Name: Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin fare görsel korteksinde kronik in vivo görüntüleme için inceltilmiş kafatası hazırlama yöntemini. Bu teknik, dendritik diken dinamiklerini gözlemleyerek kortikal plastisite mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler (AKM) Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü tarafından desteklenen, Whitehall Vakfı Araştırma Bursu (AKM), Sloan Vakfı Bursu (AKM), NIH EY019277 (AKM) ve bir NEI tarafından finanse edilen, Vizyon Eğitim Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Iki foton mikroskopi, nöronlar floresan işaretleri ile etiketlenmiş bir hazırlık kullanarak sağlam beyin nöronları görselleştirmek için kullanılmaktadır. Deneylerde burada sunulan 5 piramidal hücrelerde 1 tabaka etiketler GFP-M transgenik fare hattı kullanıyoruz. Katman 5 piramidal hücreleri pia seviyesinin altında 300 mm derinliğe kadar, dendritler ve dendritik dikenler görselleştirme sağlayarak, yüzeysel katmanlarına dendritik süreçleri proje. Etiket hücrelere viral belirteçlerin (Lowery ve ark, vallahi teslim) kullanarak alternatif bir yaklaşım. </li><li> Aseptik cerrahi için% 70 etanol ve otoklav araçları kullanarak çalışma alanı sterilize edin. Temiz bir sargı ile yüzey işletim örtün. </li><li> Fareler IACUC onaylanmış prosedürlerini kullanarak Avertin çeyrek doz (0,0075 mg / ml) izledi. Fentanil kokteyl (; midazolam 5 mg / kg metatomadin 0.5 mg / kg fentanil 0.05 mg / kg) ile anestezi Analjezik fareler ön işlemden buprenorfin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ). Anestezi uçağın kuyruk / ayak tutam test reaksiyonu ile izleyin. </li><li> 37.5 az hayvan koruyun ° C'ye bağlı rektal termometre ile ısıtma battaniyesi. </li><li> Gözleri gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün. Hood, ameliyat sırasında ışık kaynağı gözleri korumak için küçük kağıt levha ile gözler. </li><li> Makaslar kullanılarak, gözler başın arkasına (kulak arkası) saç kaldırmak. </li><li> Ardışık uygulaması ile% 70 etanol, hayvan kafası üst Temiz, betadin fırçalayın ve betadin çözüm izledi. </li><li> Gözleri orta hat (hangi yarımkürede görüntülü olacak bağlı olarak) ya da sağ veya sol kenarı boyunca, kulakları ve arkasında bir L-kesme kesi olun. Cilt üzerine katlayın ve hemen ameliyat sitesinden. Cilt görüntüleme oturumunun ardından sütüre olacak gibi cilt çıkarmayın. </li><li> Ince forseps kullanımı cildi hafifçe ilgi alanından yukarı çekin ve uzak. </li><li> Yavaşça temiz forseps veya mikrocerrahi bıçak ile kafatası maruz kalan alan periost kazınması. Pamuklu bir bez kullanarak, periost zarı tamamen kuru ve tamamen silinmiş olduğundan emin olmak için% 10 Ferric Chloride kafatasına küçük bir miktar geçerlidir. Kafatası tutkal uygun kalarak (11) sağlamak için tamamen kuru olduğundan emin önemlidir. Forseps veya mikrocerrahi bıçak kullanarak, nazikçe uzak kurutulmuş periost membran kazıyın. </li><li> Siyanoakrilat yapıştırıcı paslanmaz çelik kafa plaka (bkz. Şekil 1) ve yapıştırmayın kafatası plaka görüntüleme penceresi etrafında ince bir tabaka uygulayın. </li><li> Ahşap sonunda bir pamuklu çubukla sopa kullanarak, görüntüleme penceresi içinde dikişler tutkal sürün; görüntüleme plaka ve kafatası eğrilik arasındaki tüm boşlukları doldurmak için emin olun. </li><li> Tutkal hızlandırıcı bir damla pencerenin içine yerleştirin. Çabucak fazla tutkal hızlandırıcı, pamuklu bir bez veya kim silin ile silin. Tutkal tamamen sondaj önce katılaşmış olmalıdır. </li><li> 0.7 mm paslanmaz çelik çapak ile yapıştırılmış bir diş matkap kullanarak görüntüleme penceresi kafatası inceltmek için başlayın. Kafatası üzerinde çok fazla ısı üreten önlemek için zaman zaman% 0.9 'luk steril serum fizyolojik uygulaması ile Alternatif delme. </li><li> Diş delme ile kafatası yüzeyi üzerinde küçük bir vuruş kullanarak kafatası üzerinde ince bir 4x4 mm penceresi. Künt son forseps ile kafatası inceliği sınayın. Kafatası yüzeyinde hafif hafif basınç ile girinti olacak. Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 mikron. </li><li> Kafatası ince ve pencere, tüm enkaz kafatası üzerinde tuzlu yer temizlenmelidir. Fotoğraf diseksiyon kapsamı monte edilmiş bir dijital kamera ile görüntüleme penceresi. Fotoğraf ve beynin damarsal kullanımı sonraki görüntüleme oturumları için görüntüleme plaka yerleştirmek için konumunuzu yardımcı olacaktır. </li><li> 2-foton teçhizat hayvan taşınması. Hayvan tüm görüntüleme oturumu sırasında ısıtıcı battaniye (rektal prob ile) kalmalıdır. Not: sedasyon altında iken, hayvanın temel vücut ısısı kortikal hasar veya ölümle sonuçlanan bir ısıtma ünitesi olmaması büyük dalgalanma olacak. </li><li> Mai Tai lazer, 10W maksimum güç ve modifiye Olympus Fluoview konfokal ünitesi için katı hal pompa ile iki foton mikroskop kullanılır. Sistemi, derin doku görüntüleme için optimize edilmiş ve dış dedektörleri beyin floresan maksimum algılama sağlamak için mümkün olduğunca objektif yakın olarak yüklenir. Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objektif lens kullanılır. % 0.9 serum fizyolojik amacı dalma için görüntüleme sırasında kullanılır. </li><li> Bu mikroskop kullanarak, ve düşük dijital zoom (x1), parlak etiketli nöron içeren bir alan tanımlar. </li><li> Mikroskop göz parçası yapıştırılmış bir dijital kamera kullanarak, görüntüleme alanında bir fotoğraf çekmek. Alternatif olarak, kan damarsal deseni eskiz. Bu yeniden gereklidaha sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konuma çevirin. </li><li> Tüm görünür ölçüde ölçüde dendritik dallanma gösteren beyin (genellikle ~ 200 mm kapsayan) sayesinde, düşük bir büyütme yığını (5 mikron adım x20 amacı, 512x512 piksel) edinin. Not: Bu düşük büyütme görüntü, hem kan damarları ve dendritler genç ve yetişkin hayvanların kendi yapısını korumak, daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme alanını bulmak için kullanılacaktır. </li><li> Görüntüleme yazılımı (Fluoview, v. 5.0, FV300) kullanarak, 8 kat dijital büyütme oranını artırın. X, Y koordinatları (tava koordinatları), gerekirse ayarlayın ve konumları ve dendritik dikenler yapısı da dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfoloji gösteren bir yüksek büyütme yığını toplamak. Her yığın toplanması, yani pan koordinatlar, toplanması, yığın içinde adım adım z boyutu ve sayısı aralığı ile ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar bir sonraki zaman noktasında bu dendrit ve akson dönerken kullanılacaktır. </li><li> Görüntüleme ardından, kafatası yüzeyinden yavaşça plaka ayırarak kafa plaka kaldırmak. Forseps kullanarak, kafatası üzerinde kalan herhangi bir kalıntı tutkal kaldırmak ve% 0.9 'luk steril serum fizyolojik ile kafatası yüzeyi silin. # 6 sütür iplik kullanarak birlikte kafatası üzerinde deri dikin. % 70 etanol ile alanı silin. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ağrı hafifletmek için, 0.1 mg / kg Buprenorfin analjezik, SQ yönetmek. </li><li> Bir ısı lambası altında temiz bir kafes yerleştirin hayvan uyanır ve mobil kadar. Orijinal kafes hayvan dönün. </li><li> Daha sonraki bir zaman noktasında (2 gün dışında birçok ay görüntüleme zaman noktalarında herhangi bir yerde olabilir) Reimage hayvan için, dikiş kaldırmak ya da yukarıdaki gibi aseptik yöntemler kullanarak kafasına cilt yeniden. Orijinal görüntüleme konumu için beynin damarsal (ilk cerrahi tarihinde alınan) dijital görüntü kullanın. Reaffix paslanmaz çelik headplate (adım 10-12). Yavaşça herhangi bir kemik görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilir uzakta ince bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Eğer gerekli diş matkap ile ince. Clear görüntüleme enkaz pencere ve% 0.9 'luk steril tuzlu bir damla uygulayın. </li><li> Iki foton mikroskop hayvan Carry ve orijinal görüntüleme alanını bulun. Yardım için ilk görüntüleme oturumu sırasında alınan dijital fotoğraf kullanın. </li><li> Fluoview programını açın ve orijinal düşük büyütme görüntüyü açmak. Yapıştırmayın bilgisayar ekranında ve kroki için bir saydamlık sayfalık bir saydamlık kalem kullanarak büyük bir kan damarı desen. </li><li> Canlı görüntü açın ve asetata çizilen desen kan damarsal realign. </li><li> Yapılarda yakınlaştırılmış 8x Reimage için, bir önceki görüntüleme oturumda istenilen toplanan yığın açın. Bilgisayar ekranına yapıştırılan yapısı (glial, dendritik, yani akson), asetat film üzerine çizin. </li><li> Canlı Görüntü 8x zoom ve pan ilk gününde görüntüleme parametrelerine koordine eder. Düşük büyütme yeri hizalayarak doğruluğunu bağlı olarak, o da biraz görüntü açısını ayarlamak için gerekli olabilir. Istenilen yapısı tespit edildikten sonra, kabataslak yüksek büyütme desen yapısı kadar maç. Z-yığın, sonraki analiz için z-yığın görüntüleri aynı bir adım boyutu ve sayısı ile toplayın. </li><li> Tüm yüksek büyütme görüntüleri yeniden toplanana kadar 29 ve 30 adımları tekrarlayın. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandığında, tekrar adımları 22-24. Re-görüntüleme, 2 ayrı zaman noktalarında tekrar edilebilir. </li><li> Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından tam akreditasyon Vivarium ve University of Rochester Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi Laboratuar Hayvanları Tıp Bölümü tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak yapıldı International (AAALAC) ve eyalet yasası, federal tüzüğü ve NIH politikası ile uyum içinde. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar GFP-M ifade farelerde, bir alt katman 5 piramidal hücreleri ve buna karşılık gelen dendritik süreçleri 2-foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM 1) kullanarak kolayca görüntülenebilmekte olabilir. Burada istenen görüntüleme konumu üzerinde kafatası ~ 10-30 mikron inceltilmiş olduğu seyrelmiş bir kafatası hazırlık gösterdi. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize açıkça, akut ya da kronik analizi (Şekil 2) için sağlam görsel korteksteki kortikal dendritler ve dikenler görselleştirmek için izin verdi. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Özel baş ve taban plakası inceltilmiş-kafatası cerrahisi hazırlanması için kullanılan özel yapılmış baş ve taban plakası (A) Üstten görünüm. Ölçüye baş ve taban plakası (B) Yan görünüm. (C, D), kafa plaka detaylı şematik ve görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> korteks in vivo imaged . Görüntü, son bir derinliği 175 mm pia her 5 mikron elde tek görüntü, bir projeksiyon. A kutulu alanda büyütülmüş bir bölgeyi temsil eder (B) ve (C) 0 (D0) ve dört gün sonra (D4) günü imaged. B ve C kutulu dendritik şube istikrarlı dikenler (beyaz ok uçları) gösteren (D, E) Yüksek büyütme / geri çekilmeden dikenler (kırmızı ok uçları) ve yeni dikenler (yeşil ok uçları) kaybetti. Ölçek bar = A. 200 mikron, B, C. 20 mikron, D, E. 5 mm.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Iki foton mikroskopi kullanılarak Kronik görüntüleme plastisite 2-5 sırasında tetiklenen morfolojik değişiklikleri incelemek için giderek daha popüler bir teknik haline gelmektedir . Burada farklı görüntüleme gün bozulmadan fare beyin tespit dendritik dikenler takip seyrelmiş bir kafatası hazırlık göstermektedir. Bu protokolde, korteks minimal hasara neden kafatası ve beyin fonksiyonu 6 değiştirebilir nöro çok düşük seviyelerde ile sonuçlanan, değişmeden kalır. Bu hayvan, ilk cerrahiden hemen sonra...

