Name: Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: Keşfedin yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi ile pankreas β-hücre kütlesi dağılımını görüntüleme yöntemini. Hesaplamalı araçlar veri kalitesini artırır ve diyabet araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr P. Lindström ob / ob farelere sağlamak için kabul edilmektedir. J. Lehtonen düzenleme ile yardım için video prodüksiyon ve J. Gilbert yardım için kabul edilmektedir. (JS ve: Bu çalışma Diyabet Araştırma Enstitüsü Vakfı (AP), Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (AP ve UA), Avrupa Komisyonu (. CP-IP 228933-2 FP-7, hayır Hibe anlaşması) hibe tarafından desteklenen UA), Kempe Vakıflar, Umea Üniversitesi ve UA ile İsveç araştırma konseyi

1. Numune Hazırlama ve Tarama 1.1 Numune hazırlama 7. Daha önce tarif edildiği gibi Aşağıdaki prosedür, temelde gerçekleştirilir. <ol><li> Pankreas Harvest. Proteolitik degradasyona önlemek için buz gibi soğuk PBS kullanın. </li><li> 2-3 saat için buz üzerinde PBS içinde% 4 PFA doku düzeltildi. Loblar fiksasyon sırasında &quot;yayılmış&quot; olduğundan emin olun. Bu rekonstrüksiyon sonrası anatomik yerlerinden belirlenmesini kolaylaştıracaktır. </li><li> 30 dakika boyunca ilave PBS içinde yıkanır. </li><li> Metanol içinde kademeli olarak pankreas (33,% 66,% 100), 15 dakika / adım kurutmak. Bu (adım 5) bleaching sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirir ve (bkz: adım 7) donma-çözülme sırasında hücre tahribatını önler. </li><li> H2O: 2: DMSO endojen doku floresan gidermek için 24 saat oda sıcaklığında bir 02:01:03 oranında tampon ağartma taze hazırlanmış MeOH içinde doku inkübe edin. Yeni bleachi daha büyük örnekler, değişim içinBaşka bir 24 saat için ng tampon ve inkübe. </li><li> ON, aşırı MeOH içinde yıkayın. </li><li> -80 En az 5 döngü için donma-çözülme ° C - RT antikor penetrasyon kolaylaştırmak için. </li><li> TBST (33,% 66,% 100), 15 dak / adıma geri adım adım rehidrate. </li><li> Oda sıcaklığında 12-24 saat boyunca% 10 serum (tercihen ikincil antikor oluşturulduğu aynı türden),% 5 DMSO ve% 0.01 Naaz ile TBST içinde Blok </li><li> RT, 48 saat süreyle tampon engelleme primer antikorlar ile inkübe, daha geniş örneklem (Burada kullanılan antikorların reaktiflerin tabloda listelenmiştir) için 72 saat kadar uzanır. </li><li> ON, aşırı TBST yıkayın. </li><li> 48 saat boyunca floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe, RT, büyük numuneler için 72 saat kadar uzanır. </li><li> ON, aşırı TBST yıkayın. </li></ol> 1.2 Aşağıdaki yordam (bkz. Şekil 7 agaroz örneklem mount ve özel yapılmış numune tutucu takmanız açıklamaktadır) Tarama OPT öncesinde. <ol><li> Hörnblad ve ark 3 Şekil 3A&#39;ya uygun olarak, dalak duodenum ve mide loblar ayırın. Loblar arasındaki ilişki ileri Hörnblad ark 11&#39;de açıklanmıştır. </li><li> % 1.5 (w / v) dH 2 O, filtre, düşük erime sıcaklığına agaroz hazırlayın, 37 soğumasını bekleyin ° C ve deterjan aşındırmak ve buz üzerinde agaroz-gömmeden önce kabarcıkları dH 2 O doku durulayın. </li><li> Senin örnek parça bir agaroz bloğu kesip ve numune ve agaroz tabanı arasında bir ~ 1 cm boşluk bırakın. Işık saçılması azaltmak için agaroz blok keskin kenarları (≤ 90 °) kesin. </li><li> Her bir zaman adım arasında denge sağlaması için izin MeOH (33, 66%,% 100) kademeli olarak örnek kurutmak. Örnek lavabolar zaman dengelenmiş olarak kabul edilir. </li><li> Benzil Benz: benzil alkol 1:2 çözelti içinde örnek temizlemeOATE (Babb) şeffaf hale gelinceye kadar. Ek 12 saat için Exchange Babb çözümü ve inkübe. </li><li> Numune tutucuya temizlenmiş numune konumlandırın ve tutucu flanş delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk ile 2 iğneler takarak sabitleyin. </li><li> Babb temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir küvet içine daldırın ve tarayıcı içinde örnek yerleştirin. Pancreata bir dizi karşılaştırarak aynı büyütme her tarama için kullanılmalıdır. Büyütme serisinin en büyük numune için optimize edilmelidir. </li></ol> AR at örneğinin 1.3 Konumlandırma Aşağıdaki protokolü tam COM-AR algoritması kullanılarak bir örnek yerleştirmek için prosedürü açıklar. ROI tüm numune bulunduğunda bu prosedür geçerlidir. Algoritmalar ayrıntılı açıklamaları için, Cheddad ark 2 bakın. <ol><li> Bot için iki pozisyonda örnek görüntülerini Edinmeh anatomisi ve sinyal kanalları. En büyük projeksiyon alanı, ve 90 ° (Z ekseni ile ilişkili olan) konum 2 de sergileyen 0 ° (X-ekseni ile ilişkili), at Pozisyon 1. Biz anatomi görselleştirmek için GFP kanalı kullanıyor. </li><li> Eşik ROI&#39;ye anatomi görüntüleri beklenti-maksimizasyonu (EM) algoritması uygulayın. </li><li> 0 ° ve 90 ° projeksiyonları için 2. adımda elde ikili görüntülerin COM noktaları (x-koordinatları) hesaplayın. </li><li> 0 ° ve sinyal kanalı 90 ° görüntüleri Adım 3&#39;te hesaplanan tanımlanan COM noktadan geçen