Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon
September 24th, 2010
Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.
Bu prosedürün genel amacı, saf aksonal sitoplazmayı veya ektoplazmayı periferik sinirden izole etmektir. Bu, önce siyatik sinirin diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, bağ dokusunun sinirden çıkarılması ve kızakların ayrılmasıdır.
İşlemin üçüncü adımı, kısa sinir segmentlerinin hipotonik ortamda inkübe edilmesidir. İşlemin son adımı, izotonik çözelti santrifüjleme ve opsm milian içinde inkübasyondur. Sonuç olarak, western blot analizi ile aksonal bileşenler için yüksek derecede zenginleştirme gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Merhaba, benim adım Ben, Elle Ve ben Rosenbaum olabilirim. Biz, Fen Bilimleri Enstitüsü Biyolojik Kimya Bölümü Profesör Mike F İşçi Laboratuvarı'ndan geliyoruz. Bugün yeni bir Oksi Opat Mesilasyon tekniğini temsil edeceğiz.
Bu tekniğin periferik sinirin OIS ile manuel olarak sıkılması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajıdır. Yani, bu prosedür serum ve glos kontaminasyonunu azaltır, aksonal içeriklere ulaşır. Siyatik sinir yaralanmasından sonra D tabanlı retro sinyallemeyi keşfetmek için op PLA'ların metilasyonu için bu yeni tekniği kullandık.
Öyleyse başlayalım. Siyatik sinirin distal kısmına doğrudan bir yaklaşım için ötenazi yapılmış sekiz ila 10 haftalık wistar sıçanlarından birini yan yana bir diseksiyon matı üzerine yerleştirin. Cildi uyluğun ortasından tıraş edin ve %70 etanol ile iyice değiştirin.
Uyluktaki cildi kesmek için makas kullanın. Femoral pazı ve yüzeysel gluteal kaslar arasındaki yağ ve bağ dokusunu dikkatlice kesin. Siyatik sinirin açıkta kalan bölgesini kaldırmak için forseps kullanın ve çıkarın.
Çıkarılan bölüm yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda olacaktır. Siniri bir mikro santrifüj tüpünde proteaz inhibitörleri ile 500 mikrolitre buz gibi 2X PBS'ye aktarın. Tüpü buz üzerinde tutun.
Diseksiyon prosedürünü sıçanın diğer tarafında ve ikinci bir sıçanın her iki tarafında tekrarlayın. Bir Petri kabının altını bir macun pipeti ile çizin ve iki mililitre oda sıcaklığında doldurun. Proteaz inhibitörleri ile iki X PB'yi işaretleyin.
Diseksiyon mikroskobu altında tek bir siniri tabağa aktarın. Epi nearium'u sinirden çekerek çıkarmak için ince forseps kullanın ve fasiliteleri tabakta bırakarak atın. Kolaylıkları birbirinden ve tabağın dibinden dikkatlice ayırın.
Bireysel fales bulanıklaşacak ve çözeltinin yüzeyinde yüzecektir. Ayrılan falları hemen proteaz inhibitörleri ile 500 mikrolitre 0.2 X PB s içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kızakları buz üzerinde tutun.
Tüpte kalan siyatikten sles'i pratik yaparak ayırın ve toplayın. Epineuriumun çıkarılması ve kızakların ayrılması. Sinir başına 10 dakikadan fazla sürmemelidir.
Ayrılmış SLES'i içeren tüpü buzdan çıkarın. Miyelin ve bitleri aksonal olmayan yapıları serbest bırakmak için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Her yıkama için kızakları yıkayın.
Kılıfları nazikçe kaldırmak için forseps kullanın ve bunları proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre 2X PB s içeren yeni bir tüpe aktarın. Tüpü bir külbütör üzerinde beş dakika boyunca sallayın. SLES'i yıkadıktan sonra üç kez bu şekilde yıkayın.
Fazla sıvıyı çıkarmak için SLES'i yeni bir boş einor tüpüne aktarın ve daha sonra proteus inhibitörleri ile 300 mikrolitre bir XPBS içeren bir tüpe aktarın, oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Opsm'yi elüte etmek için, daha yüksek tuz konsantrasyonları daha sonraki proteomik prosedürlere müdahale eder. Fasikülü 10.000 peynirde dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve doku ve hücre kalıntıları pipetini süpernatanı temiz bir einor tüpüne peletleyin.
Süpernatan elde edildi. Açık olmalı. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.
200 ila 250 mikrogram protein verimi elde edilmelidir. Op plazma preparatını altı aya kadar eksi 80 santigrat derecede alikotlarda saklayın. Çözülme ve donma döngülerinden kaçının.
Burada, manuel sıkma yöntemi ile izole edilen op plazma ile bu protokolde gösterildiği gibi izole edilen opsm örneklerini karşılaştıran bir batı bloğu bulunmaktadır. Sırasıyla kan proteini ve glial hücre kontaminasyonlarını temsil eden düşük albümin ve GFAP seviyelerine dikkat edin. Buna karşılık, aksonal tübülin beta üç, bu preparatta zenginleştirilmiştir, bu da yüksek düzeyde aksonal protein olduğunu gösterir.
Tüm bu videoyu izledikten sonra, satic sinirin nasıl diseksiyon edileceğini ve Paco'nun nasıl düzgün bir şekilde ayrılacağını iyi anlamış olmalısınız. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, yetişkin sıçan siyatik sinirinden aksoplazmanın izole edilmesi için detaylı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, sinir fasküllerinin diseksiyonunu ve miyelinin ve non-aksonal yapıların etkili bir şekilde salınması için hipotonik bir ortamda inkübasyonu içerir, bu da akson bakımından zengin malzemenin ekstraksiyonuna yol açar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Akson Araştırmaları
Arka Plan
- Aksonal sitoplazmanın izolasyonu, nöronal fonksiyon çalışmaları için kritik öneme sahiptir.
- Siyatik sinir, periferik sinir çalışmaları için bir model olarak hizmet eder.
- Aksonal bileşenlerin anlaşılması, nörolojik araştırmalara yardımcı olabilir.
- Önceki yöntemler, saf aksonal malzeme elde etmeyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Aksoplazma izolasyonu için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Daha fazla analiz için aksonal sitoplazmanın saflığını artırmak.
- Biyokimyasal teknikler kullanılarak aksonal bileşenlerin çalışmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sinir fasküllerine erişmek için siyatik sinirin diseksiyonu.
- Siniri çevreleyen bağ dokusunun çıkarılması.
- Sinir segmentlerinin hipotonik bir ortamda inkübasyonu.
- Sonraki santrifüjleme ve izotonik solüsyonda inkübasyon.
Ana Sonuçlar
- Protokol, aksonal sitoplazmayı başarılı bir şekilde izole eder.
- Western blot analizi, aksonal bileşenlerin yüksek zenginleşmesini doğrular.
- Sonuçlar, yöntemin etkinliğini gösterir.
- Aksonal biyoloji çalışmalarında potansiyel uygulamalar vurgulanır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, aksoplazma izolasyonu için sağlam bir yaklaşım sunar.
- Nöronal fonksiyonla ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılabilir.
- Bulgular, aksonal yapının ve fonksiyonun anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