<table><tbody><tr><td>Fentanil Sitrat</td><td></td><td>Kurum İçi</td><td></td><td>Fentanil Kokteyli: Anestezik Kokteyl;&lt;br/&gt;IP Dozu: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final kokteyl kons.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Medetomidin Hidroklorür</td><td></td><td>Kurum İçi</td><td></td><td>Fentanil Kokteyli: Anestezik Kokteyl;&lt;br/&gt;IP Dozu: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final kokteyl kons.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>Kurum İçi</td><td></td><td>Fentanil Kokteyli: Anestezik Kokteyl;&lt;br/&gt;IP Dozu: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final kokteyl kons.: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin Kokteyli: Anestezik;&lt;br/&gt;IP Dozu: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final kokteyl kons.: %1</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol (Final konsantrasyon: %0,775)</td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin Kokteyli: Anestezik;&lt;br/&gt;IP Dozu: 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Final kokteyl kons.: %0,775</td></tr><tr><td>Fareler için TC-1000 Sıcaklık Kontrol Sistemi</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Fare</td><td>Vücut Isısı Regülasyonu</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>Kurum İçi</td><td></td><td>Göz Pomadı</td></tr><tr><td>%10'luk Ferrik Klorür</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi Bıçağı</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Zip Kicker Yapıştırıcı Hızlandırıcı</td><td></td><td>Pacer Teknolojisi</td><td>PT-29</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Mikro Matkap Çelik Frezeler 0,7 mm uç çapı</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>Mikrotork Kontrol Kutusu ve Tech2000 El Parçası</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000AÇIK/KAPALI</td><td>İnceltilmiş kafatası preparasyonu</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 metrik) ipek sütür</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Konik Uç C-1</td></tr><tr><td>Göz Pansuman Penseti, 10 cm, uç genişliği 0,5 mm, eğri</td><td>Cerrahi Aletler</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Bonn Makası, 8,5 cm, düz uçlu, kesme ağzı 13 mm</td><td>Cerrahi Aletler</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Standart Desenli Pens, düz, 2,5mm x 1,35mm uç, 12cm</td><td>Cerrahi Aletler</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