dikey bir çizgi Superimpose. </li><li> Referanslar View Saha merkez çizgisinin örnek bulundu COM puan geçer böylece örnek hareket olarak 4. adımda elde edilen görüntüleri kullanın. </li></ol> 1.4 Tarama <ol><li> Satürasyonu olmadan mümkün gürültü oranı en yüksek sinyal elde etmek için etki süreleri ayarlamaprojeksiyon görüntüleri ting herhangi bir yerlerde. Taranacak tüm kanallar için tekrarlayın. </li><li> Taranacak ilk floresans kanal için filtre ayarı seçin. Kısa λ floroforlar gelen salma uzun λ florofor ile tahrik ve böylece resim ağartma neden olabilir. Bu olasılığı en aza indirmek için, ilk uzun uyarma λ ile fluorofor tarayın. </li><li> Örnek aydınlatmak ve her kanal için dikey eksen boyunca örnek dönen, 360 ° &#39;den fazla floresan sinyal toplamak için deklanşör açın. NUR-OPT kurulumu için kullanılan adım açısı 0,9 ° ve Bioptonics 3001 tarayıcı 0,45 ° için. </li><li> Sonraki kanal için uygun filtreyi seçin ve yukarıdaki işlemleri. </li></ol> 2. Hesaplamalı İşleme ve Yeniden Yapılanma 2.1 Post-edinimi kayma algılama ve düzeltme (A-değeri ayarlama) Projeksiyon tomografide, genel olarak gerekliöncesinde yeniden dönme ekseni boyunca ince ayar görüntülerin konumuna projeksiyonlarına bir post-hizalama değerini atamak. Bununla birlikte, optik eksen yönünde kamera açısını küçük bir sapma numune uzunluğu boyunca düzgün olmayan A-değerlerine neden olabilir ve böylece geometrik bozulma meydana getirir. Bu tür bozulmayı önlemek için, tüm numune boyunca doğru ve birleşik sonrası uyum değeri (A-değeri) bulmak için bir hesaplama yöntemi 2 uygulanabilir. <ol><li> 8 piksel yüksekliğinde blok içine 0 azından belirli bir sinyal projeksiyon ° ve 180 ° bölmek ve her blok arasındaki x-ekseni boyunca kayması (A-değeri) hesaplamak için dönüşümü bir ayrık Fourier kullanın. </li><li> Numune uzunluğu boyunca x-ekseni-shift eğimi tanımlayan açısı θ &#39;, hesaplamak yardım etmek ve bir dönme merkez noktası bulmak için doğrusal en küçük kareler regresyon uygulayın. </li><li> Tüm Proje çevirerek tarama sırasında uzaklaşmaları için düzeltindönme merkez noktası etrafında ctions θ &#39;/ 2. </li></ol> 2.2 Kontrast sınırlı adaptif histogram eşitleme (CLAHE) Rekonstrüksiyon ve / veya kantitatif değerlendirmeler için segmentasyon sırasında &quot;üzerinden eşiklenir&quot; için risk altındadırlar çok zayıf sinyaller, sergilenmesi nesneleri (adacık) tespiti ve segmentasyonu kolaylaştırmak için, bir CLAHE algoritma projeksiyon görüntüleri uygulanabilir. CLAHE işlem iki ana yoğunluk dönüşümleri ile gerçekleştirilir: <ol><li> Lokal kontrast tahmin ve projeksiyon görüntü örtüşmeyen blok içinde dengelenir. </li><li> Şiddetleri sonra bilinear enterpolasyon yoluyla bloklar arasındaki sınır bölgelerinde normalize edilmiştir. </li></ol> Adı kontrast sınırlı görüntüde doyurarak piksel önlemek için ayarlanır klibi limiti ifade eder. Bu protokolde, MATLAB yerleşik işlevi &quot;adapthisteq&quot; varsayılan c ile kullanılan ve uygulanan<html> 0,01 dudak sınırı ve 256 boyutunda döşeme. Not, optimum döşeme boyutunu ampirik olarak test edilmesi ve analiz örneğinin bağlı olarak değişebilir ihtiyacı var. Algoritması ve örnekler ile ilgili daha fazla detay Hörnblad ve ark 3 bulunabilir. Not! Yukarıdaki hesaplama işlem adımlarını standart algoritmalar üzerine inşa edilir ve MATLAB (Mathworks) yürütülür (COM-AR, A-Değer tuning ve CLAHE dahil 1,3-2,2 bakınız). 2.3 tomografi yapılandırma ve iso-yüzey işleme <ol><li> Süzülmüş bir arka projeksiyon algoritması kullanarak, düzeltilmiş ve normalleştirilmiş görüntüler şimdi birleşik kayma kompanzasyonu ve dinamik aralık optimizasyonu için asgari gerekliliktir yeniden inşa edilebilir. Bu protokol, tüm yeniden inşa NRecon yazılımı (Skyscan), sürüm 1.6.8 (mevcut süzülmüş geri projeksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Paralel ışın geometrisinde görüntüleme kurulum uygulanan sürece Not resimli bir nesnenin büyütme objektifin odak noktası uzaklığı bağlıdır. Bu nedenle, NRecon yazılım için bir projeksiyon dataset alırken bunun beraberindeki kaynak mesafesi (mm) ve tarayıcı dönme yönünü (saat yönünün tersine girdi &quot;cc&quot; için ve saat girişi &quot;cw&quot; için) doğru nesne dahil etmek önemlidir yeniden yapılanma sırasında koni ışın kaynaklı eserler önlemek için, günlük dosyası. </li><li> Elde edilen sanal bölümler yığınını görselleştirmek ve ölçmek için, Imaris veya Volocity gibi uygun görüntü işleme yazılımı kullanarak 3D iso-yüzeyler oluşturur. </li></ol> Mürin adacık izolasyonu ve transplantasyonu yorumlanan protokol çerçevesinde Diyabet Araştırma Enstitüsü&#39;nün Preklinik Hücre İşleme ve Translasyonel Model Çekirdek gerçekleştirilen ve Miam Üniversitesi tarafından onaylanmışi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu. Hayvanlar üzerinde yapılan araştırmalar için etik kurul, Kuzey İsveç, hayvanları kapsayan diğer tüm deneyler onayladı.

