.000 cp)</td><td>Sigma Aldrich Inc</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>TIRF modülü ile donatılmış mikroskop tabanı</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td></td><td></td>11889146</tr><tr><td>mPEG-silan (MW 2,000)</td><td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td><td>mPEG-SIL-2000</td><td>10-15 mg alikotlara dağıtılır, nitrojenle doldurulur, parafilme alınır, kapalı ve -20 oC'de kullanıma kadar kurutucu ile saklanır</td></tr><tr><td>Objektif ısıtıcı ve ısıtmalı kademe eki</td><td>OKO labs, Pozzioli, İtalya</td><td>8113569</td><td>Sıcaklık kontrollerini 35-37 oC'ye ayarlayın. Doğru kalibrasyon için üretici önerilerini kullanın.</td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası</td><td>Harvard Aparatı, Holliston, MA</td><td>704504</td><td>Bir şırınga ve hortum ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Petri Kabı, 100 x 15 mm</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>Plastik sürgülü posta kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>SA-S-1L-SecureSeal 0,12 mm kalınlık</td><td>Grace Biolabs, Bend, OR</td><td>620001</td><td>Hassas üretilmiş boyutlarda çift taraflı bant şiddetle tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>Küçük strafor konteyner</td><td>Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık</td><td></td><td>Nakliyeden yeniden kullanıldı</td></tr><tr><td>Küçük kantar Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tau</td><td>Hücre İskeleti Inc</td><td>TA01</td><td>Tau'nun ticari olarak temin edilebilen preparatında Tau'nun üç izoformu mevcuttur. Bu protokoldeki konsantrasyon, en yüksek moleküler ağırlık bandından (14.3 & M, üretici başına yeniden askıya alındığında' 50 & ile S önerileri; ddH20) L.</td></tr><tr><td>Sıcaklık 63 kez düzeltildi; Plan Apo 1.47 N.A. yağa daldırma TIRF hedefi</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506319</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin stoğu</td><td>Ev yapımı; Bu protokol</td><td></td><td>7.2 & mikrodan oluşan bir tübülin stoğu; L geri dönüştürülmüş 100 & M etiketsiz tübülin ve 3 &mikro; L / 10 & M, ticari olarak temin edilebilen floresan etiketli tübülini yeniden askıya aldı. Reaksiyon başına bir tübülin stoğu kullanılır ve buz üzerinde çözülür/saklanır. Her reaksiyondaki son serbest tübülin konsantrasyonu 15 &'dir; M (%4 etiketli). 15'ten fazla ve mikro; M tübülin, hiperstabilize (dinamik olmayan) mikrotübüllere neden olurken, 7.5 & altındaki konsantrasyonlar; M serbest tübülin iyi polimerize olmaz. Protein konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde belirlenmesi ve kullanılması gereklidir.</td></tr><tr><td>Etiketsiz aktin (koyu)</td> <td>Hücre İskeleti, Inc; Ev yapımı</td><td>AKL99</td><td>Aktin nükleatları hemen hemen her zaman ticari olarak temin edilebilen (liyofilize) veya donmuş aktinlerde bulunur ve kantitatif ölçümlerde değişkenliğe katkıda bulunur (Spudich ve diğerleri (1971)47; Liu ve ark. (2022)48). Tavşan kası aktini, -80 oC'de G-tamponunda saklanır ve 278.000 & kez 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme yoluyla önceden temizlenir; kullanmadan önce g.&nbsp; Gün boyunca birkaç aktin stok çözeltisi yapılır (bir seferde altı reaksiyon için fazlasıyla yeterli değildir) şiddetle tavsiye edilir).</td></tr></tbody></table>

aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiğinin in vitro total İç yansıma floresan (tirf) mikroskobu ile görselleştirilmesi

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Geleneksel olarak, aktin ve mikrotübül sitoiskeletleri, belirli hücresel bölgeler veya süreçlerle sınırlı ayrı varlıklar olarak incelenmiş ve her polimer için benzersiz olan farklı bağlayıcı protein paketleri tarafından düzenlenmiştir. Birçok çalışma, her iki sitoiskelet polimerinin dinamiklerinin iç içe geçtiğini ve bu çapraz konuşmanın çoğu hücresel davranış için gerekli olduğunu göstermektedir. Aktin-mikrotübül etkileşimlerinde yer alan bir dizi protein zaten tanımlanmıştır (yani, Tau, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası) ve yalnızca aktin veya mikrotübüller açısından iyi karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, nispeten az sayıda çalışma, her iki polimerin dinamik versiyonlarıyla aktin-mikrotübül koordinasyonunun tahlillerini göstermiştir. Bu, aktin ve mikrotübüller arasındaki acil bağlantı mekanizmalarını tıkayabilir. Burada, toplam bir iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma tekniği, hem aktin hem de mikrotübül dinamiklerinin tek bir biyokimyasal reaksiyondan görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, aktin filament veya mikrotübüllerin polimerizasyon dinamiklerini ayrı ayrı veya diğer polimerin varlığında korur. Ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, klasik bir sitoiskelet çapraz bağlama proteininin varlığında aktin-mikrotübül davranışlarının nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, bireysel düzenleyici proteinlerin tek filamentlerin veya daha yüksek dereceli komplekslerin çözünürlüğünde aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğine dair güvenilir fonksiyonel ve mekanik bilgiler sağlayabilir.

