Keneler de RNA Girişim

Bu prosedürün genel amacı, enjeksiyon yoluyla kenelerde RNA girişimi tekniğini göstermektir. Bu, önce ilgilenilen genin veya genlerin çift sarmallı RNA'sının sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. RNA daha sonra kenelere enjekte edilir ve daha sonra 24 saat boyunca bir nem odasında tutulur.

Bu bekletme süresinden sonra, kenelerin koyun gibi bir hayvanla beslenmesine izin verilir. Ağırlık, tüy dökümü ve yumurta pozisyonu gibi beslenme parametreleri ile hedeflenen gen veya ilgilenilen genlerin gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile ekspresyonu belirlenir. Sonuç olarak, kene biyolojik parametrelerinin ve gen ekspresyonunun gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile değerlendirilmesi ile hedeflenen genlerin susturulmasının kene biyolojisi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Grubumuz, kene istilasının kontrolü ve patojenlerin insanlara ve hayvanlara bulaşması için yöntemler geliştirmek için bu temel bilgileri kullanmak için kene patojen arayüzündeki moleküler olayları karakterize etmeye çalışan kenelerle çalışır. RNA girişimi bu araştırmada önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır, çünkü kenelerin genetik manipülasyonu için mevcut olan tek yöntemdir. Birçok kene geninin işlevi bilinmemektedir.

RNA girişimi, çiftleşme, üreme, beslenme, sindirim, tükürük bezi fonksiyonu ve patojenlerin bulaşması için kene vektörü yetkinliği dahil olmak üzere kene biyolojisinin birçok alanında kene genlerinin ve gen ekspresyonunun rolünü tanımlamamıza olanak tanır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan kene RNA girişim ekibi, Dr.Ed Lewin, yüksek lisans öğrencisi ve Busby ve ben olacak. Çift sarmallı RNA oluşturmak için, önce RNA'nın in vitro transkripsiyonu için T yedi promotör dizisi içeren oligonükleotid primerlerini sentezleyin.

Örneğin, derma merkezi vari lesin. Burada gösterilen oligonükleotid primerleri D sekiz A a T 75 ve D sekiz DVT 73'ü kullanın. Her oligonükleotid primerinin 10 pikomol ve bir ila 10 nanogram kene toplam RNA kullanarak hedef geni R-T-P-C-R ile çoğaltın.

Ardından, PCR ürününü saflaştırın. Daha sonra çift sarmallı RNA'yı sentezlemek için sekiz mikrolitre veya yaklaşık 100 nanogram kullanın. Keneleri önce enjeksiyona hazırlamak için, keneleri aşağıdaki çözelti serisinde yıkayın, musluk suyu% 3 hidrojen peroksit damıtılmış su iki kez,% 70 etanol ve damıtılmış su ile iki son yıkama.

Her yıkamayı 50 mililitrelik tek kullanımlık bir santrifüj tüpünde çalkalayarak gerçekleştirin. Daha sonra çözeltiyi ince gözenekli bir tel elekten boşaltın. Keneleri kağıt havlu üzerinde kurulayın, ardından deneye bağlı olarak keneleri 20 ila 50'lik gruplara ayırın.

Her grubu sıkıca oturan bir kapağı olan 1.25 onsluk plastik bir bardağa yerleştirin ve her bardağı deney grubuyla etiketleyin. Bir sonraki adım, enjeksiyon işlemini gerçekleştirecek üç kişiden oluşan bir RNAi ekibi oluşturun. İlk kişi, her bir keneyi üç ila altı inçlik bir kırmızı diş balmumu tabakasına yapıştırılmış çift yapışkan bant üzerine yerleştirir.

İkinci kişi keneleri enjekte eder ve üçüncü kişi enjeksiyondan sonra keneleri izler, onları aktive etmek için kenelerin üzerine karbondioksit solur ve canlı keneleri sayar ve deney grubu numarası ile etiketlenmiş kaplara aktarır. Tüm ekip üyeleri tek kullanımlık eldiven giymelidir Kene enjeksiyon işlemine başlamak için, dumont ince forseps kullanarak bir kene yakalayın ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kırmızı diş mumu tabakasına sıkıca yapıştırılmış çift yapışkan bant üzerine yerleştirin Keneler beşli gruplar halinde yerleştirin. Beş kenenin ağız kısımlarının üzerine küçük bir maskeleme bandı şeridi yerleştirin.

Onları daha fazla kısıtlamak için, enjeksiyon işleminin kene enjektörü tarafından gözlemlenebilmesi için vücudun çoğunu açıkta bırakın. Keneyi enjekte etmek için, 29 gauge yarım inçlik bir iğne ile donatılmış bir mono ejeksiyon insülin şırıngası kullanarak dış iskeletin ventral yüzeyinin sağ alt çeyreğinde bir delik açın. Daha sonra, özel yapım bir Hamilton şırınga ve 45 derece eğimli noktalı 33 gauge bir inçlik iğne kullanarak keneleri hemen 0,2 ila 0,5 mikrolitre çift sarmallı RNA çözeltisi ile enjekte edin, çift sarmallı RNA'nın yerleştirilmesini ve tutulmasını sağlamak için iğneyi kene boşluğuna iyice yerleştirin.

