Fare Ortak Enfeksiyon Modelinde Bakteriyel Sayımı İçin Enfekte Dokuların İşlemi

Patojenik bir bakteri ve bir virüsle birlikte enfekte edilmiş bir fareyle başlayın.

Virüs, farenin üst solunum yolunun epitel tabakasına zarar verir ve bakterilerin nazofarenksten akciğerlere yayılmasını kolaylaştırır.

Toplanan fare akciğerlerini, fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) içeren bir kaba yerleştirin.

Akciğerleri küçük parçalara ayırın ve iyi karıştırın.

Akciğer dokusunun yarısını PBS içeren bir tüpe aktarın.

Akciğer dokusunu içeren tüpün içine sterilize edilmiş doku homojenizer probu yerleştirin.

Bakterileri PBS'ye salmak için dokuyu homojenize edin.

Homojenatı seyreldin ve seyreltmeleri besin açısından zengin bir agar tabağı üzerine yerleştirin.

Plakayı inkübe ederek bakteri kolonilerinin oluşmasını sağlayın.

Bu kolonileri, akciğer bakteri yükünü yansıtan akciğer bakteri yükünü niceliklendirmek için sayın.

Akciğer toplama için, diseksiyon makası kullanarak, açıkta kalan kaburga kafesinin yanlarını kesin ve kaburgaları nazikçe farenin başına doğru yukarı çekerek kalbi ortaya çıkarın. PBS ile önceden doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 kalibre bir iğneyi sağ ventriküle sokun ve yavaşça perfüze etmeye başlayın. Akciğerlerin ağartılmasını başarılı perfüzyonun göstergesi olarak arayın.

Akciğer dokusunu kırılmamak için yavaşça suyla çekin. Forsepsle kalbi kaldırın ve akciğerler ile kalbi ayıracak bir kesik yapın. Ayrıldıktan sonra, akciğerin tüm loblarını forsepsle alıp steril PBS içeren bir tabakta durulayın, böylece kalan kanı alın.

Petri kabında akciğeri küçük parçalara ayırın ve iyi karıştırın. Bakteriyel CFU veya viral PFU'yu belirlemek için akciğer karışımının yarısını çıkarın ve homojenleştirme için 0,5 mililitre PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak tabanlı 15 mililitrelik tüpe yerleştirin.

Toplanan dokuyu homojenleştirmek için, homojenizer probunu %70 etanole koyup homojenizeri %60 güçte 30 saniye boyunca çalıştırarak temizleyin. Bu adımı steril suda 10 saniye boyunca tekrarlayın.

Her dokuyu 1 dakika boyunca homojenleştirin. Bakteri numaralarının sayılması için, kan agar plakalarında plaka seri seyreltmeleri. Toplam CFU'yu hesaplamak için 10 mikrolitre ile plaka yapın ve her örnek için nihai hacmi mililitre cinsinden not edin. Gece boyunca 37 derece Celsius ve %5 karbondioksitte kuluçka yapın.