<ol><li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li>
<li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li>
<li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+imaging+islets%3A+recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li>
<li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753(2011).</li>
<li>Lindström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+%28ob%2Fob+Mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+JOURNAL%22%5BJournal%5D)">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

OPT görüntüleme için anlatılan teknikleri fare pankreas hacmi boyunca mekansal ve niceliksel parametreler ekstraksiyon sağlar. Mezoskopik görüntüleme, bu tür için ulaşılabilir çözünürlük sınırlamaları nedeniyle belirtmek gerekir ki en görüntüleme yöntemlerinin yanı, daha büyük numune düşük çözünürlük (daha yüksek çözünürlüklü CCD kullanımı OPT tarama çözünürlüğünü artırmak gerekir rağmen) . Dolayısıyla, sağlam pankreas fare lobların değerlendirilmesi için, şu anda teknik olmasına rağmen yakın (yaklaşık 15-20 mikron) 7 Tek hücre çözümü sağlamaz. Yine, fare pankreas BCM dağılımının çıkarılması için protokollerinin tam morfometri 3,13 sayma örneğin noktası elde eşleşen fazla Unutulmamalıdır ki veri sağladıklarını CLAHE protokolün uygulanması önemli ölçüde daha fazla adacıktan tespiti için izin verir ancak bu adacıklar genellikle daha küçük ve katkısı yokte büyük ölçüde tüm β-hücre hacmine. Katılan immünohistokimyasal protokolleri (en fazla iki hafta) nispeten uzundur, ancak numune hazırlama için zaman gerçek eller kısa ve dolayısıyla tekniği de hayvanların 9 büyük kohort çalışması için uygun olmasıdır. Heterojen dağılımları potansiyel soruşturma için bir odak noktası ise, bakım fiksasyon ilgilendiren ve pankreatik doku olumsuz bir şekilde sabit hale gelir ve düz (&quot;yaymak&quot; olduğunu önlemek için montaj adımları alınması gerektiği vurgulanmalıdır doku) bağlama bu değerlendirmede kolaylaştırmak için çaba olmalıdır. OPT gerçekleştirerek önemli bir konu da örnek COM dönme ekseni sabit ve tarama işlemi sırasında, yatay veya dikey, hareket etmediğinden olmasıdır. Bu nedenle attachi için istikrarlı mekanik kurulum ve iyi işleyen bir sisteme sahip olmak esastırng örnek. Biz yeni bir bağlama (Şekil 7) oluşturarak bu sorunu çözdü. Paralel geometri bizim NUR-OPT veya sırt ve kaydedilen projeksiyon görüntüleri periferik nesnelerin önünde pozisyon arasındaki dikey bir kayma olduğu tespit edildi Bioptonics 3001 tarayıcı için doğru değildi. (2.3.1 bakınız) ilgili tarayıcının log dosyasına kaynak mesafe nesnesi ayarlayarak önemli ölçüde bizim veri kalitesini artırmak olabilir ve belirli bir öneme sahiptir projeksiyon görüntüleri en uzak kenarlarında geometrik bozulmaları düzeltmek zaman Daha büyük numuneler değerlendirilmesi. Geçerli protokol, biz üç farklı belirli kanallar ve sağlam pankreas hazırlıkları değerlendirmelerinde bir &quot;anatomisi&quot; kanal görüntülenmesine izin filtre setleri bir öneri sunmak. Açıkçası bu ayarları floresan tüm formları olduğu gibi, daha iyi olmasına rağmen, belirli bir çalışma için kullanılan florokromlar uygun modüle olabiliryüzde mikroskopi, sinyal sızdırma-yoluyla potansiyel tehlike dikkatle değerlendirilmelidir. 750 nm ve üzeri heyecanlıyız florokromlar ile insülin etiketli adacık çalışma henüz bizim set up kullandığı metal halide lamba kullanarak bize mümkün olmamıştır. Bu alternatif ışık kaynağının (örneğin diyot lazerler) ile birlikte uygun dalga boylarında da yüksek kuantum verimliliği sahip bir kamera daha NIR-OPT potansiyelini artırmak ve daha yüksek dalga boylarında görüntüleme için izin verebilecek mümkündür. OPT görüntüleme mm-cm ölçekte biyomedikal numune mekansal ve niceliksel olarak değerlendirilmesi için oldukça çok yönlü bir tekniktir. Burada sunulan protokol pankreas / diyabet araştırma amacı için geliştirilmiş olmasına rağmen, diğer türler, örnek tipine ve belirteçleri üzerine araştırma çevirmek mümkün olmalıdır. NUR-OPT görüntüleme f, sağlam pankreas hazırlıkları birkaç farklı kanallar görselleştirmek için potansiyel olarakurther sürece bu kontrast ajanlar da OPT tarafından algılanamaz bir fluorofor taşımak için tasarlanmış olabilir gibi diğer görüntüleme yöntemleri ile non-invaziv değerlendirme amaçlı kontrast maddelerin alımını özgüllüğünü değerlendirmek için bir araç olarak bir potansiyele sahiptir.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Β-üreten hücrelerin insülin kan şekeri dengesini kontrol etmek için vücudun yeteneğini için anahtardır. Bu nedenle, pankreas BCM dağıtım değerlendirmeler klinik öncesi diyabet araştırma birçok alanda zorunludur. Örneğin terapötik rejimlerin değerlendirmelerde, hastalık için kemirgen modellerinde endokrin hücre farklılaşması veya diyabet etiyolojisi çalışmaları hedeflenen gen ablasyon etkisi sık sık bu tür analizler bağlıdır. Geleneksel olarak, bu tür değerlendirmeler boyut ve pankreas kompleks anatomik anayasasını dolayı yapmak zor olan zaman alıcı stereolojik yaklaşımlar yararlanmıştır. Şu anda en yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlar (genellikle optik), kemirgenler tüm pankreas görüntüleme için yeterli penetrasyon derinliği vermeyin. Tersine, onların penetrasyon derinliği (genellikle nükleer) ile sınırlı değildir görüntüleme yaklaşımları tam BCM dağılımı gidermek için yoksul kararlılık sağlamak ve engellenmektedir4,5 yeterli kontrast maddelerin eksikliği. Optik projeksiyon tomografi cm çaplı 6 mm biyomedikal numunelerin yüksek çözünürlüklü değerlendirmeler sağlayan bir 3D görüntüleme yöntemidir. Bu vesile ile, mekansal konumu ve Langerhans adacıkları ifade bireyin insülin hacmi hakkında bilgi normal ve diyabetik farelerde 3,7-10 yılında pankreas hacmi boyunca elde edilebilir. Bu çalışmanın amacı, daha pankreatik β-hücrelerinin değerlendirilmesi için bu tekniğin kapasitesini artırmak için; diğer dokular, diğer pankreatik bileşenlerin (örneğin hücre tipleri infiltratif gibi) onların ilişkisi içine ve büyük aşılı kendi endojen dağılımı, önceden mümkün olandan pankreas hazırlıkları. Yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi (NUR-OPT) kurulumu Protokoller, yukarı Sharpe tarafından tanımlanan orijinal kümesine dayanan OPT tarayıcının altında ise <earalığında yakın kızılötesi görüntüleme için uyarlanmış m&gt; 1 ve diğerleri, açıklanan ve kullanılmaktadır. Fare pankreas (BCM gibi) tek bir kanal değerlendirilmesi için, SkyScan 3001 (Bioptonics) tarayıcı kullanılabilir. 650nm Yukarıdaki dalga boylarında bir civa ark lambası daha yüksek uyarma enerjisi sağlayan metal halide lamba, eksitasyon ışığı sağlar. Işık sıvı ışık kılavuzu ile aktarılır. Florokromlar ve NIR floresan görüntüleme ve kanal ayırma için bant geçiş filtresi yararlı bir kombinasyon Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Yayılan ışık NUR spektrumunda yüksek kuantum verimliliği ile, arka aydınlatmalı CCD kamera ile tespit edilir. OPT tarama bir kamerayı kontrol LabView platformu ve step motor kullanılarak otomatik olarak yapılır. Bozulmamış sıçan pancreata, korunmuş bir gümüş kaplı ayna ve bir küvet büyük boyutu olarak örnek desteklemek için kullanılır. Son olarak, bir numune tutucu istenmeyen dikey movemen ortadan kaldırırTarama sırasında numunenin ts tasarlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> % 30 H2O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Benzil Alkol </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzil Benzoat </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük meltingpoint agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehid (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-ASMA-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Tavşan anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Guinea Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> Primer antikor </td></tr><tr><td> Eşek karşıtı GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti Rb-DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11076 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21076 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> Keçi anti GP-Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21039 </td><td> İkincil antikor </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Tarayıcı </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stereomikroskopta </td></tr><tr><td> Leica Amaç 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adaptörü 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> Halide EL6000 Metal </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Sıvı Işık Kılavuzu </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52.5 mm </td></tr><tr><td> Ayna </td><td> Edmund Optik </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Teknoloji </td><td> DU934N-BV </td><td> Arka aydınlatmalı CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 41021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 41022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Teknoloji </td><td> 49037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sefaroz boncukları </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose Fast Flow 4 </td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Sodyum azid 0.1 M çözelti </td></tr></tbody></table>