fare visual cortex İnceltilen kafatası hazırlık kronik görüntüleme

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Bozulmamış beyin hücreleri ve nöronal süreçleri yaşayan iki foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM) kullanarak in vivo görüntüleme çalışma sağlar. Burada sunulan teknik MSS eksitatör postsinaptik sitelerin büyük çoğunluğu temsil eden küçük yapılar dendritik dikenler izleme izin mikroskobik çözünürlüğü ile çeşitli zaman noktalarında (kronik görüntüleme) aynı bölgede beyin görüntüleme sağlar. Ince kortikal yapıların, birkaç kez puan üzerinden açıkça çözmek için yeteneği, sinapsların morfolojik değişiklikler ve devre remodelling altta yatan mekanizmaların açıklanmasına yardımcı olan beyin plastisite çalışma, özellikle pek çok avantajı vardır. Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak bozulmamış beyin in vivo görüntüleme için bir protokol göstermektedir. Inceltilmiş kafatası hazırlama, minimal invaziv bir yaklaşım, böylece bir inflamatuar yanıt başlangıcı azaltarak, dura ve / veya korteks potansiyel zarar görmesini engeller. Bu protokol doğru yapıldığında, açıkça zaman uzun bir süre içinde bozulmamış beyin dendritik omurga özellikleri değişiklikleri izlemek için mümkündür.

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir protokol<em&gt; In vivo</em&gt; Seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak sağlam beyin görüntüleme.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

İki foton lazer taramalı mikroskopi (2PLSM) kullanılarak yapılan in vivo görüntüleme, sağlam beyindeki canlı hücrelerin ve nöronal süreçlerin incelenmesine olanak tanır. ...

