Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, sınırlı bir numune içinde tarafsız temsili verileri toplamak ve dokunun karmaşık üç boyutlu yapısını hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu, önce kimyasal olarak boyanmış pankreas kesitleri olan immünohisto'nun sanal dilimlerinin yakalanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra imaj J yazılımındaki IHC sanal dilim makrosu ile sanal dilimler nicelendirilir ve veriler Mathematica için yazılmış scriptler ile analiz edilir.

Daha sonra, Image J kullanılarak sanal dilimlerin 3D rekonstrüksiyonu gerçekleştirilir.Prosedürün son adımı, slayt kitabı yazılımını kullanarak tek tek adacık görüntülerinden oluşan bir yığını yakalamak ve görüntü yığınlarını stereo araştırmacı kullanarak üç boyutlu olarak manuel olarak haritalamaktır. Sonuç olarak, her bir kuşgözü hücresi için 3D koordinatlara sahip hassas kuşgözü mimarisi, 3D görüntüleme ve manuel haritalamanın birleşik bir yöntemiyle elde edilebilir. Bu yöntem, obezite ve diyabet çalışmaları alanında, fizyolojik ve fizyolojik koşulların yolunun pankreası, beta hücre kütlesini, kuşgözü dağılımını ve mimariyi nasıl etkilediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, obezite ve diabetes Melitis'in tanı veya tedavisine kadar uzanır, çünkü beta hücre kütlesindeki değişikliklerin daha iyi anlaşılması, terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ve değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada tarif edilen yöntemler özellikle pankreasın dinamik immünohistokimyasal analizi hakkında bilgi verse de, bir dizi başka organizma ve dokuya da uygulanabilir. Bilgisayar destekli analiz adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Bu kadar büyük veri kümelerini iki ve üç boyutta analiz etmenin karmaşıklığı nedeniyle. Bu prosedüre, bir floresan mikroskobu tutucusuna immünohisto, kimyasal olarak boyanmış pankreasın tüm bir bölümünü tutan temiz bir slayt yerleştirerek başlayın. Stereo araştırmacı yazılımını açın ve edinime tıklayarak örneği görselleştirin.

Ve sonra canlı görüntü. Floresan yoğunluğunu gösteren video histogram penceresini kullanarak her kanal için pozlama düzeylerini belirleyin. Bu örnekte, DAP P için ikinci kanal kullanılmıştır: GFP için üçüncü kanal, RFP için dördüncü kanal, sci beş için beşinci kanal ve SCI yedi için altıncı kanal kullanılmıştır.

Kamera ayarları penceresini kullanarak, pozlama seviyesini floresan yoğunluğu azalacak şekilde ayarlayın. Video histogramının sağ ucunda, görüntü mikroskop odak tekerleği ile odaklanabilir. Sanal bir dilim oluşturmadan önce, numuneden uzakta bir noktada ekrana tıklayarak numuneyi konturlayın, bu da bir referans noktasını işaretleyecektir.

Ardından, kontur tamamlandığında numunenin ana hatlarının etrafına tıklayın. Kontur kapatıldıktan sonra başlangıç ve bitiş noktalarını birleştirmek için sağ tıklayın ve konturu kapat'ı seçin, alım'ı seçerek örnek için sanal bir dilim yakalayın ve ardından sanal dilim alın. Sanal dilim penceresi seçenekleri açıldığında, manuel olarak devre dışı bırakmanın yanı sıra yüksek hızlı edinmeyi seçin.

Manuel'in yanındaki kutunun işaretini kaldırarak odaklama. Dosyayı kaydedin. Sağ tıklayıp odak site listesine ekle'yi seçerek prefo'yu kalibre edin.

Sanal dilim önizlemesinde birkaç rastgele bölümü el ile odaklama Birkaç siteye odaklanıldığında, sağ tıklayıp seçerek sanal dilimi başlatın. Prefo ile sanal dilimi başlatın İlk örnek için sanal dilim tamamlandıktan sonra sonraki kanala geçin ve pozlamayı buna göre ayarlayın. Bu prosedür, deliklerin nicelleştirilmesini gerçekleştirmek için her kanal için tekrarlanır, görüntüleri önce yüklenen görüntüleri analiz için hazırlayan ve ardından hücresel bileşim gibi kuşgözlerinin özelliklerini ölçen I-H-C-V-S adlı bir görüntü J makrosu kullanarak işler.