diyabet araştırma β-hücre kütle dağılımı değerlendirmelerinde kızılötesi optik projeksiyon tomografi civarında

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Yakın kızılötesi (NIR) spektrum görüntüleme yeteneğini eklemek için OPT adapte olarak, biz burada böyle sıçan pankreas pankreas dokusu görüntüsü daha büyük cisimlerin imkanı göstermek ve kanal sayısı (hücre tipi) olabilir artırmak için tek bir örnek olarak incelenecektir. ; Yazı için 2 / geliştirilmiş algoritmalar bir örneğinin (bizim durumumuzda pankreas) dönme ekseninde kütle merkezi (COM) (AR) 2 1 / doğru konumlandırma: Biz daha verin hesaplama araçlarını bir dizi uygulama tarif -hizalama tomografik geriçatma 2 ve 3 / OPT tabanlı BCM tespitler 3 gürültü oranları sinyal artırmak için yoğunluğu dengeleme için bir protokol sırasında geometrik bozulmaları önler ayarlama. Ayrıca, görüntü edinimi sırasında numune kasıtsız hareketleri riskini en aza indiren bir numune tutucu açıklar. Birlikte, bu protokolleri BCM dağıtım ve oth değerlendirmelerini sağlamaker özellikleri, Langerhans adacıkları bireyin düzeyine çözünürlüğe sahip, sağlam pancreata veya diğer organlara (adacık nakli çalışmaları gibi) hacmi boyunca aşağı yapılmalıdır.