Yukarıda açıklanan koşullarla (Şekil 1), aktin ve mikrotübül polimerleri görüntü elde edildikten sonraki 2 dakika içinde görünür (ve dinamik) olmalıdır (Şekil 2). Herhangi bir biyokimya tabanlı protokolde olduğu gibi, farklı düzenleyici proteinler veya protein partileri için optimizasyon gerekebilir. Bu nedenlerden dolayı, TIRF açısı ve görüntü pozlamaları, her bir polimeri içeren reaksiyonlarla ilk önce ayarlanır. Bu, depolanan proteinlerin işlevsel olduğunu ve tespit için yeterli etiketli proteinin mevcut olduğunu doğrular. Her zaman gerekli olmasa da (ve burada gerçekleştirilmese de), filmlerin son işlenmesi (yani, arka plan çıkarma, ortalama veya Fourier dönüşümleri) görüntü kontrastını (özellikle mikrotübüllerin) artırmak için kullanılabilir5,25,33. Bu tahlil tarafından sağlanan tek aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi, polimerizasyon parametreleri (yani, çekirdeklenme veya uzama hızı), sökme parametreleri (yani, büzülme oranları veya felaket olayları) ve polimer birlikte hizalama / örtüşme (Şekil 3) dahil olmak üzere, tek başına veya birlikte sitoiskelet bileşeni için çeşitli dinamik önlemlerin nicel olarak belirlenmesini destekler (Şekil 3 ). Ayrıca, bu önlemler Tau gibi düzenleyici ligandların bağlayıcılığını veya etkisini deşifre etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir (Şekil 3). Tek aktin filamentlerin veya mikrotübüllerin birçok ölçümü bir TIRF filminden yapılabilir. Bununla birlikte, kapak kayması kaplaması, pipetleme ve diğer faktörlerdeki farklılıklar nedeniyle, güvenilir ölçümler birden fazla teknik çoğaltma reaksiyonu / filmi de içermelidir.
Mikrotübül dinamiğinin birçok yönü, mikrotübül uzama hızının yanı sıra felaket ve kurtarma olaylarının sıklığı da dahil olmak üzere örnek kimograflardan belirlenebilir (Şekil 3A). Bu sistemde aktin dinamiklerini ölçmek için kimografilerin kullanılması o kadar kolay değildir, çünkü aktin filamentleri mikrotübüllerden daha kıvrımlıdır. Sonuç olarak, aktin filament dinamiklerinin parametreleri, zaman alıcı ve emek yoğun olan elle ölçülür. Çekirdeklenme sayımları, tüm koşullar için tutarlı bir zaman noktasında bulunan aktin filamentlerinin sayısı olarak ölçülür. Bu sayımlar TIRF görüntüleme alanlarında büyük farklılıklar gösterir, ancak birçok replikasyonla veya diğer polimerizasyon testlerinden elde edilen gözlemleri desteklemek için kullanılabilir. Nükleasyon sayımları, deneme koşullarında stabilize edilmiş mikrotübül tohumları yoksa, mikrotübüller için de kullanılabilir. Aktin filament uzama hızları, filamentin zaman içindeki uzunluğu olarak en az dört film karesinden ölçülür. Oran değerleri, bir mikron filament içindeki aktin monomerlerinin sayısını hesaba katmak için mikromolar aktin başına 370 alt birimlik bir düzeltme faktörü ile aktarılır (Şekil 3B)32. Aktin ve mikrotübüller arasındaki koordineli davranışları tanımlamak için ölçümler daha az iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, çizgi taramaları (Şekil 3C) veya örtüşen yazılım 5,11,34 dahil olmak üzere her iki polimerin tesadüfünü ölçmek için korelasyon analizleri uygulanmıştır.