I-H-C-V-S makroları, yığını ilgili renk kanallarına böler. Resimde J, her görüntüyü sekiz bitlik siyah beyaz bir maskeye dönüştürür. Otomatik yoğunluktan sonra, eşikleme ve ayrı kanal görüntülerini aritmetik olarak bir araya getirerek bileşik bir maskeye ekler.

Görüntü J'nin kompozit görüntü üzerindeki yerleşik parçacık analizi, daha sonra bir beta hücresinden daha küçük parçacıkları hariç tutarken ilgi alanlarını veya ROI'leri belirleyecektir. ROI'lerin nicelleştirilmesi. Görüntü J'yi kullanmak, hücre parametrelerinin bir elektronik tablosunu oluşturur.

Toplanan sonuçları bir Excel elektronik tablosuna kaydedin. Her bir delik için alan çevre daireselliği, fer çapı ve kuşgözü merkezi gibi verileri, görüntüde etiketlenmiş karşılık gelen numaralarla birlikte depolama. Bu parametrelerin hesaplamalı analizi, yazılı protokolde açıklandığı gibi gerçekleştirilebilir: Kuşgözü dağılımı ve frekans analizi dahil olmak üzere bilgileri ortaya çıkarmak için, dizindeki tüm JP iki görüntüsünü TIF dosyalarına dönüştüren bir komut dosyası çalıştırarak sanal dilimlerin 3B yeniden yapılandırmasını gerçekleştirin, bu da sanal dilimlerden üç boyutlu yığınların oluşturulmasında ve nicelleştirilmesinde kullanılan formattır.

Burada I MJ two two tiff adında bir script kullanılmıştır. Komut dosyasını, JP iki görüntüsünü içeren dizine kopyalayın. Konsola dot slash I JP two two TIFF yazıp enter tuşuna basarak komut dosyasını Linux kabuğuyla çalıştırın.

Yakalanan tüm görüntüler JP ikiden TIFF dosyalarına dönüştürüldüğünde, görüntü J'de analiz için kullanılmaya hazırdırlar. ve ardından kanalları birleştirin. Tüm örnekler tek bir görüntü olarak birleştirildiğinde, örneklerin her biri için bu işlemi tekrarlayın. Poligon seçimleri aracıyla istenmeyen bölgeleri seçerek görüntüleri temizleyin.

Düzenle'yi seçerek doldurun ve ardından doldurun. Her görüntüyü bir RGB renkli görüntüye dönüştürün. Son olarak, görüntülerden bir yığın oluşturun ve ardından yığın reg eklentisi ile daha fazla hizalanabilirler.

Sonuç olarak, kanalları birleştirmek ve görüntüleri birleştirmek, tüm pankreastaki tüm deliklerin 3D montajını oluşturur. Görüntü yığınlarını toplamak için, tüm montaj pankreas deliklerini mikroskop altına yerleştirin. Suya daldırma objektif lensi kullanıyorsanız su uygulayın.

Slayt defteri yazılımını açın, odak kontrolü penceresinde control plus shift artı E tuşlarına basarak yakalama ve netleme kontrolüne erişin. Kuşgözü boyutuna bağlı olarak hedefi 20 kez veya 40 kez ayarlayın. Halkaları bulmak için mikroskop göz merceğini kullanmak için bölmeyi iki kez ayarlayın ve filtre setini kullanıcı birine ayarlayın.

Odak kontrol penceresinde, emisyon seçimi %100 olarak ayarlanmalıdır Nötr yoğunluktaki gözler tek tıklama GFP ey'e ayarlanmalı ve ardından örneği slayt kitabında görselleştirmek için zemini açmalı, odak kontrol penceresine dönmeli ve düzeltmek için filtre ayarını değiştirmelidir. Ardından G-F-P-D-S'ye tıklayın. Kuşgözü kameradaki deliği mümkün olduğunca bir pencerede ortalamak için joystick'i kullanın.

Deliklerin merkezine yakın bir yerde, hücrelerin kolayca ayırt edilebileceği bir derinliğe odaklanın. Odak kontrolü penceresinde zab'ı seçin. Özelliklerin net bir şekilde ayırt edilebileceği deliğin en üst derinliğine kaydırmak için kapsam kontrolünü kullanın ve üstü ayarla'yı tıklayın.