Geçerli yazıda ekstraksiyon ve NUR-OPT (Şekil 1) kullanarak kemirgen pancreata BCM veri (ve diğer dokular) hesaplama işlem için bir protokol açıklar. Şekil 2 de gösterildiği gibi, pankreas dokusu numunesi autofluorescense olarak belirgin bir NIR spektrum azalmıştır beklenmektedir. Langerhans insülin etiketli adacıklar değerlendirme oranı: Bu gürültü ortalama sinyal önemli bir artış (N S) yol açar. Olarak burada tarif spektrum, NUR bölümünde görüntüleme için OPT uyarlamalarına göre, en az üç belirli kanalları yeterli S ile görüntülendi olabilir: N oranı farklı olan fare pankreas hacmi boyunca antikor etiketli hücre tipleri değerlendirmelerini sağlamak için kanal ayırma (Şekil 3 ve 4&#39;e bakınız). Diyabetojenik süreçler ve / veya genel olarak BCM değerlendirmelerin görüntüleme için uygulanan tekniğin böylece bir görselleştirme ve ölçümü için izin verirÇevre ve / veya hücre tipleri (bkz. Şekil 4) etkileşim göre insülin pozitif alanlar. Bu tür değerlendirmeler onun fare muadili (bkz. Şekil 5) 3-5 kat daha büyük olan sıçan pankreas da dahil olmak üzere daha önce çok daha büyük numuneler, gerçekleştirmek mümkün NUR aralığında elde artan doku penetrasyon derinliği sayesinde vardır. Ne olursa olsun görünür veya NIR dalgaboyu kullanılmaktadır olsun, CLAHE uygulanması önemli ölçüde tekniğin algılama hassasiyetini (bkz. Şekil 6) artırarak farklı genetik ve fizyolojik koşullar sırasında BCM temelli değerlendirmeler OPT kolaylaştırabilir. Gelişmiş numune tutucusu için bir plan Şekil 7 &#39;de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Akış mur içinde BCM OPT bazlı analizler için kritik adımları gösterenine pankreas. tipik bir fare pankreas değerlendirmek için gereken süre 13-14 gündür. Tarama uzunluğu gerekli pozlama süresi (normalde yaklaşık 1 saat) bağlı iken zamanın çoğunluğu doku işleme ve immünohistokimyasal boyama (10 gün) boyunca tüketilen, doku temizleme yaklaşık 2 gün gerektirir. Daha sonraki sayısal işlem tipik olarak bir gün içinde gerçekleştirilir. Not, nispeten uzundur boyama protokolü ideal örneklerinin büyük miktarlarda toplu işlem için uygundur. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Farklı dalga boylarında BCM değerlendirmeler için gürültü oranı Sinyal. Insülin ve florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli (Alexa 488, 594, 680 ve lekeli bir fare duodenum pankreas lob,Farklı dalga boylarında N oranı: 750), S belirlemek için kullanılmıştır. A Görüntüler her sinyal kanal için ilk projeksiyon karesini göstermek. Her bir sinyal kanal için N: ortalama S gösteren B, Grafik. Oranları plan yoğunluğu (ekzokrin doku endojen doku floresan) bölünmesiyle ortalama adacık yoğunluğu (215 adacık üzerine dayalı) olarak belirlendi. C, S gösteren Grafik: Yok Alexa 594 kanal için elde: S normalize her kanalda ayrı adacıklar N oranları. Tek yönlü varyans analizi kullanılmıştır. Anlamlılık seviyesi ** p &lt;0.01 &#39;e karşılık gelir göstermiştir. (A) 1 mm karşılık gelir Ölçek çubuğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Şekil3. Kanal ayırma. A, tabloda listelenen Alexafluor boyalarla konjuge sekonder antikor proteinG-Sepharose boncuklar üzerinde ayrı immobilize edildi. B, floresan boncuklar daha sonra bir agaroz fantom farklı düzeylerde gömülü ve belirtilen filtreler kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Diyabet araştırma tabanlı çok kanallı görüntüleme OPT. A, OPT Sigara Obez Diyabetik (NOD) tip 1 diyabet için model bir pankreas (12 hafta, duodenal lob) iso-yüzey rekonstrüksiyonu dayanır. Düz kas α-aktin (kan damarları, kırmızı) ve CD3 (T-lenfositler infiltre, yeşil); örnek insülin (adacık β-hücrelerinin, sözde renkli mavi) için lekeli. Kullanılan ilgili ikincil antikorlar vardı; Cy3, IRDye-680 ve sırasıyla DyeLight-750.parçalar (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;) bireysel sinyal kanallarıyla gösterir. B, syngenic adacıkları ile aşılı ve transplantasyon sonrası NUR-OPT iki hafta ile görüntülenebilir bir fare karaciğer lob (lobus sinister lateralis) ve OPT görüntüsü (görünüm blow up). Insülin ifade adacıklar mavi pseuodocolored ve düz kas α-aktin pozitif gemileri kırmızı vardır. Yaklaşım damar ağı içinde adacık greft dağılım değerlendirmelerini sağlar. Ölçek çubuklar 1 mm karşılık gelir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Şekil 5," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Şekil 5,. NUR-OPT büyük numunelerin görüntüleme kolaylaştırır. Tip 2 diyabet (9 ay dalak lob) için Zucker Yağ modelinden bir sıçan pankreas BCM dağılımının, Iso-yüzey işleme, sıçan görüntü numune olasılığı örnekleyen NUR-OPT tarafından pankreas ölçek. Olarak belirlendiBu teknik ile gösterilen lob onun fare muadili göre (v / v) ~ 6 kat daha büyüktür ve β-hücre hacmi toplam lobular hacminin% 1.32 oluşturan Langerhans adacıkları ifade 10139 ensülin barındırır. B, (A), doku ve her derinliklerinden adacıkları tespit edildiği gösteren de kırık çizgilerle gösterilen hat karşılık gelen tomografik bölümü. C, bir boyut referans olarak gösterilen bir fare pankreası (8 hafta için dalak lob) içinde BCM dağıtım Iso-yüzey görüntüleme. Görüntülenen lob olan β-hücre hacmi toplam lobüler hacminin% 0,89 oluşturan 2.490 insülin ifade adacık barındırır. Alexa594 pancreata konjuge keçi anti-GP (fare) ve sırasıyla IRDye 680 Konjuge eşek anti-GP (sıçan) antikorları tarafından takip GP anti-insülin ile boyanmış. In örnekleri (AC) (C) 2 mm karşılık ölçek ve ölçek bar betimlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Şekil 6" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Şekil 6. CLAHE OPT görüntüleme ile fare pankreas adacık tespitini kolaylaştırır. Ac, C57BL / 6 fare pankreas (8 hafta splenik lob) Temsilcisi iso-yüzey render OPT görüntüleri insülin için etiketli. OPT görüntülerin Iso-yüzey rekonstrüksiyonlar önce yapıldı (A, sözde yeşil renkli) ve CLAHE protokolünden sonra (B, sözde kırmızı renkli) uygulandı. C,-olmayan normalize veri Kaplama (A) ve (B) &#39;de CLAHE işlenmiş verileri. C&#39;-C kırmızı-sadece &quot;adacıklar&quot;, (A) non-normalize ve CLAHE işlenmiş (B) görüntüleri Temsilcisi yüksek büyütme kaplaması. Olarak varlığını gösterdiği &quot;, CLAHE komut küçük ve düşük sinyal tespiti kolaylaştırır yoğunluğu adacıklar. Geçerli örnekte tasvir numune (CLAHE işlem sonrası) gelen işlenmemiş projeksiyon verilerine dayanarak Numaraları 1057 adacıktan wi oldu 1.74 mm 3 (hacminde 2419 adacıktan harbored1.77 mm 3) bir hacme inci. D ve E, kontrol (D) ve CLAHE protokol uygulanması 6 ay sonra, tip 2 diyabet 12 (e) için ob / ob fare modeli Örnek veri. Ob / ob pankreas (E) adacık boyutu genel olarak büyük bir artış not edin. (D) ve (E) pankreas dış hat (gri) doku otofloresans gelen sinyale bağlıdır. C Ölçek çubuğu AC 500 mikron. C Ölçek çubuğu &quot;C&quot; ve C&#39;&#39;. Ölçek çubuğu E ile 1 mm karşılık olarak 200 mikron karşılık gelir (D) ve (AC) Hörnblad ve diğerleri 3 adapte edilmiştir olarak (E). Görüntü ve kullanılarak oluşturuldu Bioptonics 3001 tarayıcı. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. OPT örneklerin eki için örnek tutucu. Numune flanş önceden delinmiş delikler aracılığıyla agaroz boşluk aracılığıyla iğneler takarak sabitlenir. Tutucu via step motor menteşeliGüçlü mıknatıs tabanı bulunmaktadır. Bu kurulum kararsız tutkal kullanımı atlar ve tarama sırasında numune istenmeyen hareketleri önler.

