Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan proteini kodlayan bir plazmit ile şık somitlerin veya nöral tüplerin tek hücrelerini enjekte etmektir. Bu, önce uygun bir uç açma çapına sahip mikroenjeksiyon pipetlerinin çekilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, enjeksiyonlar için bir plazmit stoğu hazırlamaktır.

İşlemin üçüncü adımı, embriyoları enjeksiyona hazırlamaktır. Prosedürün dördüncü adımı, mikro pipetlere plazmit DNA yüklemektir. İşlemin son adımı, istenen dokuların enjekte edilmesidir.

Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ile seçilen som ve nöral tüp alt alanlarında tek etiketli progenitörler tarafından üretilen hücre sayısındaki türev aralığını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Kudüs İbrani Üniversitesi Tıbbi Nörobiyoloji Bölümü'nde Profesör Heim'ın Laboratuvarından Rael. Bugün size tek hücre tavuk somitleri ve nöral tüpleri enjekte etmek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarda so akar ve nöral tüp hücrelerinin çizgi ayrımını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım: Civciv embriyolarında tek transfekte hücreler oluşturmak için mikro pipetleri çekerek başlayın. Pipetlerimizi 13,5 ısı ayarına sahip standart bir Naga PP 83 pipet çektirme üzerinde çekiyoruz.

Sekiz ila 10 mikron arasında bir pipet ucu çapı elde etmek için hassas ayar kalibre edilmelidir. Dış çapı bir milimetre ve iç çapı 0,75 ila 0,78 milimetre olan Boris silikat cam tüpler içeren filament kullanıyoruz. Ayrıca, bir milimetre dış çapa ve 0,75 milimetre iç çapa sahip bir filamente sahip olmayan, piyasada bulunan mikro pipetleri de kullanabilirsiniz.

Hazırlanan pipetler, uçları tabağın kenarı ile temastan korunacak şekilde plastik bir tabakta saklanır. DNA'yı mikroenjeksiyona hazırlamak için, ilgilenilen plazmit DH beş alfa e coli'ye transfekte edilir. Ertesi gün standart prosedürler kullanılarak, plazmit klonal olmayan enjeksiyonlar için bir Maxi hazırlık kiti kullanılarak saflaştırılır, mikrolitre başına bir mikrogramlık bir DNA konsantrasyonu kullanırız.

Bireysel klonların istendiği deneyler için, plazmit konsantrasyonu çok daha düşük olacak ve ayarlanması gerekecektir. P-C-A-G-G-F-P-A için mikrolitre başına 0.05 ila 0.1 mikrogram konsantrasyonu iyi sonuç verir. Optimal konsantrasyon belirlendikten sonra, tek tek preparatlar yerine saflaştırılmış plazmit stoğunun tamamının önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltilmesini öneririz.

Sonuncusu, muhtemelen saflık ve diğer parametrelerdeki farklılıklar nedeniyle, istenen gelişim aşamasına kadar uzun eksenleri üzerinde yatarken kuluçkaya yatırılan mikroenjeksiyon için yumurta hazırlamak için süper bobin plazmidinin oranı gibi diğer parametrelerde bazı farklılıklar ortaya çıkarabilir. Ardından, yumurtanın sivri ucunu cerrahi makasla delin. 10 mililitrelik bir şırınga ve 19 gauge bir iğne kullanarak, yumurtadan iki mililitre albümin çekin, enjeksiyondan önce delikleri sıcak parafin ile kapatın.

Deliğe girmesini önlemek için yumurta kabuğunun üstünde bir pencere açmak için cerrahi makas kullanın. Pencerenin üzerine bir parça bant yerleştirin ve içinden bir delik açın. Embriyoyu görselleştirmeye yardımcı olmak için, püskürtülmüş dermin altına pelikan 17 gibi toksik olmayan bir mürekkep enjekte etmek için bir aspiratöre monte edilmiş, ateşle çekilmiş bir kılcal damar kullanın.

Daha sonra, DNA'yı çekilen pipet Eloqua'ya yüklemek için bir iğne tutucuya monte edilmiş 0.14 milimetre böcek pimleri kullanarak hayati ve/veya amniyotik zarları keserek ve yönlendirerek embriyoya erişin ve kılcal damarı kullanarak az miktarda hızlı yeşil toz ekleyin. Bir aspiratör üzerine yeterli çapta minimum miktarda plazmide monte edilmiş kılcal damar çekin. Daha sonra pipetin keskinleştirilmiş ucunun karşısındaki ucuna yerleştirin ve DNA'yı keskinleştirilmiş uca mümkün olduğunca yakın yükleyin.