Veri Kullanılabilirliği: Bu çalışmayla ilişkili tüm veri kümeleri Zenodo'ya yatırılmıştır ve makul bir taleple şu adresten temin edilebilir: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg"> Şekil 1. Deneysel şemalar: görüntü elde etmek için akış odası montajı. (A) Görüntüleme odası tertibatı. Yukarıdan aşağıya: IBIDI görüntüleme odaları perfüzyon kuyucukları boyunca bantlanır (okla gösterilir); ikinci (beyaz) bant destek tabakası (kullanıcıları daha iyi yönlendirmek için gösterilen resimde solda) çıkarılır ve perfüzyon odasının (ok) kenarına Epoksi uygulanır. Not: Kullanıcıları epoksinin nereye yerleştirileceğini daha kolay yönlendirmek için, beyaz destek bu görüntüde açık bırakılmıştır. Temizlenmiş ve kaplanmış kapak kayması, kaplama tarafı perfüzyon kuyusunun içine bakacak şekilde görüntüleme odasına tutturulur. (B) Biyotin-streptavidin bağlantıları için görüntüleme odalarının koşullandırılmasına yönelik adımları gösteren akış şeması. (C) Dinamik mikrotübüllerin ve aktin filamentlerinin TIRF filmlerini elde etmek için kullanılan reaksiyon örnekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg"> Şekil 2. Tau'nun yokluğunda veya varlığında büyüyen aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin görüntü dizileri. 250 nM Tau'nun yokluğunda (A) veya varlığında (B) 0,5 μM aktin ( Alexa-647-aktin ve %0,09 biyotin-aktin etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 HiLyte-488 etiketli) içeren TIRF tahlillerinden hızlandırılmış görüntü montajı. Reaksiyon başlangıcından (Tüp A ve Tüp B'nin karıştırılması) geçen süre gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg"> Şekil 3. Mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri. (A) Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, kimograf grafikleri oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, sağda gösterilen dinamik mikrotübüllerin iki örnek kimografına karşılık gelir. Mikrotübüllerin büyümesi (düz siyah çizgiler) ve sökme fazları (noktalı pembe çizgiler; pembe oklarla gösterilen ikisi) her kimografta gösterilir. Zaman ölçeği çubuğu, 3 dk. Uzunluk ölçeği çubuğu, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece tübülin kanalı gösterilir. (B) Aktif olarak polimerize olan tek aktinli filamentleri gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır. Bu nedenle, tipik olarak 1 μM aktin konsantrasyonunda belirlenen oranlar için karşılaştırma için 0.5 μM aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler sağda gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece aktin kanalı gösterilir. (C) Dinamik mikrotübüllerin (MT) (yeşil) ve aktin filamentlerinin (mor) yokluğunda (solda) veya varlığında (ortada) polimerize olan TIRF görüntüleri. Mavi noktalı çizgiler ve oklar, her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizginin çizildiği yeri işaretler (her görüntünün altında). Mikrotübüller ve aktin bölgeleri arasındaki örtüşme (siyah olarak gösterilir), alan başına belirli bir zaman noktasında (sağda) puanlanabilir. Ölçek çubukları, 25 μm. Reaksiyonlar, 250 nM Tau ile veya 250 nM Tau olmadan 0.5 μM aktin (% 10 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (% 4 488-HiLyte etiketi) içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Birçok koordinasyon örneğine rağmen, çoğu çalışma aktin veya mikrotübül proteinlerini ayrı ayrı inceler. Bu yöntem, her iki dinamik polimerin tek bir reaksiyonda görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, kullanıcının sadece aktin ve mikrotübüllerin dinamik versiyonlarında görülebilen ortaya çıkan özellikler için çeşitli düzenleyici proteinleri değerlendirmesini sağlar.Bu teknik, sentetik bir hücre oluşturmaya