Biz optik projeksiyon tomografisi (OPT) adaptasyonu tarif<sup&gt; 1</sup&gt; Yakın kızılötesi spektrum, ve hesaplama araçları bir dizi uygulama içinde görüntüleme için. Bu protokoller, büyük numuneler pankreas β-hücre kitlesi (BCM) değerlendirmelerini sağlayan tekniğin kanallı kapasitesini artırmak ve OPT verilerin kalitesini artırmak.

Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen pankreasındaki veya adacık greftleri içeren dokulardaki beta hücre kütle dağılımının optik projeksiyon tomografisi tabanlı değerlendirmelerini gerçekleştirmektir. Burada, daha büyük örneklerin incelenmesine olanak tanımak ve etkileşim halindeki veya komşu hücre tiplerinin eş zamanlı görselleştirilmesini sağlamak için yakın kızılötesi spektrumu kullanılır. Bu işlem; yakın kızılötesine duyarlı bir kameraya, yüksek güçlü bir ışık kaynağına ve uygun filtre setlerine sahip bir ekipman olan OPT tarayıcı ile gerçekleştirilir.Numune önce izole edilir, fikse edilir ve hormon immün boyaması yapılır, ardından ros'a gömülerek optik olarak şeffaflaştırılır. Daha sonra özel yapım bir numune tutucuya yerleştirilir. Tarama sonrası tarayıcıda doğru merkezleme sağlamak için yarı otomatik bir konumlandırma aracı kullanılır.Projeksiyon görüntüleri, gerektiğinde mekanik düzenek tarafından oluşturulan artifaktları düzeltmek için sonradan işlenir. Düşük yoğunluklu nesnelerin tespitini iyileştirmek için bir eşitleme algoritması kullanılır. Son olarak, görüntü işleme yazılımı kullanılarak segmentasyon, görselleştirme ve kantifikasyon gerçekleştirilir.İnsülin üreten beta hücreleri, kan glukoz homeostazının korunmasında merkezi bir rol oynar. Bu nedenle, pankreatik beta hücresi kütle dağılımının uzamsal ve kantitatif değerlendirmeleri, diyabet araştırmalarının birçok alanı için kilit öneme sahiptir. Bu video protokolünde, yakın kızılötesi aralıkta görüntülemeye olanak tanıyan ve böylece daha büyük pankreas dokusu kütlelerinin görüntülenmesi imkanını sağlayan optik reaksiyon tomografisinin (OPT) bir adaptasyonunu tanımlıyoruz.Ayrıca, tek bir örneklemde daha geniş bir hücre tipi yelpazesinin incelenmesine olanak tanır. Ayrıca, genel olarak pankreas görüntüleme ve B hücresi kütlesi değerlendirmeleri için optimize edilmiş OPT amacıyla geliştirilen hesaplama araçlarının bir derlemesini sunuyoruz. Özellikle, yakın kızılötesi spektrum, dokuda ışık geçirgenliği için en uygun penceredir.OPT görüntülemede spektrumun bu kısmına erişebilmek için, meslektaşlarımız tarafından beta hücre kütlesinin tekil SH değerlendirmeleri için tanımlanan orijinal OPT tarayıcısında bir dizi modifikasyon yapılmıştır. Fare pankreaslarında rutin olarak Omic 3001 taraması kullanıyoruz. Eksitasyon ışığı, yaklaşık 650 nanometre dalga boylarında civa ark lambasından daha yüksek eksitasyon enerjisi sağlayan metal halide lamba ile uygulanır.Işık, eksitasyon filtrelerinden geçmeden önce sıvı bir ışık kılavuzu aracılığıyla aktarılır. Bu protokolde kullanılan filtreler, kanal ayırıcı antikorları değerlendirmek amacıyla bu tabloda gösterilmiştir. Farklı Alexa flor boyaları ile konjuge edilmiş antikorlar, protein boncukları üzerine immobilize edilmiş ve agaroz fantomunun ayrı düzlemlerine yerleştirilmiştir.Görüntüler, farklı kanallar arasında sızıntı (bleed through) olmadığını göstermektedir. Yayılan ışık, yakın kızılötesi spektrumda yüksek kuantum verimliliğine sahip, arkadan aydınlatmalı bir CCD kamera ile tespit edilir. Daha büyük örneklerin görüntülenmesini kolaylaştırmak için, tarayıcıya daha büyük bir reflektör aynası ve vete entegre edilerek görüş alanı artırılmıştır.Yukarıda görülen düzenekteki vete, tarama sırasında örneği döndüren step motordur. Tarama boyunca kamerayı ve step motoru LabU tabanlı bir program kontrol eder; protik degradasyonu önlemek için pankreası hasat edin ve buz gibi soğuk PBS kullanın. Boyama ve tarama prosedürüne müdahale edebilecek çevre yağları ve membranları dikkatlice temizleyin.Örneği 4% PFA içerisinde, dört santigrat derecede iki ila üç saat boyunca fikse edin. Pankreasın katlanmış bir şekilde stabilize olmasını önlemek için, tüm bağlama immün boyama öncesindeki fiksayon sırasında bir Petri kabında yayarak püskürtün ve pankreası fazla PBS ile yıkayın. Boyama prosedürü, beta hücre kütle dağılımının değerlendirilmesi için daha önce tanımlanmıştır.Boyama işlemi için rutin olarak domuz böbreği, anti insülin primer antikorlar ve Alexa Fluor konjuge sekonder antikorların kombinasyonundan yararlanıyoruz. Üç ana pankreas lobunu birbirinden ayırın. Bu işlem, lobların karşılaştırmalı değerlendirmesini kolaylaştırır ve daha yüksek büyütmede tarama yapılmasına olanak tanır.Pankreası suyla durulayın ve kabarcıkları gidermek için agros içinde bekletin. Pankreası %1,5 düşük erime sıcaklıklı agros içine gömün ve çökelene kadar buz üzerinde tutun.Pankreası kapatacak şekilde agros bloğunu kesin. Numune ile agros tabanı arasında yaklaşık bir santimetre boşluk bıraktığınızdan emin olun. Bu boşluk, örneğin numune tutucuya sabitlenmesi için gereklidir.Optik berraklaştırma işlemi için B berraklaştırma çözeltisi (Maurice.Clear olarak da bilinir) kullanılmadan önce pankreası yüzde yüz metanol ileye susuzlaştırın. Örnek şeffaflaşana kadar berraklaştırın. B çözeltisi çoğu plastiği çözdüğü için, A cam şişe kullanılması önerilir.Metanolün tüm kalıntılarını gidermek için B solüsyonunu birkaç kez değiştirin. Örnek artık tarama için hazırdır. Tarama sırasında örnek, bir basamak promotörüne bağlı bir mıknatıs tarafından taşınır.Bu, numunenin X ve set ekseni boyunca kaydırılmasına olanak tanıyarak örneğin tarama öncesi hizalanmasını kolaylaştırır. Çoğu OPT protokolünde, RO bloğu numune tutucuya yapıştırılır; ancak çoğu yapıştırıcı çözülebilir yapıdadır ve bu durum numunenin istenmeyen hareketlerine yol açabilir. Bu nedenle, yapıştırıcı kullanımını ortadan kaldıran bir tutucu tasarlanmıştır.