Ardından, pipeti bir mikro manipülatöre monte edilmiş manuel bir hava basıncı enjektörüne takın. Plazmid çözeltisinin pipetin ucuna ulaşmasını sağlamak için gerekirse minimum miktarda basınç uygulayın. Pipet ucunun tıkanmasını önlemek için biraz hava basıncı uygularken pipeti yumurtanın sıvı ortamına yerleştirin.

İlgili doku alanı delindikten sonra, basınçtaki değişiklik genellikle plazmiti görünür hızlı yeşil renkle serbest bırakmak için yeterlidir. Bu olmazsa, plazmit hızlı yeşil karışımı çıkana kadar şırıngaya hafif bir basınç uygulayın. Enjeksiyonu takiben embriyonun ekseni boyunca bu işlemi tekrarlayın, PBS eklenebilir.

Son olarak, pencereyi yapışkan bantla kapatın ve yumurtaları kuluçka makinesine geri koyun. Havalandırmadan kaçının ve nemin korunmasına ve verimin artırılmasına yardımcı olmak için inkübatöre küçük su kapları ekleyin. Enjeksiyonun hedef bölgesi, dorsal somitler, nöral tüp veya ektoderm gibi kolayca görülebilecek kadar yüzeysel ise, bir floresan dürbün kullanarak tam bir montaj gözlemi yaparak deneyin başarı oranı ölçülebilir.

Bu adım, çok fazla veya çok az hücrenin etiketlenip etiketlenmediğini değerlendirmek için özellikle yararlıdır. Daha fazla inkübasyon isteniyorsa, gördükten sonra yumurtaya PBS solüsyonu içeren antibiyotikler ekleyin ve tavan bandını değiştirin. Ek olarak, embriyoların seri olarak kesit alınması ve immünohistokimya yapılması ile enjeksiyonun başarı oranı değerlendirilebilir.

Dört saat veya daha uzun bir süre sonra, enjeksiyon sonrası embriyolar sabitlenir ve parafin kesiti için işlenir. Cama monte edilen bölümler daha sonra depa sonlandırılır ve raportör görselleştirme için immünostain, biotin, streptavidin gibi amplifikasyon yöntemleri arzu edilebilir. Son olarak, enjekte edilen segmentlerdeki etiketli hücreleri tespit etmek için seri bölümler taranır.

İlk denemelerde tek hücre yerine birden fazla hücre elde edilirse, plazmit stoğu, yeterli sonuçlar elde edilene kadar tekrarlanan işlemde seyreltilmelidir. Tipik olarak, embriyo başına altı ila 12 segmenti hedeflerken, akar başına tek bir P-C-A-G-G-F-P enjeksiyonu gerçekleştiririz. Bu ayar altında, 10 embriyodan birinde en az bir segmentte enjeksiyondan sekiz saat sonra tüm montaj gözlemi ile net bir sinyal tespit edilebilir.

Bu örnekte, bir so akarı, bir GFP kodlayan plazmid ile enjekte edildi ve beş saat sonra, burada gösterilen embriyonun tam bir montaj görünümünde tek bir floresan hücresi gözlendi. Merkezi so mite enjeksiyonundan 24 saat sonra gözlendiğinde, klonal enjeksiyondan iki gün sonra bütün monte edilmiş bir embriyoda bir floresan hücre klonu gözlenir. Bu segmentin kesitlenmesi, hem dermiste hem de kasta klonal döllerin varlığını ortaya çıkarır ve tek progenitörlerin her iki türevi de ürettiğini gösterir.

Somitlere gelince, dorsal nöral tüpteki tek nöro epitelyal progenitörler de enjeksiyondan beş saat sonra fotoğraflanan bu enine kesitte gösterildiği gibi kazığa oturtulabilir. Seri kesit analizi, başarı oranı yaklaşık %10 olduğunda klonal transfekte ulaşıldığını ortaya koyduBu, klonaliteyi elde etmek için tekniğin tanımı gereği oldukça verimsiz olduğu anlamına gelir. Öte yandan, bu koşullar altında, pozitif etiketleme olaylarının %93'ünden fazlasının klonal olduğu bulunmuştur.

Bu işlemi yaparken size tavuk embriyolarının tek hücrelerini nasıl enjekte edeceğinizi gösterdik. Büyük miktarda stok plazmidini tek hücreli enfeksiyonlar için ideal bir konsantrasyona seyreltmeyi ve ardından deneyleriniz boyunca kullanmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.