Dendritik dikenler, bir nöronun dendritinden çıkan ve sinaptik girdileri alan membran çıkıntılarıdır. Dikenlerin uzaması, kısalması, ortaya çıkması veya kaybolması, spesifik nöral aktivite paternlerinden kaynaklanan nöral ağ fonksiyonundaki değişikliklere yanıt olarak gerçekleşir. Dendritik dikenlerdeki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için kullanılan bu fenomen, kortikal plastisite olarak bilinir.Canlı hayvanlarda, bir görüntüleme plakası farenin kafatasına sabitlenir. Kafatasının bir bölgesi cerrahi olarak inceltilir ve düşük ve yüksek büyütmede görüntüler alınır. Ardından, bu bölgeler daha sonraki zaman noktalarında yeniden görüntülenir.Elde edilen sonuçlar, dendritik diken morfolojisinin ince kafatası preparasyonu kullanılarak birden fazla zaman noktasında net bir şekilde görselleştirilebildiğini göstermektedir. Ayrıca diken morfolojisinin oldukça plastik olduğu, yapıda değişiklikler ile dendritik dikenlerin ortaya çıkışı ve kayboluşu şeklinde kendini gösterdiği görülmüştür. Merhaba, ben Emily Kelly; Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'nde Anaya Maka'nın laboratuvarındayım.Bugün sizlere, "fins called" preparasyonunun ardından fare görsel korteksinin kronik görüntülemesine yönelik prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü dendritik diken döngüsünü incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Prosedüre, aseptik cerrahi için aletleri sterilize ederek başlayın. Ardından çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin ve operasyon yüzeyini temiz örtüyle kaplayın. Fentanyl kokteyli ile anestezi uygulanmış bir farenin anestezi derinliğini, ayak parmağı sıkıştırma yöntemine verdiği yanıtı test ederek izleyin; burada gösterilen fare, GFP eksprese eden A-G-F-P-M transgenik faredir.Beşinci tabakada, dendritik uzantıları yüzeysel tabakalara gönderen parametal hücreler bulunur. 37,5 °C vücut sıcaklığını korumak için hayvanı bir ısıtma battaniyesine yerleştirin ve iliştirilmiş bir rektal termometre ile izleyin. Ardından, gözlerin kurumasını önlemek için gözlere oftalmik pomad uygulayın ve makas kullanın.Fareyle kafasının arkasındaki tüyleri kulak arkasından gözlere kadar temizleyin. Ardından, hayvanın kafasının üst kısmını %70 etanol uygulayıp, ardından Betadine scrub ve Betadine solüsyonu ile temizleyin. Kulakların arkasından, hangi hemisfer görüntülenecekse orta hattın sağ veya sol tarafı boyunca gözlere doğru L şeklinde bir insizyon yapın, deriyi katlayarak cerrahi bölgeden uzaklaştırın.Deri, daha sonra ince pensetler kullanılarak sütüre edileceği için çıkarmayın. Deriyi nazikçe yukarı ve ilgili bölgeden uzağa doğru çekin. Temiz bir penset kullanarak, kafatasının açığa çıkan bölgesindeki periostumu nazikçe kazıyarak temizleyin.%10 fair klorürden küçük bir miktar uygulayarak periosteum membranını tamamen kurutun ve membranın tamamen uzaklaştırıldığından emin olun. Kafatasının tamamen kuru olması önemlidir. Yapıştırıcının düzgünce yapışmasını sağlamak için, kurumuş periosteum membranını mikrocerrahi bıçağı ile nazikçe kazıyın.Ardından, paslanmaz çelik baş plağının görüntüleme penceresinin etrafına ince bir tabaka Sano akrilik yapıştırıcı uygulayın ve plağı kafatasına sabitleyin. Bir pamuklu çubuk çubuğunun ahşap ucuyla, görüntüleme penceresinin iç dikişlerine yapıştırıcı sürerek görüntüleme plağı ile kafatasının kavisli yapısı arasındaki tüm boşlukların dolduğundan emin olun. Pencerenin içine bir damla yapıştırıcı hızlandırıcı damlatın.Ardından fazlalığı hızlıca silin. Yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin. 0,7 milimetrelik paslanmaz çelik frez takılmış bir dişçi matkabı kullanarak, görüntüleme penceresindeki kafatasını inceltmeye başlayın.Kafatası üzerinde aşırı ısı oluşumunu önlemek için, ara ara %0,9 steril salin uygulayarak alternatif delme işlemi gerçekleştirin. Kafatası yüzeyinde küçük darbeler kullanarak dört çarpı dört milimetrelik bir pencereyi inceltin.Dental frezle işlem yapınız. Kafatasının inceliğini küt uçlu pensle test ediniz. Hafif baskı uygulandığında kafatası yüzeyinde hafif bir çökme oluşacaktır.Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 mikron arasındadır. Kafatası inceltildikten sonra, pencereyi tüm kalıntılardan temizleyin ve kafatasının üzerine salin yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobuna monte edilmiş dijital kamera ile görüntüleme penceresinin fotoğrafını çekin.Bu fotoğraftaki beyin damarları, sonraki görüntüleme oturumları için görüntüleme plakasının yerleştirileceği konumun belirlenmesine yardımcı olacaktır. Hayvanı iki foton düzeneğine taşıyın. Hayvan ısıtma battaniyesi üzerinde kalmalı ve vücut sıcaklığı görüntüleme oturumu boyunca sürekli olarak izlenmelidir.Mi Tai lazerli bir iki foton mikroskobu. Maksimum güç için 10 watt'lık bir katı hal pompa lazeri ve modifiye edilmiş bir Olympus flow view konfokal ünitesi kullanılmıştır. Sistem, derin doku görüntüleme için optimize edilmiştir ve beyinden gelen floresansın maksimum düzeyde saptanmasını sağlamak amacıyla harici dedektörler objektife mümkün olduğunca yakın kurulmuştur; düşük dijital yakınlaştırma kullanarak görüntüleme penceresine bir damla salin ekleyin.Mikroskoba sabitlenmiş bir dijital kamera kullanarak parlak şekilde işaretlenmiş nöronlar içeren bir alan belirleyin. Ardından, görüntüleme alanının bir fotoğrafını çekin. Bu işlem, sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konumuna geri dönmek için gereklidir.Dendritik dallanmanın kapsamını gösteren, beynin tüm görünür alanı boyunca düşük büyütmeli bir yığın elde edin. Kan damarları ve dendritler genç ve yetişkin hayvanlarda yapılarını koruduğu için, bu yığın sonraki zaman noktalarında görüntüleme alanını belirlemek için kullanılacaktır.Dijital büyütmeyi sekiz kat artırın, gerekirse XY koordinatlarını ayarlayın ve dendritik dikenlerin konumları ile yapıları dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfolojiyi gösterecek yüksek büyütmeli bir istif (stack) toplayın. Pan koordinatları, toplama aralığı, Z adım boyutu ve istifteki adım sayısı dahil olmak üzere her bir istif toplama işlemiyle ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar, daha sonraki bir zaman noktasında bu dendrit veya aksona geri dönerken kullanılacaktır.Görüntülemenin ardından, baş plağını kafatası yüzeyinden nazikçe ayırarak çıkarın. Pens kullanarak kalan yapıştırıcı kalıntılarını temizleyin ve kafatasını %0,9 steril salin ile silin.Kafatası üzerindeki deriyi 6 numara sütur ipi kullanarak dikin. Görüntüleme prosedürünün ardından bölgeyi %70 etanol ile silin. Hayvanı, uyanana ve hareketlenene kadar ısıtıcı bir lambanın altında temiz bir kafese yerleştirin.Ardından, hayvanı iki gün ile birkaç ay arasındaki herhangi bir süre sonra tekrar görüntülemek üzere orijinal kafesine geri yerleştirin, dikişleri alın ve kafadaki deri kesisini tekrar açın. Aseptik yöntemler kullanarak, ilk ameliyat sırasında alınan beyin damarlanmasının dijital görüntüsünü, orijinal görüntüleme konumunu belirlemek için kullanın. Ardından, kafa plağını daha önce olduğu gibi yeniden sabitleyin.Gerekirse, görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilecek kemik dokusunu nazikçe inceltmek için mikrocerrahi bıçağı kullanın. Dişle matkabı ile inceltme işlemini yapın, görüntüleme penceresini kalıntılardan temizleyin ve bir damla %0,9 steril salin uygulayın. Hayvanı iki fotonlu mikroskoba taşıyın ve önceki oturum sırasında alınan dijital floresan görüntüyü kullanarak orijinal görüntüleme