Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Dendritik dikenler, bir nöronun dendritinden sinaptik girdi alan zar çıkıntılarıdır. Omurgaların uzaması, küçülmesi, görünümü veya kaybolması, belirli sinirsel aktivite modellerinden kaynaklanan sinir ağı işlevindeki değişikliklere yanıt olarak ortaya çıkar. Bu fenomen, dendritik dikenlerdeki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için kortikal plastisite olarak bilinir.

Canlı hayvanlarda, bir farenin kafatasına bir görüntüleme plakası yapıştırılır. Kafatasının bir bölgesi cerrahi olarak inceltilir ve düşük ve yüksek büyütmelerde görüntülere ihtiyaç duyulur. Alanlar daha sonra daha sonraki zaman noktalarında yeniden görüntülenir.

Elde edilen sonuçlar, dendritik omurga morfolojisinin, birden fazla zaman noktasında ince bir kafatası hazırlığı kullanılarak net bir şekilde görselleştirilebileceğini göstermektedir. Ve bu omurga morfolojisi oldukça plastiktir, yapıdaki değişiklikleri ve ayrıca dendritik dikenlerin görünümünü ve kaybolmasını gösterir. Merhaba, ben Emily Kelly, Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'nde Anaya Maka'nın laboratuvarındayım.

Bugün size, hazırlık adı verilen bir yüzgecin ardından fare flakon korteksinin kronik görüntülenmesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda dendritik omurga döngüsünü incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Aseptik cerrahi için aletleri sterilize ederek işleme başlayın. Ardından çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin ve çalışma yüzeyini temiz pansumanla örtün. Fentanil kokteyli anestezi uygulanmış bir farede, bir ayak parmağı çimdiklenmesine verdiği yanıtı test ederek anestezi derinliğini izleyin, burada gösterilen fare, GFP'nin eksprese edildiği A-G-F-P-M transgenik faredir.

Beşinci katmanda, dendritik süreçleri yüzeysel katmanlara yansıtan parametal hücreler. Vücut ısısını 37,5 santigrat derece arasında tutmak için, hayvanı bir ısıtma battaniyesine yerleştirin ve bağlı bir rektal termometre ile izleyin. Daha sonra makas kullanarak kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.

Farenin kafasının arkasından, kulakların arkasından gözlere kadar olan tüyleri çıkarın. Daha sonra hayvanın başının üst kısmını% 70 etanol uygulamasıyla temizleyin, ardından Betadine ovma ve Betadine solüsyonu uygulayın. Kulakların arkasında ve orta hattın sağ veya sol tarafı boyunca yukarı doğru bir LCU kesisi yapın, hangi yarım kürenin gözlere görüntüleneceğine bağlı olarak, cildi ameliyat bölgesinden uzağa ve uzağa katlayın.

Daha sonra ince forseps kullanılarak dikileceği için cildi çıkarmayın. Cildi nazikçe yukarı ve ilgilenilen alandan uzaklaştırın. Temiz forseps kullanarak, periosteuumu kafatasının açıkta kalan bölgesinden nazikçe kazıyın.

Periosteum zarını tamamen kurutmak için kafatasına az miktarda %10 adil klorür uygulayın ve tamamen çıkarıldığından emin olun. Kafatasının tamamen kuru olması önemlidir. Tutkalın düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için, kurumuş periost zarını bir mikrocerrahi bıçakla nazikçe kazıyın.

Ardından, paslanmaz çelik kafa plakasının görüntüleme penceresinin etrafına ince bir tabaka Sano akrilik yapıştırıcı sürün ve plakayı kafatasına yapıştırın. Bir pamuklu çubuk çubuğunun ahşap ucuyla, görüntüleme penceresinin iç dikişlerine yapıştırıcı sürün ve görüntüleme plakası ile kafatasının eğriliği arasındaki tüm boşlukları doldurduğunuzdan emin olun. Pencereye bir damla tutkal hızlandırıcı yerleştirin.

Ardından fazlalığı hızlıca silin. Yapıştırıcı tamamen kuruduktan sonra yapıştırıcının kurumasını bekleyin. 0,7 milimetre paslanmaz çelik çapak ile yapıştırılmış bir diş matkabı kullanarak, görüntüleme penceresindeki kafatasını inceltmeye başlayın.

Ara sıra% 0,9 steril tuzlu su uygulamasıyla alternatif sondaj. Kafatasında çok fazla ısı oluşmasını önlemek için. Kafatası yüzeyi boyunca küçük vuruşlar kullanarak kafatası üzerinde dört ila dört milimetrelik bir pencereyi inceltin.

Diş matkabı ile. Kafatasının inceliğini künt uçlu forseps ile test edin. Kafatası yüzeyi hafif bir basınçla hafifçe girinti yapacaktır.

Görüntüleme için en uygun kafatası kalınlığı 10 ila 30 mikron arasındadır. Kafatası inceltildikten sonra, tüm kalıntıların penceresini temizleyin ve kafatasının üzerine tuzlu su koyun. Görüntüleme penceresini, bir diseksiyon dürbününe monte edilmiş bir dijital kamera ile fotoğraflayın.

Bu fotoğraftaki beyin damar sistemi, sonraki görüntüleme seansları için görüntüleme plakasını yerleştirme pozisyonunun bulunmasına yardımcı olacaktır. Hayvanı iki foton teçhizatına taşıyın. Hayvan, ısıtma battaniyesi üzerinde kalmalı ve görüntüleme seansı boyunca vücut ısısı sürekli olarak izlenmelidir.

