Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Bu metodolojinin genel amacı, hücre dışı matriks sertliğinin yapışık hücrelerin bakteriyel enfeksiyonu üzerindeki etkisinin oldukça kantitatif bir şekilde karakterizasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, konakçı hücrelerin bakteriyel enfeksiyon duyarlılığını modüle etmede mekanik kuvvetlerin rolü gibi, gelişmekte olan konak-patojen biyomekaniği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, aynı anda birden fazla koşulu tararken ve belirli prosedürleri otomatikleştirirken yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış video dizileri oluşturmaya yardımcı olur.

24 oyuklu tabakların cam aktivasyonunu gerçekleştirmek için, 13 milimetre çapındaki kuyucuk başına 500 mikrolitre tumalo sodyum hidroksit ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Sodyum hidroksiti atın ve kuyuları bir kez durulamak için ultra saf su kullanın. Daha sonra her bir oyuğa% 95 etanol içinde 500 mikrolitre yüzde iki trietoksisilan ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Su ile kuyuları bir kez durulayın. Daha sonra her bir oyuğa 500 mikrolitre% 0.5 glutaraldehit ekleyin ve plakaları 30 dakika inkübe edin. Su ile bir kez duruladıktan sonra, plakaları kapağı kapalı olarak 60 santigrat derecede kurulayın.

Ayarlanabilir sertliğe sahip hidrojeller üretmek için, hidrojelin istenen sertliğine bağlı olarak, yüzde 40 stok akrilamid çözeltisinin yüzde üç ila 10'unu ve yüzde 06 ila 6'sını yüzde iki bis-akrilamid çözeltisi içeren sulu çözeltiler hazırlayın. Bundan sonra suyu ekleyin. Her sertlik için Birinci Çözelti boncuk içermezken, İkinci Çözelti %03 0.1 mikrometre floresan mikro boncuklar içerir.

Polimerizasyonu engelleyecek oksijeni ortadan kaldırmak için Birinci ve İkinci Çözeltileri 15 dakika vakumla degaz. Ardından, hızlı hareket ederken, Birinci Çözelti'ye %0,43 TEMED ve mililitre başına 10 gram stok APS çözeltisinin %0,6'sını ekleyin. 24 oyuklu çanağın her bir oyuğunun ortasına 3,6 mikrolitre çözelti ekleyin.

Kuyucukları kapatmak için hemen 12 milimetre dairesel kapak kızakları kullanın ve çözeltinin tamamen polimerize olması için 20 dakika bekletin. Kapak fişlerinin çıkarılmasını kolaylaştırmak için ucunda küçük bir kanca oluşturmak için bir şırınga iğnesini sert bir yüzeye hafifçe vurun, ardından kapak fişlerini kaldırmak için iğneyi kullanın. Ardından, İkinci Çözeltiye %0,43 TEMED ve mililitre başına 10 gram stok APS çözeltisinin %0,6'sını ekleyin.

Daha sonra 2.4 mikrolitre karışımı 12 milimetrelik dairesel kapak fişlerinin üzerine koyun. Dairesel kapak kızaklarını birinci poliakrilamid tabakasının üzerine bir damla Solüsyon İki ile yerleştirin ve ikinci tabakanın kalınlığının minimum olduğundan emin olmak için forseps kullanarak hafifçe aşağı doğru bastırın. Ardından İkinci Çözeltinin 20 dakika polimerize olmasına izin verin.

Kuyucukların her birine 500 mikrolitre 50 milimolar HEPES pH 7.5 ekleyin ve cam kapak kızaklarını çıkarmak için şırınga iğnesi ve forseps kullanın. Hidrojelleri sterilize etmek için bir doku kültürü başlığına koyun ve bir saat boyunca UV'ye maruz bırakın. Şimdi, hacim başına ağırlıkça %0,5 Sulfo-SANPAH ve yüzde bir DMSO ve 50 milimolar HEPES pH 7.5 karışımı hazırlayın.

Hidrojellerin üst yüzeyine 200 mikrolitre çözelti ekleyin. Daha sonra hızlı bir şekilde çalışarak, etkinleştirmek için 10 dakika boyunca 302 nanometre UV'ye maruz bırakın. Hidrojelleri iki kez yıkamak için bir mililitre 50 milimolar HEPES pH 7.5 kullanın, fazla çapraz bağlayıcıyı çıkarmak için gerekirse tekrarlayın.

Hidrojelleri 200 mikrolitre mililitre başına 0.25 miligram sıçan kuyruğu kollajen I ve 50 milimolar HEPES ile kaplayın. Hidrojelleri kollajen ile gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İlgilenilen hücreleri hidrojeller üzerine ekmeden önce, bir mililitre ortam ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede dengeleyin.

İnsan mikrovasküler endotel hücrelerini tohumlamak için, metin protokolüne göre bir hücre süspansiyonu kültürledikten ve hazırladıktan sonra, ortamı hidrojellerden çıkarın, ardından her oyuğa bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Metin protokolüne göre bir gece boyunca L. monocytogenes kültürü hazırladıktan sonra, kültürün bir mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dört dakika boyunca oda sıcaklığında 2.000 kez g'da döndürün. Peleti iki kez yıkamak için doku kültürü dereceli PBS kullandıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için bir mililitre PBS kullanın.