Şeffaf örneği tutucuya yerleştirin ve tutucu flanşlarındaki önceden delinmiş deliklerin kılavuzluğunda iki iğneyi nazikçe yerleştirerek örneği sabitleyin. Örneği tarayıcıya yerleştirin ve BAB solüsyonuna daldırın. Burada, kamera pozlama süresini ve adım promotörünü kontrol etmek ile büyütme gibi deneysel parametreleri kayıt dosyası parametrelerine girmek için kullanılan LabVIEW tabanlı yazılımın grafik kullanıcı arayüzü gösterilmektedir.Odak ayarları ve filtre setlerinin değişimi mikroskop üzerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Büyütmeyi seçerek durun. Numuneyi GFP filtresini kullanarak aydınlatın ve laboratuvar kullanım yazılımını kullanarak bir önizleme görüntüsü görüntüleyin.Numunenin en geniş kısmını bulmak için onu döndürün; bir dizi pankreas örneğini karşılaştırırken tüm numuneler için aynı büyütmeyi kullandığınızı unutmayın. Bu faktör, serideki en büyük örneğe göre belirlenir. Ardından, spesifik sinyali görüntüleyen filtre setine geçin ve odağı ayarlayın.Not: Pozlama süresi, örneğin herhangi bir bölümünü doygunluğa ulaştırmadan mümkün olan en yüksek sinyal-gürültü oranı sağlanacak şekilde seçilmelidir. Pankreas beta hücresi kütlesi değerlendirmelerinde, örneğin tamamı normalde ilgi alanı olduğu için, optimum sonuçlar elde etmek amacıyla örneklerin kütle merkezi (com) dönme eksenine tam olarak konumlandırılmalıdır. Commar algoritması, örnek kütle merkezini hesaplar ve kütle merkezinin dönme eksenine hizalanmasını kolaylaştıran bir referans görüntü sağlar.X koordinatlarını hesaplamak için, öncelikle sıfır derecede GFP kanalının bir anlık görüntüsünü alarak başlayın. Ardından filtreyi değiştirin ve aynı konumdaki spesifik sinyalin bir anlık görüntüsünü alın. Sonraki adımda, ilgi bölgesini eşiklemek için GFP görüntüsüne bir beklenti maksimizasyonu algoritması uygulayın, eşiklenmiş görüntü üzerinde kütle merkezi hesaplaması yapın ve bulunan kütle merkezi noktasından geçen dikey bir çizgiyi spesifik sinyal görüntüsünün üzerine yerleştirin.Z koordinatlarını hesaplamak için bu adımlar, 90 derece döndürülmüş örnek için tekrarlanır. Son olarak, görüş alanının merkez hattının örneğin bulunan kütle merkezi noktalarından geçmesi için örneği hareket ettirmek amacıyla, kütle merkezi noktalarını belirleyen elde edilmiş görüntüler referans olarak kullanılır. Tarama tamamlandığında, rekonstrüksiyon öncesinde görüntülerin dönme ekseni boyunca konumunu hassas bir şekilde ayarlamak için projeksiyonlara bir hizalama sonrası (post alignment) değeri atanır.Ancak, kameranın optik eksene göre açısındaki küçük bir sapma, rekonstrüksiyon sırasında geometrik distorsiyonlara neden olabilir. Bu tür distorsiyonları önlemek için, örnek tarandıktan sonra ayrık bir serbest dönüşüm tabanlı hizalama olan FDA kullanılır. FDA'yı hesaplamak için veri setinden iki projeksiyon alınır.Bu projeksiyonlar sırasıyla sıfır derecedeki spesifik sinyal F ve 180 derecedeki spesifik sinyal G'dir. D görüntüsü, F'nin yönelimiyle eşleşecek şekilde transpoze edilmiştir. Görüntü boyunca iki projeksiyondan gelen sekiz piksel yüksekliğindeki blokları kaydetmek için DFT fonksiyonu kullanılır ve gerekli rotasyon açısını hesaplamak için X ekseni boyunca kaymalar ölçülür; aynı tarama ile elde edilen tüm kanalları düzeltmek için aynı parametreler yeniden kullanılır. COMMAR ve FTA algoritmalarının temellerine ilişkin daha fazla bilgi, iLet segmentasyonunu kolaylaştırmak için AL'de bulunabilir.Projeksiyon görüntülerine kontrast sınırlı adaptif histogram eşitleme uygulanır. Bu protokolde, matlab yerleşik fonksiyonu adapt histeq kullanılmış olup 0.01 varsayılan klip limiti ve 256 bin (bins) ile uygulanmıştır. Ancak, optimal döngü boyutu ampirik olarak test edilmeli ve analiz edilen örneğe bağlı olarak değişebilmelidir; algoritma hakkında daha fazla ayrıntı ve örneklere ilgili kaynaklardan ulaşılabilir.Ek olarak, hizalama ile kompanse edilmiş ve normalize edilmiş veriler artık tomografik kesitler şeklinde yeniden yapılandırılabilir. Elde edilen sanal kesit yığınını görselleştirmek ve nicelleştirmek için S veya velocity gibi uygun görüntü işleme yazılımları kullanarak 3B ISO yüzeyleri oluşturun.Bu şekil, Alexa Fluor 4 88, 5 94, 6 80 ve seven 50 dahil olmak üzere florokrom konjugatlı sekonder antikor kokteyli ile insülin için boyanmış bir pankreas lobunun bir projeksiyon görünümünü göstermektedir. Spektrumun yakın kızılötesi kısmına doğru ilerledikçe sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde artmaktadır. Bu durum, spektrumun daha geniş bir kısmına erişilerek her bir sinyal kanalı için ortalama sinyal-gürültü oranının gösterildiği bu grafikte daha ayrıntılı olarak örneklendirilmiştir.Yakın OPT görüntüleme, tek bir örnekte analiz edilebilecek hücre tipi yelpazesini genişletir. Bu video, tip 1 diyabet için obez olmayan diyabetik modelden alınan pankreasi göstermektedir. Videoda, insülin üreten Langerhans adacıkları mavi, düz kas alfa aktin eksprese eden kan damarları kırmızı ve CD3 ile işaretlenmiş infiltre T lenfositleri görünmektedir.Gri renkteki yeşil teakrin parenkimi, yakın kızılötesi aralığındaki doku penetrasyonunun artışından yararlanılarak, endojen doku otofloresansı baz alınarak yeniden yapılandırılmıştır. OPT görüntüleme, beta hücre kütlesi dağılımının önceden mümkün olandan çok daha büyük örneklerde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu şekil, sekonder antikor olarak ER erdi altı 80 kullanılarak insülin için işaretlenmiş bir SER yağlı sıçanın dalak lobundaki ada dağılımının ISO yüzey yeniden yapılandırmasını göstermektedir.Hassas referans için bir fare dalak küresi gösterilmiştir. Bu görüntüler, tek bir pankreas küresindeki beta hücresi kütle dağılımının iki farklı izoyüzey yeniden yapılandırmasına karşılık gelmektedir; yeşil renkte asit pençe işlemesi olmadan, kırmızı renkte ise algoritma uygulandığında görünmektedir. İki yeniden yapılandırma üst üste bindirilerek, pençenin düşük sinyal yoğunluğuna sahip gözcükler için de segmentasyonu kolaylaştırdığı gösterilmiştir.Bunlar sadece üst üste bindirilmiş görüntüde kırmızı olarak görülür. Az önce size, pankreas hacmi boyunca ve tekil Langerhans adacıkları seviyesine kadar beta hücre kitlesinin uzaysal ve kantitatif bilgilerinin nasıl çıkarıldığını gösterdik. Bu protokoller sadece beta hücrelerinin veya pankreasın yakın-infrared OPT ile değerlendirilmesiyle sınırlı değildir; ayrıca sunulan hesaplama araçlarının diğer araştırma alanlarına uyarlanması da mümkün olmalıdır.Başarılar dileriz. Deneylerinizde başarılar.

near-infrared-optical-projection-tomography-for-assessments-cell-mass

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Sanal kesit görüntüleme için aşağıdaki protokol pankreas diseksiyonu sürecini özetliyor ve sonraki tüm pankreas tüm GFP etiketli beta-hücrelerinin kantifikasyon.

Farelerde, pankreatik beta-hücre Kütle yerinde Niceleme

Immünohistokimyasal lekeli pankreas örneklerin büyük ölçekli satın alma ve analiz Roman bilgisayar destekli yöntemler açıklanmıştır: (1) Sanal Dilim yakalama bölümün tamamını, büyük ölçekli veri (2) Kütle analiz 2D Sanal Dilimleri (3) İmar (4) 3D adacık haritalama ve (5) matematiksel analizi.

Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

Bu protokol bir diyabet tedavisi için terapötik hedefleri bulmak için işlevsel beta hücre kitlesi modüle faktörleri belirlemek sağlar. Protokolü adenovirüsler ile gen ekspresyon manipülasyonu takiben izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için modern bir yöntem oluşur.

Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Burada, β hücre proliferasyonunun müteakip immünofloresan analizi ile kültürdeki bozulmamış fare adacıklarına ilgi yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrokürelerinin bileşiğini oluşturmak ve uygulamak için metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, aday β hücreli mitojenlerin etkinliğini belirlemek için uygundur.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

Pankreas adacık mikrovasküler vasomotion adacık kan dağıtım düzenleyen ve adacık β hücrelerinin fizyolojik fonksiyon korur. Bu iletişim kuralı bir lazer Doppler monitör pankreas adacık mikrovasküler vasomotion vivo içinde fonksiyonel durumunu belirlemek ve pankreas kaynaklı hastalıklara pankreas adacık mikro katkıları değerlendirmek için kullanmayı açıklar.

Lazer Doppler: pankreas adacık mikrovasküler Vasomotion Vivo içinde ölçüm için bir araç

Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Bu protokolde, pankreas adacıkları yeniden yapılandırılır ve özel bir çok platformlu uygulamada uygulanan hesaplamalı algoritmalar kullanılarak analiz edilir.

Yapısal ve Fonksiyonel Analiz için Bir Araç Olarak Pankreatik Adacıkların Hesaplamalı Rekonstrüksiyonu

Biz, ayrıntılı 2-boyutlu plak biyoloji intravasküler moleküler görüntüleme için yeni bir yakın-kızılötesi floresan (NIRF)...

İnflamatuar Plak Kızılötesi Floresans (NIRF) İntravasküler Moleküler Görüntüleme, Multimodal Yaklaşım civarında in vivo Ateroskleroz Görüntüleme

Keşfedin yakın kızılötesi optik projeksiyon tomografi ile pankreas β-hücre kütlesi dağılımını görüntüleme yöntemini. Hesaplamalı araçlar veri kalitesini artırır ve diyabet araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

Diyabet Araştırma β-hücre Kütle Dağılımı değerlendirmelerinde Kızılötesi Optik Projeksiyon Tomografi civarında

Daha fazla video keşfet