Membran Potansiyelleri, Synaptic Yanıtları, Sinir Devresi, Nöromodülasyon ve Kerevit kullanarak kas Histoloji: Öğrenci Laboratuvarı Egzersizler

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, uyarılabilir zarların özelliklerini ve dinlenme zarı potansiyelinin iyonik temelini anlamak ve zar potansiyelini ölçme yöntemlerini öğrenmenin yanı sıra sinaptik iletimin özelliklerini göstermektir. Deneyin bir bölümünde, hücre dışı potasyum değiştirilirken dinlenme zarı potansiyeli ölçülecektir. Deneyin başka bir bölümünde, sinaptik farklılaşma mekanizmaları, çeşitli motor birimlerde uyarılmış sinaptik tepkiler kaydedilerek araştırılacaktır.

Daha sonra, bakımı kolay bir sinir devresi sunulur. Bu hazırlık, CNS'den motor nörona ve kas devresine kadar bir duyusal alanın çeşitli yönlerini araştırmanın yanı sıra öğretmek için de kullanılabilir. Bu deney seti, zar potansiyeli sinaptik entegrasyon ve iletim ile ilgili sorunları ve kas lifi tiplerinin yapısal farklılıklarını ele almak için kerevit modelini kullanmanın kolaylığını göstermektedir.

Kerevit preparatının elektrofizyolojik kavram ve tekniklerin öğretiminde kullanılmasının temel avantajları, diseksiyon kolaylığı, preparatın minimal salin canlılığı, sinaptik yanıtlar elde etme kolaylığı ve kasların genel anatomik düzenlemesini ayırt etme kolaylığıdır. Bu teknikler diğer preparatlara da uygulanabilir ve gösterilen preparattaki sinaptik fizyoloji ve modülasyon ile biyokimyasal ve yapısal farklılıklar hakkındaki anlayışımızı ilerletecektir. Ameliyata başlamak için, vücut uzunluğu yaklaşık altı ila 10 santimetre olan bir kerevit seçin ve kerevitin başını kesmek için uyuşturmak için beş dakika boyunca kırılmış buzun içine koyun, başın arkasından tutun, parmaklarınızı büyük makas kullanarak kerevitin pençelerinden ve ağzından uzak tuttuğunuzdan emin olun.

Kerevitin gözlerinin arkasından temiz bir kesim yaparak kafayı hızlı bir şekilde çıkarın, yaralanmayı önlemek için kerevitin bacaklarını ve pençelerini çıkarın. Erkeklerde stilleri ve hem erkeklerde hem de dişilerde yüzücü etlerini çıkarın. Başı ve uzantıları atın.

Daha sonra, karın ve göğüs kafesi birleştiren eklem zarı boyunca bir kesi yaparak karnı torakstan ayırın. Kerevitin karın kısmını saklayın ve göğsü atın, makası hafifçe ventral tarafa doğru işaret edin ve belirli bir açıyla, karnın her iki tarafının alt yan sınırı boyunca kabukta bir kesim yapın. Kerevitleri çok derinden kesmemeye dikkat edin.

Forseps kullanarak her bir segmentin uzunluğu boyunca uzanan kerevit çizgilerinin doğal kabuk modelini takip edin. Kabuğun ventral kısmını yukarı ve geri çekerek çıkarın. Karın kaslarını tahrip etmemeye özen göstermek.

Fleksör kaslarını çıkarın. Bu noktada, derin fleksör kasların üzerinde beyaz bir doku kütlesi görülebilir. Bu dokuyu forseps ile dikkatlice çıkarın.

GI yolu artık derin fleksör kaslarının orta hattı boyunca uzanan küçük bir tüp olarak görülebilir. Üstten forseps ile sıkıştırarak ve karından çekerek çıkarın. Kuyruğun sonunda GI yolunun altını kesin.

Dışkı atığının preparasyona müdahale etmemesini sağlamak için diseksiyonu tuzlu su ile durulayın. Diseksiyon pimlerini kullanarak, preparatın üst ve alt köşelerini S koruyucu kaplı bir Petri kabına sabitleyin. Abdominal ekstansör kaslar artık açığa çıkar.

Hücre içi kayıtlar yapılana kadar preparatörü kaplamak için Petri kabına tuzlu su çözeltisi dökün. Petri kabını mikroskoba taşıyın ve hareket etmesini önlemek için kabın altına balmumu kullanın. Hücre içi kayıtlar için kullanılan aparat bu şekilde gösterilmiştir.

Uygun bağlantılar ve ayarlar ekteki metinde verilmiştir. Laboratuvar şeması yazılımını talimatlara göre ayarlayın. Ekteki metinde, topraklama kablosunu tuzlu su banyosuna yerleştirin.

Üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş bir cam mikro pipetin ucunu tuzlu su banyosuna yerleştirin ve elektrot direncini test edin. Elektrot direnci 20 ila 60 mega ohm olmalıdır. Üzerindeki kaba düğmeyi kullanın amplifier yüksek yoğunluklu aydınlatma altında laboratuvar şemasındaki çizgiyi sıfıra hareket ettirmek için.

Mikroskoptan bakın ve uzunlamasına DEM kaslarını tanımlayın. Hücre içi elektrodu DEM kasının bir kas lifine yerleştirmek için elektrot probunu kullanın. Elektrot kas lifine zar zor yerleştirilmelidir.

Hücrenin tamamına nüfuz etmemeye dikkat edin. Dinlenme potansiyelinin genliğini ölçün. M imlecini, grafik penceresinin sol alt köşesindeki konumdan izlemenin üzerine sürükleyin.

M işaretçisini taban çizgisine yerleştirin ve imleci kaydedilen sinyaldeki en düşük noktaya getirin. İşaretçi ile etkin imleç arasındaki fark, ekranın sağ üst tarafında görüntülenir. Bu değer, dinlenme membran potansiyelinin voltajıdır.

Kaydedilen voltajı amplifikasyon miktarına bölün, bu durumda 10 x amplifikasyon kullanılmıştır. Ardından voltajı volttan milivolta dönüştürün. Bu kas lifi için dinlenme potansiyelini kaydettikten sonra, mikroskoptan bakın ve elektrodu kas lifinden dikkatlice çıkarın.

Hücre içi kaydı diğer kas lifleri üzerinde tekrarlayın. Bu deneyin bir sonraki kısmı, hücre dışı potasyum konsantrasyonunun arttırılmasının dinlenme zarı üzerindeki etkisini izleyecektir. Potansiyel altı kerevit tuzlu su çözeltisi, 5.4 20, 40, 60, 80 ve 100 milimolar potasyum konsantrasyonları ile kullanılacaktır.

Kayıtlar arasında bir sonraki hücre içi kaydı yapmak için seğirmeyen bir kas seçin. Banyo solüsyonunu bir sonraki yüksek konsantrasyonda potasyum klorür solüsyonu ile değiştirin. Her seferinde hazırlığı tamamen kapattığınızdan emin olun.

Her çözelti için membran potansiyelindeki değişiklikleri kaydedin. Hücre dışı potasyum konsantrasyonunun arttırılmasının etkisi, zar potansiyeli, bu ekran yakalama çiziminde, zar potansiyeline karşı hücre dışı potasyum konsantrasyonunun yarı log grafiği üzerinde her bir potasyum konsantrasyonu için dinlenme zarı potansiyellerini göstermektedir. Dinlenme potansiyelini 5.4 milimolar hücre dışı potasyumda hizalayın.

Varsayımsal ve gözlemlenen eğriler için, gözlemlenen çizginin eğimini varsayımsal çizginin eğimiyle karşılaştırın. Bu elektrofizyolojik kayıtları bitirdikten sonra, bir sonraki adım kas liflerinin anatomisini ve innervasyon paternlerini incelemektir. Hazırlığı ayakta duran tabağa aktarın ve metilen mavisi ekleyin.

Beş dakika sonra metilen mavisini çıkarın ve taze kerevit tuzlu su ekleyin. Bir segment içindeki kasları innerve eden ana siniri arayın. Bir segmentteki S-E-M-D-E-L 2D, EL one ve DEM kaslarına innervasyon paterni çizin.

Ardından, hazırlığı bir davlumbazın altına taşıyın. Tuzlu suyu çıkarın ve sabitleyiciyi ekleyin. Burada kullanılan fiksatif bir poin çözeltisidir.

Çeker ocakların amacı, fiksatifin buharlarını önlemektir. Bu solüsyonu cildinize veya gözlerinize bulaştırmamaya çok dikkat edin. Gözleriniz yanmaya başlarsa, gözlerinizi hemen göz yıkama istasyonunda yıkayın.

Boin çözeltisinin yaklaşık 10 dakika boyunca preparat üzerinde kalmasına izin verin ve ardından çözeltiyi tuzlu su ile değiştirmek için bir pipet kullanın. DEL bir veya DEL iki kasının ince bir bölümünü kesin. Bir cam slayt üzerine yerleştirin.

Slaydı etiketleyin. SEM kası için işlemi tekrarlayın. Her iki doku preparatında sarkomer bantlama modelini görüntülemek için bileşik mikroskobu kullanın.

Bir sonraki deney serisi, kerevit karın kaslarında sinaptik tepkilerin nasıl kaydedileceğini inceleyecektir. Başka bir kerevit seçin, kafasını kesin. Göğüs kafesi ve ekleri çıkarın ve ameliyatta gösterildiği gibi abdominal ekstansör kasları ortaya çıkarın.

