Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Bu prosedürün genel amacı, periferik sinirden saf aksonal sitoplazma veya ektoplazma izole etmektir. Bu işlem, öncelikle siyatik sinirin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, sinirdeki bağ dokusunun uzaklaştırılması ve sles'lerin ayrıştırılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, kısa sinir lifi segmentlerinin hipotonik ortamda inkübe edilmesidir. Prosedürün son adımı ise izotonik çözeltide inkübasyon, santrifüjleme ve ozmotik dengelemedir. Nihayetinde, western blot analizi ile aksonal bileşenler için yüksek derecede zenginleşme gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Elle ve benimki de May Rosenbaum. Professor Mike F Laboratuvarı, Biyolojik Kimya Bölümü, Bilim Enstitüsü'nden geliyoruz. Bugün, Oxy Opat Mesylation'ın yeni bir tekniğini sunacağız.

Bu tekniğin periferik sinirlerin manuel sıkıştırma yoluyla OIS gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu prosedürün serum ve glia kontaminasyonunun aksonal içeriklere ulaşmasını azaltmasıdır. Siyatik sinir yaralanması sonrası D tabanlı retro sinyallemeyi araştırmak için bu yeni tekniği op PLAs metilasyonunda kullandık.

Öyleyse başlayalım. Siyatik sinirin distal kısmına doğrudan erişim sağlamak için, ötanize edilmiş sekiz ila 10 haftalık iki Wistar sıçanından birini bir diseksiyon matı üzerine yan tarafı üzerine yerleştirin. Uyluğun orta kısmındaki deriyi tıraş edin ve %70 etanol ile iyice silin.

Makas kullanarak deriyi uyluktan kesin. Femoral biceps ile yüzeysel gluteal kaslar arasındaki yağ ve bağ dokusunu dikkatlice kesin. Pens yardımıyla açığa çıkan siyatik sinir bölgesini kaldırın ve çıkarın.

Çıkarılan bölüm yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda olacaktır. Siniri, bir mikro santrifüj tüpü içindeki proteaz inhibitörleri içeren 500 µL buz gibi soğuk 2X PBS'ye aktarın. Tüpü buz üzerinde tutun.

Diseksiyon prosedürünü sıçanın diğer tarafında ve ikinci bir sıçanın her iki tarafında tekrarlayın. Bir Petri kabının tabanını pastör pipetiyle çizin ve kabı iki mililitre oda sıcaklığındaki 2X PBS ve proteaz inhibitörleri ile doldurun.

Diseksiyon mikroskobu altında tek bir siniri kaba aktarın. İnce pens kullanarak epineuryumu sinirden çekerek uzaklaştırın ve atın; fasikülleri kapta bırakın. Fasikülleri dikkatlice birbirinden ve kabın tabanından ayırın.

Tekil falesler bulanıklaşacak ve çözeltinin yüzeyinde yüzecektir. Ayrılan falesleri, proteaz inhibitörleri içeren 500 µL 0.2 X PB s bulunan bir mikro santrifüj tüpüne hemen aktarın. Slesleri buz üzerinde tutun.

Pratik yaparak tüpteki geri kalan siyatik sinirden sles'leri ayırın ve toplayın. Epineuryumun çıkarılması ve sles'lerin ayrılması, sinir başına 10 dakikadan fazla sürmemelidir.

Ayrıştırılmış SLES içeren tüpü buzun üzerinden çıkarın. Miyelini ve aksonal olmayan yapıları serbest bırakmak için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Her yıkama işlemi için SLES'i yıkayın.

SLES'leri nazikçe kaldırmak ve proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre 2X PB s içeren taze bir tüpe aktarmak için pens kullanın. Tüpü bir sarsıcının üzerinde beş dakika boyunca sallayın. SLES'leri yıkama işleminden sonra bu şekilde üç kez daha yıkayın.

Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için SLES'i yeni ve boş bir eppendorf tüpüne aktarın ve ardından proteaz inhibitörleri içeren 300 µL 1X PBS içeren bir tüpe transfer ederek oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. OPSM'yi elüe etmek için yüksek tuz konsantrasyonları, sonraki proteomik prosedürleri engeller. Doku ve hücre kalıntılarını çöktürmek için örneği 4 °C'de 10.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı temiz bir eppendorf tüpüne pipetle aktarın.

Elde edilen süpernatant berrak olmalıdır. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

200 ila 250 mikrogram protein verimi elde edilmelidir. Op plazma preparasyonunu, eksi 80 °C'de alikotlar halinde altı aya kadar saklayın. Çözme ve dondurma döngülerinden kaçının.

Burada, manuel sıkma yöntemiyle izole edilen op plazma ile bu protokolde gösterildiği gibi izole edilen opsm örneklerini karşılaştıran bir western blok yer almaktadır. Sırasıyla kan proteini ve glial hücre kontaminasyonlarını temsil eden albumin ve GFAP seviyelerindeki azalmaya dikkat edin. Buna karşılık, bu preparasyonda axonal tubulin beta three zenginleşmiştir ve bu da yüksek düzeyde aksonal proteinlerin olduğunu göstermektedir.

Bu videonun tamamını izledikten sonra, siyatik sinirin nasıl diseke edileceği ve Paco'nun nasıl düzgün bir şekilde ayrılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.