alanını bulun.Akış görüntüleme programını başlatın. Orijinal düşük büyütmeli görüntüyü açın, bilgisayar ekranına şeffaf bir asetat kağıdı yerleştirin ve asetat kalemi kullanarak ana kan damarı paternini çizin. Ardından, canlı görüntüyü açın ve kan damar yapısını asetat filmi üzerine çizilen paternle yeniden hizalayın.Sekiz kat yakınlaştırılmış yapıları yeniden görüntülemek için şeffaf filmi kaldırın. Önceki görüntüleme oturumundan toplanan istenen yığını açın. Yapıyı, bilgisayar ekranına sabitlenmiş bir şeffaf filme çizin.Canlı görüntüden sekiz kat yakınlaştırın ve görüntüyü şeffaf tabaka ile hizalayın. Düşük büyütmeli konumun hizalama hassasiyetine bağlı olarak, görüntü açısını da hafifçe ayarlamak gerekebilir; pan koordinatlarını, adım boyutu ve görüntü sayısı dahil olmak üzere ilk günün görüntüleme parametrelerine göre ayarlayın ve z-stack görüntüleme işlemini gerçekleştirin; yeniden görüntüleme iki kez yapılabilir. Kafatası bütünlüğünün bozulmasını önlemek için skalpın açılma sayısı sınırlandırılmalıdır, aksi takdirde GFPM eksprese eden farelerde görüntüleme çözünürlüğü düşük olacaktır.Beşinci katman parametal hücrelerinin bir alt kümesi ve bunlara karşılık gelen dendritik süreçler, in vivo iki foton lazer tarama mikroskobisi kullanılarak görselleştirilmiştir; burada GFP ile işaretlenmiş görsel korteks dendritleri gösterilmektedir. Bu görüntü, PIA'dan 175 mikronluk nihai bir derinliğe kadar her beş mikronda bir elde edilen tek bir görüntünün projeksiyonudur. Kutucuk içindeki bölge burada sıfırıncı günde ve ardından dördüncü günde daha yüksek büyütmeyle gösterilmiştir; sıfırıncı ve dördüncü güne ait dendritik dal görüntülerinin yüksek büyütmeli karşılaştırması sunulmuştur.Bu görüntüler, beyaz ok uçlarıyla gösterilen stabil dikenciği, kırmızı ok ucuyla işaretlenen geri çekilen ve kaybolan dikenciği ve yeşil ok ucuyla gösterilen yeni dikenciği göstermektedir. Size, ince kafatası preparasyonu kullanarak fare görsel korteksinde kronik iki foton görüntülemenin nasıl yapılacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, kafatasına ve altındaki duraya zarar vermemek için inceltme işlemi sırasında özel bir dikkat göstermek gerektiğini unutmamak önemlidir; çünkü bu durum görüntüleme çözünürlüğünün düşük olmasına neden olacaktır. Ayrıca ayrıntılı notlar alınız.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video ve protokol kemirgenlerde bir cam kaplı kafatası pencere nasıl implant göstermektedir. Bu hazırlıklar, kronik in vivo iki ay zaman ölçekleri üzerinde neokorteks foton görüntüleme için kullanılabilir. Optik içsel sinyal görüntüleme gibi diğer görüntüleme türleri için de kullanılıyor olabilir.

Kronik Beyin Görüntüleme Kraniyotomi Cerrahi Prosedür

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem...

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Cilalı ve takviyeli ince kafatası (portlar) kraniyal pencere ve glioblastoma (GBM) hücre enjeksiyonu birleştirerek, glioma inisiyasyon ve uzunlamasına bir canlı fare beynindeki enjekte GBM hücreleri büyüme gözlemleyebilirsiniz.

Görüntüleme Glioma Başlatma<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Parlak ve Takviyeli İnce kafatası Kranial Pencere arkası

Biz bir fare modelinde bir inceltilmiş-kafatası kortikal pencere (TSCW) oluşturma bir yöntem...

Için inceltilmiş-kafatası Kortikal Pencere Tekniği<em&gt; In Vivo</em&gt; Optik Koherens Tomografi Görüntüleme

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

Öğrenin fare görsel korteksinde kronik in vivo görüntüleme için inceltilmiş kafatası hazırlama yöntemini. Bu teknik, dendritik diken dinamiklerini gözlemleyerek kortikal plastisite mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Daha fazla video keşfet