Bu videonun ilk bölümünde, mikroskop kullanarak, motor aksonları ekstansör kaslara taşıyan siniri bulun. En erişilebilir sinire sahip segmenti arayın. Sinir beyazdır ve preparat üzerine tuzlu su püskürtmek için bir pipet kullanılarak veya preparat üzerine hafifçe üflenerek görülebilir.

Bu, sinirin hareket etmesine neden olur ve böylece tanımlanmasını kolaylaştırır. Mikrom manipülatörü tarafından tutulan aspirasyon elektrodunu doğrudan sinirin üzerine yerleştirin. Siniri elektrotun içine çekmek için şırıngayı yavaşça çekin.

Mikroskop aracılığıyla sinirin elektrot içine emildiğini görebilirsiniz. Laboratuvar şeması yazılımındaki ayarları ekteki makalede belirtildiği gibi yapın. Üç molar potasyum klorür cam mikro elektrodu doldurun ve kafa aşamasına ve güç laboratuvarına bağlayın.

Laboratuvar çizelgesindeki çizgiyi sıfıra taşımak için amplifikatör üzerindeki kurs düğmesini kullanın. Elektrodu yerleştirmeden önce, geçiş düğmesi birkaç kez açılıp kapatılmalıdır. Elektrot direncini test etmek için, elde edilen değerlerin genliğini ölçün.

Mikroskoptan bakın ve elektrotu uzunlamasına kas liflerinden birine, DEM veya DL bir veya DL ikisine yerleştirmek için elektrot probunu kullanın. Kas lifine nüfuz etmemeye dikkat edin. Hazırlık artık deney için hazırdır.

Emme elektrodu, segmental sinir demetini uyarmak için kullanılır ve cam mikro elektrot, kas lifinden sinaptik yanıtı kaydetmek, greft stimülatörünü tetiklemek ve fazik yanıtlar için siniri bir hertz'de uyarmak için kullanılır. Ardından, elektrodu bir SEL kas lifine yerleştirin. SEL tonik bir kastır.

Tonik tepkiler için 10 hertz'de kısa nabız patlamaları ile siniri uyarın. DEL ve SEL kaslarının kaydedilen tepkilerini karşılaştırın. Fazik DEL kaslarının, tonik SEL kaslarından daha büyük genlikli sinaptik tepkilere sahip olduğunu unutmayın.

Bu sonraki deney seti, ekstansör kaslardan ziyade kerevit fleksör kaslarına odaklanmaktadır. Yeni bir kerevit ile başlayarak, bu ameliyatta gösterildiği gibi karnı izole edin. Bu videonun ilk bölümünde, izole edilmiş kuyruk preparatını tuzlu su dolu bir Petri kabına yerleştirin, preparatın kuyruğunu ve üst kısmını sabitleyin.

Caro'nun tonik fleksör kasları üzerinde yaptığı deneylerde, ventral sinir kordonunun sağlam bırakılması gerektiğini unutmayın. Preparatın ventral tarafındaki iki kaburga arasındaki eklem zarından uzunlamasına bir kesim başlatmak için bir neşter kullanın. Bu kesimi yaparken çok derin kesmemeye çok dikkat edin, çünkü derin bir kesi, yüzeysel kasların zarar görmemesini sağlamak için motor sinir kökünü kesebilir.

Bir sonraki adımı yapın. Kası kaplayan ince zar tabakasındaki uzunlamasına kesiden makas veya neşter kullanılarak mikroskoptan bakmak. Bir mafsallı membran kanadı yapmak için kesimi büyütün ve kanadı yukarı doğru kaldırın.

Yüzeysel fleksör kaslardan hücre içi kayıt için yüzeysel fleksör kaslarını açığa çıkaran flebi kesmek için makas kullanın. Dinlenme membran potansiyelini ve abdominal ekstansörlerden gelen sinaptik yanıtları kaydetmek için kullanılanla aynı enstrümantasyonu ve kurulumu kullanın. Daha önce olduğu gibi, üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş bir hücre içi elektrot kullanın.

Elektrodu, kasın içinden geçmemeye dikkat ederek yüzeysel fleksör kasların bir kas lifine yerleştirin. EPSP'lerin spontan aktivitesini kaydedin. EPSP'lerin farklı boyutlarına ve herhangi bir IPSP'nin mevcut olup olmadığına dikkat edin.

Küçük bir boya fırçası alın ve kayıt elektrodunu içeren aynı segment içindeki kütikül kenarı boyunca dikkatlice fırçalayın. Daha büyük bir yanıt gözlenirse, stimülasyon nedeniyle EPSP'lerin frekansında veya boyutunda herhangi bir değişikliğe dikkat edin. Bu, duyusal sinir ateşlemesindeki değişikliğe yanıt veren ek motor nöronların işe alındığını gösterir.