yaklaşmak için lipitleri veya ekstraktları içerecek şekilde genişletilebilir. PEG-Silan ve Biotin-PEG-Silan tozlarının alikotlarını çözerek ve mililitre mPEG-Silan başına 10 miligram ve mililitre Biotin-PEG-Silane başına iki ila dört miligram kaplama stok çözeltileri üretmek için PEG tozlarını% 80 etanol içinde çözerek başlayın. Forseps kullanarak temiz kapak kaymasını etanol deposundan çıkarın.Azot gazı ile kurutun ve temiz bir Petri kabında saklayın. Kapak kaymalarını 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ile kaplayın ve en az 18 saat veya kullanıma kadar 70 santigrat derecede inkübe edin. 12 şerit çift sırtlı çift taraflı bandı 24 milimetre uzunluğa kadar kesin.Bant desteğinin bir tarafını çıkarın ve temiz bir görüntüleme odasında bulunan altı oluğa bitişik bant parçalarını sabitleyin. Bandın yapışkan tarafını her bir oda oluğu boyunca ortaya çıkarmak için ikinci bant desteğini çıkarın ve oda bandı tarafını temiz bir yüzeye yerleştirin. Epoksi reçine ve sertleştirici çözeltilerini küçük bir tartım teknesinde bire bir karıştırın ve her görüntüleme odası oluğunun sonundaki bant şeritleri arasına bir damla karışık epoksi yerleştirmek için bir P1000 ucu kullanın.Ardından, hazne, bant veya epoksi tarafı yukarıya, temiz bir yüzeye yerleştirin. Kaplamalı bir kapak kaymasını 70 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve kapak kaymalarının kaplanmış ve kaplanmamış yüzeylerini altı kez çift damıtılmış suyla durulayın. Filtrelenmiş azot gazı ile kurutun ve ardından kapak kayma kaplama tarafı banda doğru olacak şekilde görüntüleme odasına yapıştırın.Bant ile kapak kayması arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak amacıyla bantlı cam arabirime basınç uygulamak için bir P200 veya P1000 pipet ucu kullanın. Epoksinin kullanımdan önce oda kuyularını tamamen kapatmasına izin vermek için monte edilmiş odaları oda sıcaklığında en az beş ila 10 dakika boyunca inkübe edin. Perfüzyon odalarının süresi montajdan sonraki 12 ila 18 saat içinde dolar.Bir perfüzyon pompası kullanın ve görüntüleme odasını hazırlamak için 50 mikrolitre %1 BSA akıtılarak perfüzyon odasında koşullandırma çözeltilerini sırayla değiştirin. Fazla tamponu cazibe kilidi bağlantı haznesinden çıkarın. Daha sonra, mililitre streptavidin başına 50 mikrolitre 0.005 miligram akıtın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edin.Fazla tamponu rezervuardan çıkarın. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek ve 10 ila 30 saniye boyunca inkübe etmek için 50 mikrolitre% 1 BSA akışı sağlayın. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın.Daha sonra, 50 mikrolitre ılık 1x TIRF tamponu ve daha sonra 1x TIRF tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre stabilize ve% 50 biyotinile mikrotübül tohumu akıtın. İlk biyokimyasal reaksiyonu görüntülemeden önce 30 dakika boyunca 35 ila 37 santigrat derece sıcaklığı korumak için sahne veya objektif ısıtıcı cihazı ayarlayın. Ardından, edinme aralığını 15 ila 20 dakika boyunca her beş saniyede bir olacak şekilde ayarlayın.Daha sonra, 488 ve 647 lazer maruziyetini% 5 ila% 10 güçte 50 ila 100 milisaniyeye ayarlayın, önce polimerizasyon reaksiyonunu aktin filament tertibatını başlatacak şekilde ayarlayın. Görüntüleri 647 nanometrede elde edin ve uygun ayarlamaları yapın. Daha sonra, mikrotübül düzeneğini başlatmak için polimerizasyon reaksiyonunu ikinci bir şartlandırılmış perfüzyon kuyusunda ayarlayın.488 nanometrede görselleştirin ve uygun ayarlamaları yapın. Üç mikrolitre 10 mikromolar 488 tübülin, kullanımdan en fazla 15 dakika önce 100 mikromolar floresan olarak etiketlenmemiş tübülinin 7.2 mikrolitre alikotu ile birleştirin. Daha sonra, üç mikrolitre seyreltilmiş biyotin ile ilgili aktini, uygun hacimlerde floresan olarak etiketlenmemiş ve etiketlenmiş aktin içinde birleştirin, böylece nihai karışım% 10 ila% 30 floresan etiketli 12.5 mikromolar toplam aktin olacaktır.12.5 mikromolar aktin karışımı stoğunun iki mikrolitresini, görüntülemeden en fazla 15 dakika önce tübülin stok karışımıyla birleştirerek sitoiskelet karışımını hazırlayın. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın. 2x TIRF tamponu, anti ağartıcı, nükleotidler, tamponlar ve aksesuar proteinler dahil olmak üzere diğer tüm deneysel bileşenleri ve proteinleri birleştirerek protein reaksiyon karışımını hazırlayın.Hücre iskeleti karışımını ve protein reaksiyon karışımını 30 ila 60 saniye boyunca 37 santigrat derecede ayrı ayrı inkübe edin. Reaksiyonu başlatmak için, protein reaksiyon karışımının içeriğini sitoiskelet karışımına ekleyin ve karıştırın. 15 mikromolar serbest tübülin, bir milimolar GTP, 0.5 mikromolar aktin monomerleri ve uygun hacimlerde tampon kontrolleri ile desteklenmiş 1x TIRF tamponu içeren reaksiyon karışımının 50 mikrolitresini perfüzyon odasına aktarın.15 ila 20 dakika boyunca her beş saniyede bir elde etmek için mikroskop yazılımını kullanarak bir hızlandırılmış film kaydedin. Yeni bir perfüzyonu iyice koşullandırın ve tampon hacmini ilgilenilen düzenleyici protein ve tampon kontrolleri ile değiştirin. Acil aktin mikrotübül fonksiyonları için düzenleyici proteinleri değerlendirmek için edin.Bu görüntülerde mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri gösterilmiştir. Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, Kymograph grafiklerini oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, dinamik mikrotübüllerin iki örnek Kymograph'ına karşılık gelir.Mikrotübüllerin büyüme ve sökme aşamaları her Kymograph'ta gösterilmiştir. Burada aktif olarak polimerize olan tek aktin filamentlerini gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı gösterilmektedir. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır.Bu nedenle, tipik olarak bir mikromolar aktin konsantrasyonunda belirlenen oranları karşılaştırmak için 0.5 mikromolar aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler burada gösterilmiştir. 250 nanomolar Tau'nun yokluğunda veya varlığında polimerize olan aktin filamentlerindeki dinamik mikrotübüllerin toplam iç yansıma floresansı veya TIRF görüntüleri burada gösterilmiştir.Mavi noktalı çizgiler ve oklar işareti aşınır ve her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizgi çizilir. Aktin bölgelerindeki mikrotübüller arasındaki örtüşme, alan başına belirli bir zaman noktasında puanlanabilir. Sitoiskelet proteinleri, özellikle aktin, mikrotübüller ve düzenleyicileri donma / çözülme döngülerine karşı çok hassastır.Tutarlılık ve başarı için, son derece saf ve uygun şekilde depolanmış proteinler kullanın.

visualizing-actin-microtubule-coupling-dynamics-vitro-total-internal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu videoda, aktin-miyozin etkileşimlerini analiz etmek için bir in vitro motilite testi gerçekleştiriyoruz. Aktin filamentlerinin hareketsizleştirilmiş miyozin molekülleri üzerindeki kayma hareketi, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Ters Motilite Testi: İmmobilize Aktin Filamentleri Üzerinde Miyozin Hareketini Görselleştirmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Keşfedin: Aktin ve mikrotübül dinamiklerini aynı reaksiyonda görselleştirmek için TIRF mikroskobu kullanan bu yöntem, düzenleyici proteinlerin ortaya çıkan özelliklerini değerlendirmeyi sağlar.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet