Name: Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Öğrenin sıçan siyatik sinirinden aksonlara zengin sitoplazma izolasyonu için bu güvenilir protokolü. Hipotonik ortamda inkübasyon ve santrifüjasyon adımlarıyla yüksek saflıkta aksonal bileşenler elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol, glial ve vasküler doku kontaminasyonu en aza indirilmesi ile axoplasm izolasyon sağlar. Bu yöntem, bir 8-10 haftalık Wistar sıçan başına yaklaşık 70-100 mg toplam axoplasm protein verir. 1. Siyatik Sinir teşrih <ol><li> CO 2 inhalasyon servikal dislokasyon iki sıçan Euthanize. Kalp atışı olmadığı için başından diseksiyonu önce palpe ölüm onaylayın. </li><li> Swab% 70 etanol ile diseksiyon alanı. </li><li> Cilt, ayrı kaslar kesin ve siyatik sinir, zararlı kan damarları olmadan makas ve forseps kullanarak dikkatli bir şekilde izole. Hem siyatik sinirleri teşrih (yaklaşık 1,5 cm), her hayvan ve 500 mcL PBS 0,2 X + inhibitörleri ile bir Eppendorf dört sinirler toplamak, buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> En az 2 mL PBS 0,2 X + proteaz inhibitörleri içeren plastik tabaklar sinir segmentleri aktarın. </li><li> Binoküler kapsamında ince forseps kullanarak sinirler epineurium çıkarın. Bulutlu hale gelene kadar çok fasiküller dikkatle ayırın ve çözüm yüzeyinde yüzen başlar. Bu adım (10 dakika başına daha fazla sinir almayan) hızlı ve doğru bir şekilde yapılabilir kadar uygulanmalıdır. </li></ol> 2. Kuluçka, Çamaşır ve Elüsyon <ol><li> Transfer oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon proteaz inhibitörleri içeren PBS 0,2 X 500 mcL ile taze bir Eppendorf tüp fasiküller ayrılmış. </li><li> 1 ml Eppendorf tüp Eppendorf tüp fasiküller transferi ve transfer edildikten sonra 5 dakika sallayarak aynı tampon ile en az 3 kez yıkayın. </li><li> Fasiküller sıvı aşırı kaldırmak için yeni ve boş bir Eppendorf tüp içine koymak ve sonra oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübasyon için proteaz inhibitörü içeren PBS 1X 300 mcL ile yeni bir Eppendorf tüpüne fasiküller transfer. </li><li> 10,000 xg'de 10 dakika santrifüjleyin 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve ölçü protein konsantrasyonu atın. Bu sizin axoplasm hazırlık. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Bu protokol gösterildiği gibi izole axoplasm örnekleri ile el sıkma yöntemi ile izole edilen Western Blot karşılaştırarak axoplasm. Sırasıyla, kan protein ve glial hücre Bulaşmayı temsil albümin ve GFAP düzeylerinde azalma, dikkat edin. Buna karşılık, aksonal tubulin b3 aksonal proteinlerin yüksek seviyesini gösteren, bu hazırlık zenginleştirilmiştir.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Biyokimyasal ve proteomik analiz, mekanik sıkmak 1 axoplasm izolasyonu için daha önce açıklanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu yordamı serum ve glial hücre kontaminasyonu 3 azalttığını teyit etmiştir . Biz, sonra dynein tabanlı retrograd sinyalizasyon siyatik sinir yaralanması 2 keşfetmek ve erişkin periferik sinir akson-glia etkileşimler de dahil olmak üzere 4 arama, pek çok diğer işlemler yardımcı olmasını bekliyoruz bu axoplasm izolasyon protokolü kullandık.

<ul><li> Erkek Wistar sıçanlar (8-10 hafta) </li><li> 50 ml başına proteaz inhibitörleri (Roshe) 2 tablet içeren PBS 0,2 X ve PBS 1X çözümler </li><li> 1,5 ml için Eppendorfs </li><li> Plastik tabaklar 35 mm Steril </li><li> Diseksiyon araçları, makas ve ince forseps: </li><li> Binoküler ve masa ışığı </li></ul> Antikorlar Fare anti-GFAP klon GA-5 Sigma (G6171) oldu. Tavşan anti-Albumin Cedarlane (CLAG5140) oldu. Fare anti-tubulin β3 ve tavşan anti-gERK Sigma (sırasıyla T2200 ve M5670) idi.

sıçan siyatik sinir axoplasm İzolasyon

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Periferik sinir saf aksonal sitoplazma (axoplasm) izolasyonu birçok biyolojik süreçlerin biyokimyasal çalışmalar için çok önemlidir. Bu makalede, biz göstermek ve yetişkin sıçan siyatik sinir aşağıdaki adımları dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol tarif: (1) sinir fasiküller ve bağ dokusu ayrılması diseksiyon, hipotonik ortamda sinir fasiküller kısa kesimleri (2) inkübasyon miyelin olmayan aksonal yapılar bırakın ve lyse; ve (3) kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarma. Bu hazırlık Proteomik ve biyokimyasal karakterizasyonu aksonal bileşenleri zenginleştirmek için yüksek derecede onaylamıştır.

Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.

Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Periferik sinirden saf aksonal sitoplazmanın (aksoplazma) izole edilmesi, birçok biyolojik sürecin biyokimyasal çalışmaları için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, biz ...

Bu prosedürün genel amacı, periferik sinirden saf aksonal sitoplazma veya ektoplazma izole etmektir. Bu işlem, öncelikle siyatik sinirin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, sinirdeki bağ dokusunun uzaklaştırılması ve sles'lerin ayrıştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, kısa sinir lifi segmentlerinin hipotonik ortamda inkübe edilmesidir. Prosedürün son adımı ise izotonik çözeltide inkübasyon, santrifüjleme ve ozmotik dengelemedir. Nihayetinde, western blot analizi ile aksonal bileşenler için yüksek derecede zenginleşme gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, benim adım Elle ve benimki de May Rosenbaum. Professor Mike F Laboratuvarı, Biyolojik Kimya Bölümü, Bilim Enstitüsü'nden geliyoruz. Bugün, Oxy Opat Mesylation'ın yeni bir tekniğini sunacağız.Bu tekniğin periferik sinirlerin manuel sıkıştırma yoluyla OIS gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu prosedürün serum ve glia kontaminasyonunun aksonal içeriklere ulaşmasını azaltmasıdır. Siyatik sinir yaralanması sonrası D tabanlı retro sinyallemeyi araştırmak için bu yeni tekniği op PLAs metilasyonunda kullandık.Öyleyse başlayalım. Siyatik sinirin distal kısmına doğrudan erişim sağlamak için, ötanize

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Cerrahi basitlik ve sağlam davranışsal sonuçları nedeniyle, siyatik sinirin kronik daralma nöropatik ağrı seçkin hayvan modelleri biridir. Ameliyat sonrası 24 saat içinde, ağrı aşırı duyarlılık kurulan ve kantitatif bir von Frey aesthesiometer (mekanik test) ve plantar analjezi metre (termal testi) kullanılarak ölçülebilir.

Siyatik Sinir Sıçanlarda Ağrı aşırı duyarlılık Test Kronik daraltma

Bu video, fare omurga köklerinden Schwann hücrelerinin izolasyonunu ve kültürlenmesini özetlemektedir. İzole edilen hücreler daha sonra spesifik ortamda kültürlenir. Schwann hücreleri, diferansiyel sindirim ve aderans yoluyla izole edilir. Daha sonra bağlanma ve çoğalma için hücre dışı matris kaplı lamellere aktarılırlar.

Schwann Hücrelerinin Fare Omurga Köklerinden İzolasyonu

Bu video, Schwann hücrelerini fare siyatik sinir liflerinden izole etmek için bir yöntemi göstermektedir.

Schwann Hücrelerinin Fare Siyatik Sinirlerinden Manyetik Olarak Ayrılması

Bu video, sıçanlarda C-fiber sinir iletiminin tek lifli bir kaydını göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir sıçan, alt ekstremitelere duyusal ve motor besleme sağlayan siyatik siniri açığa çıkarmak için kesilir. Tek tek C-lifleri daha sonra açığa çıkar. Ayağa yerleştirilen uyarı elektrotları kullanılarak elektriksel stimülasyon sağlanır ve tek bir sinir lifinden yanıt kaydedilir.

Sıçanlarda siyatik sinir C-liflerinin in vivo tek lif kaydı

Burada, kemirgen siyatik sinirindeki Schwann hücrelerine (SC'ler) gen transferi için in vivo bir teknik sunuyoruz. Bu basit teknik, miyelinizan SK'lerin geliştirilmesi ve sürdürülmesinde yer alan sinyalleme mekanizmalarını araştırmak için kullanışlıdır.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

Burada, omuriliğin hidrolik ekstrüzyonunun yanı sıra aynı kemirgende spesifik dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) tanımlanması ve izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Standart omurilik izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yöntem önemli ölçüde daha hızlıdır ve doku hasarı riskini azaltır.

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Bu yöntem sıçan medial gastroknemius kas motor birimlerinin üç tip seğirme ve tetanik kasılmalar ve eylem potansiyellerinin kuvvet kayıt sağlar. Tek bir motor ünitesinin fonksiyonel izolasyonu aksonun elektriksel uyarılması ile indüklenir.

Sıçan Medial Gastroknemius KasTek Motor Üniteleri Fonksiyonel İzolasyon

Bu protokol, sıçan tüm siyatik sinir dokusunun ex vivo elektrofizyolojik stimülasyon için hazırlanmasını ve çevresel olarak düzenlenmiş, iki bölmeli, perfüze edilmiş bir salin banyosunda kaydedilmesini açıklar.

Ex Vivo Nörofizyoloji için Sıçan Siyatik Sinirinin Hazırlanması

Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.

Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu

Öğrenin sıçan siyatik sinirinden aksonlara zengin sitoplazma izolasyonu için bu güvenilir protokolü. Hipotonik ortamda inkübasyon ve santrifüjasyon adımlarıyla yüksek saflıkta aksonal bileşenler elde edilir.

Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Daha fazla video keşfet