Deliğin en altına kaydırın ve ayarla'ya tıklayın. Alttan tıklayın git. Yakalama penceresindeki referans noktasına geri dönmek için gelişmiş'e ve ardından kanal moduna alternatif'e tıklayın.

Pencerenin sağ tarafında bin faktörünü iki kez ve yakalama türünü 3D olarak ayarlayın, üst ve alt konumları kullan'ı tıklayın ve yakalamadan sonra merkez ses seviyesine dönün. Adım boyutunu üç olarak ayarlayın. Filtre ayarını, filtre kümesi kutusunun altında kalacak şekilde ayarlayın.

DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U ve SCI beş DSU'yu seçin. Her biri için, pozlamayı ayarla altında en iyisini bul'u tıklayın. Ardından, seçilen pozlamanın uygun olduğundan emin olmak için test et'e tıklayın.

Yakalamayı başlatmak için başlat'a tıklayın. Yakalama tamamlandığında, seviyeleri gerektiği gibi ayarlayın ve RFP için görüntülenen rengi beyaz olarak değiştirin. Slaydı kaydedin ve dışa aktarma TIFF serisini görüntülemeye gidin.

Sonunda bir tire ile slaydın adını yazın ve kaydedin. Düzinelerce ayrı TIF dosyası oluşturulur, bu nedenle her bir kuşgözü görüntü yığınını ayrı bir klasörde tutmak yararlı olabilir. Görüntü yığınlarını eşlemek için stereo araştırmacı yazılımını açın.

Görüntü ölçekleme menüsünde görüntü yığınlarını açarak görüntüyü görselleştirin. İki kez bükülmeyi düzeltmek için görüntüler arasındaki mesafeyi üç mikrona ayarlayın. Slayt kitabında, X ve Y ölçeklendirmesini geçersiz kıl'ı seçin ve x ve Y ölçeklendirme kaynağı için belirtilen bir değeri kullanın.

Hem X hem de Y merkezi için 0.65 girin ve yakınlaştırma düğmesine tıklayarak görüntüyü yakınlaştırın ve ardından makro penceresindeki ilgilenilen ilisin ortasında en az bir hücre pazarlayın. Uygun işaretçiyi kullanarak, beta hücreleri yeşil görünecektir. Alfa hücreleri kırmızı görünecek ve delta hücreleri beyaz görünecektir.

Çekirdek hücrelerinin ortasındaki hücreleri işaretleyin, bu örnek DPI ile boyanmışsa mavi görünecek olan beta hücrelerini işaretlemek için İşaretleyici iki'yi kullanın. Alfa hücrelerini işaretlemek için beşi işaretleyin ve delta hücrelerini işaretlemek için altıyı işaretleyin. En az bir hücre işaretlendikten sonra, üst menüdeki simgeyi kullanarak ortogonal görünümü görüntüleyin, Z filtresini ve simetrik'i kontrol edin.

Aralık 15.00 olarak ayarlanmalıdır. 0.0'dan başlayarak, Z.Fare tekerleğini kullanarak delikler arasında kaydırın ve her hücreyi uygun işaretleyici ile işaretleyin, her hücreyi derinliğinin merkezinde yalnızca bir kez işaretleyin. Z düzeylerinin her birini işaretlemeyi bitirdikten sonra, Z filtresi onay kutusunun işareti kaldırılabilir.

Bu, tüm Z seviyelerindeki tüm işaretçileri gösterecektir. Her hücre işaretlendiğinde, dosyayı bir DAT dosyası olarak kaydedin. Ardından dosya dışa aktarma izlemesine gidin.

İzlemeyi bir TXT dosyası olarak kaydedin. Son olarak, yeni halkaları eşlemeye çalışmadan önce çalışma alanını temizlemek için yeni veri dosyasına tıklayın. İmmünohistokimyasal boyanmış bir pankreas örneğinden sanal dilimlerin hazırlanması, tüm pankreastaki alfa, beta ve delta endokrin hücrelerinin birlikte incelenmesine olanak tanır, çünkü insülin için adacıklar için immünohistokimyasal boyanma yeşil, glukagon kırmızı, somatostatin beyaz ve dap mavi renkte görülebilir.