Mi tai lazerli iki foton mikroskobu. Maksimum güç için 10 watt'lık bir katı hal pompası ve modifiye edilmiş bir Olympus akış görünümü konfokal ünitesi kullanılır. Sistem, derin doku görüntüleme için optimize edilmiştir ve beyinden maksimum floresan algılanmasını sağlamak için harici dedektörler hedefe mümkün olduğunca yakın kurulur, düşük dijital yakınlaştırma kullanarak görüntüleme penceresine bir damla salin eklenir.

Mikroskoba sabitlenmiş bir dijital kamera kullanarak parlak etiketli nöronlar içeren bir alanı tanımlayın. Ips, görüntüleme alanının fotoğrafını çekin. Bu, daha sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konumuna geri dönmek için gereklidir.

Beynin tüm görünür kapsamı boyunca, dendritik dallanmanın derecesini gösteren düşük bir büyütme yığını elde edin. Bu, görüntüleme alanını sonraki zaman noktalarında hem kan damarları hem de dendritler olarak bulmak için kullanılacaktır. Görüntüleme yazılımı kullanarak genç ve yetişkin hayvanlarda yapılarını koruyun.

Dijital büyütmeyi sekiz kat artırın, gerekirse XY koordinatlarını ayarlayın ve dendritik dikenlerin konumları ve yapısı dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfolojiyi gösterecek yüksek bir büyütme yığını toplayın. Kaydırma koordinatları, toplama aralığı, Z adım boyutu ve yığındaki adım sayısı dahil olmak üzere her yığın koleksiyonuyla ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar, daha sonraki bir zaman noktasında bu dendri veya aksona geri dönülürken kullanılacaktır.

Görüntülemeyi takiben, kafa plakasını kafatası yüzeyinden nazikçe ayırarak çıkarın. Forseps kullanarak. Kalan yapıştırıcıyı çıkarın ve kafatasını %0,9 steril tuzlu su ile silin.

Altı numaralı dikiş ipliği kullanarak cildi kafatasının üzerine dikin. Görüntüleme işleminden sonra alanı %70 etanol ile silin. Hayvanı, uyanana ve hareket edene kadar bir ısı lambasının altında temiz bir kafese koyun.

Daha sonra, hayvanı daha sonraki bir zaman noktasında iki günden aylar sonrasına kadar herhangi bir yerde tekrar görüntülemek için hayvanı orijinal kafesine geri koyun, dikişleri çıkarın ve kafadaki cildi yeniden açın. Aseptik yöntemler kullanarak, orijinal görüntüleme konumunu bulmak için ilk ameliyat sırasında alınan beyin damar sisteminin dijital görüntüsünü kullanın. Ardından kafa plakasını daha önce olduğu gibi yeniden sabitleyin.

Gerekirse, görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilecek herhangi bir kemiği nazikçe inceltmek için bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Bir diş matkabı ile inceltin, görüntüleme penceresini kalıntılardan temizleyin ve% 0,9 steril salin damlası uygulayın. Hayvanı iki fotonlu bir mikroskoda taşıyın ve önceki seansta çekilen dijital floresan görüntüyü kullanarak orijinal görüntüleme alanını bulun.

Akış görünümü programını başlatın. Orijinal düşük büyütmeli görüntüyü açın, bilgisayar ekranına bir saydamlık sayfası yapıştırın ve bir saydam kalem kullanarak ana kan damarı modelini çizin. Ardından, canlı görüntüyü açın ve kan damar sistemini saydamlık filmi üzerinde çizilen desene göre yeniden hizalayın.

Sekiz x yakınlaştırılmış yapıyı yeniden görüntülemek için saydamlığı kaldırın. Önceki görüntüleme oturumundan istenen toplanan yığını açın. Yapıyı bilgisayar ekranına yapıştırılmış bir şeffaf film üzerine çizin.

Canlı görüntüden sekiz kat yakınlaştırın ve görüntüyü saydamlıkla hizalayın. Düşük büyütme konumunu hizalamanın doğruluğuna bağlı olarak, görüntünün açısını da hafifçe ayarlamak, pan koordinatlarını ilk günün Görüntüleme parametrelerine ayarlamak, adım boyutu ve görüntü sayısı da dahil olmak üzere, Zack yeniden görüntüleme iki kez gerçekleştirilebilir. Kafatasının bütünlüğünü bozmamak için kafa derisinin açılma sayısı sınırlandırılmalıdır, bu da GFPM eksprese eden farelerde zayıf görüntüleme çözünürlüğüne neden olacaktır.

Beşinci katman parametal hücrelerin bir alt kümesi ve karşılık gelen dendritik süreçler, in vivo iki foton lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirildi, burada GFP etiketli görsel korteks dendritleri gösterildi. Bu görüntü, PIA'dan her beş mikronda bir elde edilen tek bir görüntünün 175 mikronluk bir son derinliğe kadar bir izdüşümüdür. Kutulu bölge burada sıfırıncı günde daha yüksek büyütmede gösteriliyor ve yine burada dördüncü günde, sıfırıncı gün ve dördüncü günden itibaren dendritik dal görüntüsünün daha yüksek büyütmesi karşılaştırılıyor.

Bu görüntüler, kırmızı ok ucu ile işaretlenmiş geri çekilen dikenleri kaybeden beyaz ok başları ile gösterilen stabil dikenleri ve yeşil ok ucu ile gösterilen yeni dikenleri göstermektedir. İnce bir kafatası hazırlığı kullanarak fare görsel korteksinde kronik iki foton görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürü yaparken, kafatasına ve altta yatan duraya zarar vermemek için inceltme işlemi sırasında özel dikkat göstermeyi unutmamak önemlidir, çünkü bu, görüntüleme çözünürlüğünün düşük olmasına neden olur ve ayrıntılı notlar alır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.