Tuzlu su banyosu solüsyonunu, bir mikromolar serotonin veya karbondioksit ile köpürtülmüş salin gibi bir nöromodülatör içeren solüsyonla dikkatlice değiştirin. Ardından boya fırçası stimülasyonunu tekrarlayın. Banyo solüsyonunu değiştirmenin kaydedilen aktivite üzerindeki etkisine dikkat edin.

Banyo tuzlu suyunu normal tuzlu suya geri döndürün ve kas lifi aktivitesinin taban çizgisine döndüğünü gözlemleyin. Bu şekil, yüzeysel bir fleksör kas lifinde kaydedilen EPSP'leri göstermektedir. EPSP'lerin farklı boyutlarına dikkat edin.

Bu deneyin bir sonraki aşaması, duyusal CNS'ye ve motor nöron devresine duyusal aktiviteye yanıt veren motor nöronlardan aksiyon potansiyellerini izlemek için hücre dışı bir elektrot kullanır. Duyusal sinirleri uyarmak için bir emme elektrodu yaparak başlayın. Bir parça plastik boruyu alevin üzerine çekin.

Bir sonraki adım, boruyu istenen boyuta geri kırpmaktır. Bunu yapmak için, emme elektrotunuz için istenen açılma çapını değerlendirmek için hazırlığınızdaki sinire bakmanız gerekecektir. Kerevitin boyutuna bağlı olarak, sinir demetlerinin boyutu yaklaşık bir milimetre ila birkaç milimetre çapında değişebilir.

Uçtaki açıklığı siniri tutmak için doğru boyutta yapmak için borunun gerilmiş bölümünü kesin. Açıklık çok büyükse, sinir düşebilir. Açıklık çok küçükse, sinir elektrotun basıncından zarar görebilir.

Plastik boruyu bir cam suc elektrodun ucuna yerleştirin. Elektrofizyoloji ve yazılım kurulumu, hücre içi kayıtlara kıyasla hücre dışı yanıtların izlenmesinden biraz farklıdır. Ekteki makalede belirtildiği gibi ekipman, yüzeysel fleksör kasını emme elektroduna innerve eden üçüncü yolu emer.

Artık aksiyon potansiyellerini kaydetmeye başlayabilirsiniz. Bu rotada beş uyarıcı motor nöron ve bir inhibitör motor nöron bulunur. Temel aktiviteyi kaydettikten sonra, üretilen aksiyon potansiyellerindeki değişikliği gözlemlemek için kütikülü bir fırça ile uyarın.

Bunu takiben, banyo solüsyonunu önceki deneyde olduğu gibi serotonin gibi nöromodülatörlerle değiştirin ve yanıttaki herhangi bir değişikliği kaydedin. Ek alıştırmalar ekteki metinde verilmiştir. Bu kayıt, kütikülün bir fırça ile uyarılmasından önce ve uyarılması sırasında üçüncü rotadan kaydedilen aksiyon potansiyellerini gösterir, fırçalamadan önceki aksiyon potansiyellerinin frekansını stimülasyon sırasındaki frekanslarıyla karşılaştırın.

Bu kayıt, normal salin ve bir serotonin çözeltisinde üçüncü rotadan kaydedilen aksiyon potansiyellerini gösterir. Normal salindeki aksiyon potansiyellerinin frekansını, az önce gösterildiği gibi frekansları ve serotonin ile karşılaştırın. Fırçalama, ateşleme frekansını taban çizgisine göre artırır.

Ayrıca gösterilen aktivite, serotoninin normal salin üzerinde ateşleme frekansını arttırmasıdır. Bu şekil, fırçalama ve serotonin birleştirildiğinde, ateşleme frekansında daha da büyük bir artış olduğunu göstermektedir. Dış potasyum konsantrasyonunun dinlenme zarı potansiyeli üzerindeki harici ve teorik olarak türetilmiş etkilerinin karşılaştırılması, iyonların zar potansiyeli üzerindeki etkisini gösterir.

Ayrıca, hem fazik hem de tonik kasların nöromüsküler kavşaklarında ntic yanıtlarını nasıl kaydedeceğinizi de gösterdik. Bu teknikler, temel kavramları ve fizyolojiyi öğretmek için araştırmacı öğrenci laboratuvarları için kullanılabilir. Bu laboratuvar egzersizinde elde edilen teknikler, diğer laboratuvar hazırlıklarının yanı sıra tıp ve sağlıkla ilgili fizyolojik uygulamalarla ilgili soruları yanıtlamak için kullanılabilir.