Görüntüler daha sonra otomatik eşiklemeden sonra sekiz bitlik maskeye dönüştürülür. Burada birleştirme bileşik görüntüsü gösterilmektedir. Bununla birlikte, sanal dilim kullanılarak kuşgözü dağıtımı, ayrı kanallarda bireysel analize de olanak tanır.

Burada, delta hücrelerini, beta hücrelerini ve alfa hücrelerini ortaya çıkarmak için her kanalın görünümleri gösterilir. Kompozit maske üzerinde gerçekleştirilen partikül analizi, her bir kuşgözü yapısının mavi renkte numaralandırıldığını ve vurgulandığını gösterir. Kompozit maskelerin partikül analizi, kompozit maske üzerindeki numaralı etiketlere karşılık gelen kimliklere sahip olan, Islas alanı çevre daireselliği ve algılanan her bir delik için çeşitli çap gibi parametreleri içeren bir veri tablosu olarak çıktısı alınır.

Bu görüntülerin büyük ölçekli analizi, toplam kuşgözü sayısı ve boyut dağılımı histogramlarının üretilmesinin yanı sıra alfa, beta ve delta hücre alanlarının ayrıntılı karşılaştırmalarıyla sonuçlanır. Kuşgözü haritalaması ve hücresel bileşim ve mimarinin matematiksel analizi, stereo araştırmacıya yüklenen bir insan kuşgözü görüntüsünün 3D yeniden yapılandırılmış bir yığınından tek bir odak düzlemini ortaya çıkarabilir. Burada beta hücreleri yeşil alfa hücrelerinde, kırmızı delta hücreleri beyaz renkte ve çekirdekler mavi renktedir.

Farklı deliklerin yakalanmasını takiben, alfa, beta ve delta hücreleri burada çeşitli deniz düzlemlerinde işaretlenir, floresan görüntüler ve ilgili harita verileri 10 mikron aralıklarla üç farklı odak düzlemi için gösterilir. Alfa, beta ve delta hücreleri çeşitli düzlemlerde işaretlendikten sonra, kuşgözü 3D olarak görselleştirilebilir. Burada, kuşgözü eşleme ile elde edilen koordinatlara dayalı olarak çeyrek dilimli deliğin 3B rekonstrüksiyonu gösterilmektedir.

Ayrıca, eşlenmiş halkaların otomatik matematiksel analizi, hücresel bileşimi ve mimariyi görüntüleyebilir. Burada, tek bir hücre popülasyonundaki iki hücre arasındaki hücre hücre mesafelerinin nispi frekansı gösterilmektedir. Ayrıca, iki farklı hücre popülasyonu arasındaki hücre hücresi mesafelerinin nispi frekansı da gösterilmiştir.

Ayrıca, alfadan alfaya, betadan betaya ve deltadan deltaya hücreler için hücreden hücreye mesafe dağılımlarının kümülatif olasılıkları da gösterilmiştir. Karşılık gelen KS mesafelerini elde etmek için bu olasılıklar üzerinde cole OV smirnov veya KS testi yapılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm doku bölümünün büyük ölçekli görüntülenmesi ve analizi dört saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bir doku bloğunun 3D rekonstrüksiyonu 30 dakika içinde yapılabilir. Son olarak, 3D görüntüleme ve manuel haritalama, düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, bölümlerin yüksek kaliteli bir immünohistokimyasal boyaması ile başlamak önemlidir.

Sonraki analizin doğruluğu tamamen ham verilere bağlı olacaktır. Ayrıca, bilgisayarlarınızın bu kadar büyük ölçekli analizleri işlemek için en az sekiz gigabayt RAM'e sahip olduğundan emin olun. Bu teknik, sadece obezite ve diyabet alanında değil, standart patolojik analizi kullanan diğer birçok alanda da araştırmacıların yolunu açtı.

Numunelerin mevcudiyeti sınırlı olduğunda özellikle yararlı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, standart teknikler kullanarak sınırlı bir örneklem boyutu içinde tarafsız temsili verilerin nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız. Yalnızca belirli bir bölgeyi seçmek, pankreas kuşgözü dağılımı çalışmamızı kullanarak gösterdiğimiz gibi, resmin tamamını temsil etmeyebilir.