Enfeksiyon karışımını, konakçı hücre başına yaklaşık 50 bakteri veya konakçı hücre başına 10 bakteri içeren çok sayıda enfeksiyon veya MOI için 10 veya 50 mikrolitre bakteri süspansiyonunu bir mililitre MCDB 131 tam ortam ile birleştirerek hazırlayın. Hidrojelleri veya hücreleri bozmamaya dikkat ederek ortamı 24 oyuklu plakaların kuyularından çıkarın. Hücreleri bir kez yıkamak için bir mililitre MCDB 131 tam ortam kullanın, ardından her oyuğa bir mililitre bakteri ekleyin.

Kapağı plakaların üzerine yerleştirin ve sızıntıyı önlemek için polietilen gıda sargısı ile sarın. İstilayı senkronize etmek için plakaları 10 dakika boyunca 2.000 kez g'de santrifüjleyin, ardından kültürleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. MCDB 131 tam besiyeri ile numuneleri dört kez yıkayın ve doku kültürü inkübatörüne geri koyun.

Ek bir 30 dakika sonra, ortamı mililitre gentamisin başına 20 mikrogram ile desteklenmiş MCDB 131 tam ortamı ile değiştirin. Akış sitometrisini gerçekleştirmek için, enfeksiyondan sekiz saat sonra, ortamı 24 oyuklu plakanın kuyucuklarından çıkarın ve kuyucukları bir kez yıkamak için doku kültürü PBS'yi kullanın. PBS'nin çıkarılmasının ardından, her oyuğa 200 mikrolitre tripsin EDTA kollajenaz karışımı ekleyin.

Hücrelerin tamamen ayrılmasını sağlamak için çanağı doku kültürü inkübatörüne 10 dakika boyunca yerleştirin. Her bir kuyucuğu sekiz kez nazikçe pipetledikten sonra, tripsini nötralize etmek için 200 mikrolitre tam ortam ekleyin. Her bir kuyucuktan 400 mikrolitre hücre çözeltisini 35 mikrometre hücre süzgeci kapağına sahip beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın.

Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin. HMEC-1 hücrelerini Pa hidrojeller üzerine ektikten ve metin protokolüne göre gentamisin ile işlemden geçirdikten sonra, ActA promotörünün, mTagRFP açık okuma çerçevesinin ifadesini açmasına ve sürmesine izin vermek için plakayı beş saat inkübe edin. Enfeksiyondan dört saat sonra, mililitre başına bir miligram bir mikrolitre Hoechst boyasını bir mililitre L-15 tam ortam ile karıştırın ve çekirdekleri boyamak için her bir oyuğa ekleyin.

Hücreleri 10 dakika inkübe ettikten sonra, ortamı mililitre gentamisin başına 20 mikrogram ile takviye edilmiş bir mililitre L-15 tam ortam ile değiştirin. LM bakterilerinin değişen sertlikteki hidrojeller üzerine ekilen HMEC-1 tek katmanlarından nasıl yayıldığını izlemek için otomatik odaklama özelliğini kullanarak her beş dakikada bir birden fazla konumu görüntüleyin. Bu grafikte bildirildiği gibi, bu videodaki protokol kullanılarak hazırlanan Pa hidrojellerin tam sertliğini doğrulamak için AFM ölçümleri yapılmıştır.

Burada, farklı sertlikteki matrisler üzerindeki HMEC-1 hücreleri, içselleştirmeden sonra yalnızca hücre içi bakterilerin saptanmasına izin veren bir floresan markörü ifade eden bir LM suşu ile enfekte edildi. Hücreler, ileriye karşı yan saçılma grafiği kullanılarak kapılandı ve ikinci bir geçit adımı, otofloresan sergileyen hücreleri dışladı. Akış sitometrisi analizi, LM enfeksiyonunun sert 70 kilopaskal hidrojellere kıyasla 0.6 kilopaskal hidrojellerde yaklaşık iki kat daha fazla olduğunu ortaya koydu.

HMEC-1 üzerine artan LM yapışmasının HMEC-1'e artan LM invazyonunun veya her ikisinin de, yapısal olarak GFP'yi eksprese eden LM ile enfeksiyondan kısa bir süre sonra enfeksiyona karşı artan duyarlılıktan sorumlu olup olmadığını test etmek için, HMEC-1 hücreleri sabitlendi ve yapışan bakteriler antikorlarla boyandı. Burada gösterildiği gibi, konakçı hücreler yumuşak jellere kıyasla sert olduğunda HMEC-1'e yapışan önemli ölçüde daha fazla bakteri vardı. Akış sitometrisi verileriyle tutarlı olarak, konakçı hücreler yumuşak jellere kıyasla sert olduğunda HMEC-1 tarafından içselleştirilen önemli ölçüde daha fazla bakteri vardır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tahlil yaklaşık üç gün içinde yapılabilir, çünkü arada uzun inkübasyon adımları gereklidir. Bu prosedürü denerken, hidrojellerin ve konakçı hücrelerin kontaminasyonsuz olmasını sağlamak için mümkün olduğunca steril olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, konakçı hücrelerin sertliğinin enfeksiyon üzerine nasıl değiştiği ve bu etkinin matris sertliğine bağlı olup olmadığı gibi soruları yanıtlamak için atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemler de dahil edilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, mekanobiyoloji alanındaki araştırmacıların, epitel hücreleri gibi farklı konakçı hücreleri ve Rickettsia parkeri gibi farklı bakteriyel patojenleri kullanarak konak hücre patojen biyomekanik etkileşimlerinin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, çok kuyulu plakalar üzerinde ayarlanabilir sertlikte hidrojellerin nasıl üretileceği ve enfeksiyon testinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik bakterilerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedür gerçekleştirilirken giriş yeri ile patojen arasına bariyerler yerleştirmek ve aerosol oluşumunu önlemek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.