Enjeksiyondan sonra sıvı salınsa da, enjeksiyon için iğnenin derin yerleştirilmesi, gen susturmaya neden olacak yeterli çift sarmallı RNA'nın kene boşluğuna birikmesini sağlayacaktır. Hemolenf kaybına ve kenenin ölümüne neden olacak keneleri enjekte edin. Keneleri enjekte ettikten hemen sonra, ince forseps ile çift yapışkan banttan alın ve plastik bir geri kazanım kabına koyun.

Keneler enjeksiyondan sonra kısa bir süre hareketsiz kalacaktır, ancak yakında yemeğin etrafında gezinmeye başlamalıdır. Üzerlerine karbondioksit soluyarak keneleri aktive edin. Keneler sürünerek ve aktif hale geldikten sonra, enjeksiyon yarası hızla iyileşecek ve büyük olasılıkla hayatta kalacaklardır.

Her deney grubundaki keneleri sayın ve her grubu sıkıca kapatılmış bir kapağı olan etiketli plastik bir kaba koyun. Bir sonraki deney grubunu enjekte etmeden önce mevcut grupta ölen keneleri değiştirin. Bir sonraki deney grubunu enjekte etmeden önce Hamilton şırıngasını taze% 3 hidrojen peroksit ile doldurarak ve ardından dışarı atarak temizleyin.

15 kez ve ardından steril su ile 15 yıkama. Hamilton şırıngasının pistonunu bükmemeye dikkat edin, aksi takdirde piston düzgün hareket etmeyecek ve kene enjeksiyonu için gereken hafif dokunuşa yanıt vermeyecektir. Enjeksiyondan sonra, keneleri su ve potasyum sülfat ile dolu bir kabın bulunduğu bir odaya yerleştirin, bu da yüksek nemi ve bir gün boyunca korur.

Daha sonra, tek tek keneleri bir koyuna yapıştırılmış kene besleme hücrelerine yerleştirin ve hangi cinsiyete enjekte edilmediyse, eşit sayıda enjekte edilmemiş erkek veya dişi kene ile beslenmelerine izin verin. Yaklaşık 10 gün boyunca beslenmeyi tamamladıktan sonra veya kontrol dişileri düştükten sonra dişi keneleri besleme hücresinden toplayın ve sallayın, konakçı her bir kene grubunu yumurta pozisyonunun tamamlanmasına kadar nem odasında kuluçkaya yatırır. Beslenmeden sonra kene fenotipini değerlendirmek için bir gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kütlesini tartarak yumurta pozisyonunu grup grup değerlendirin.

Hayatta kalan kene sayısını belirleyin ve kene ağırlığının yanı sıra yumurta pozisyonunu ve yumurtaların doğurganlığını hesaplayın. Hedeflenen gene ve çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, R-T-P-C-R ile gen susturmayı doğrulamak için başka analizler de yapılabilir. Beslenmeden sonra, kontrol enjekte edilen ve çift sarmallı RNA enjekte edilen gruplardan tek tek kenelerden tükürük bezlerini ve bağırsakları inceleyin ve ardından tek tek doku örneklerinden toplam RNA'yı çıkarın.

Tek tek dokulardaki hedef gen transkriptlerini gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile analiz edin ve kene 16 s ribozomal RNA'ya karşı RNA seviyelerini normalleştirin. Gen normu yöntemini kullanarak, yalnızca bir amplikonun oluştuğundan ve amplikonların her numune için aynı sıcaklık aralığında tutarlı bir şekilde denatüre olduğundan emin olmak için reaksiyonun sonunda ayrışma eğrilerini çalıştırın, kontrol enjekte edilen ve çift sarmallı arasındaki mRNA seviyeleri için normalleştirilmiş BT değerlerini karşılaştırın. Öğrencinin T-testi kullanılarak RNA enjekte edilen keneler.

Burada anlatılan protokol laboratuvarımızda birçok farklı ekzot kene türünde RNAi için kullanılmıştır. Kenelere enjekte edilen çift sarmallı RNA miktarı kenenin boyutuna göre değişir. Daha büyük kene türleri daha büyük bir hacmi barındırabilir.

Referanslar, protokolün ekteki yazılı bölümünde bulunabilir. Protokol doğru yapılırsa, 24 saat sonra enjeksiyon işleminden %5'ten daha az mortalite elde edilmelidir. Kenelerde gen yıkımından sonra tipik bir fenotip burada, kene koruyucu antijenleri taramak için kullanılan çift sarmallı RNA havuzları ile bir kene panelinin enjekte edildiği gösterilmiştir.

Işık mikroskobu ile incelenen kenelerde kene dokularında hücresel dejenerasyon görülebilir. Fenotipik değişikliklere fonksiyon kaybı da eşlik edebilir. Örneğin, SUBIN'in RNAI'si, RNA girişimini ve keneleri takiben dişilerle başarılı bir şekilde çiftleşemeyen steril erkeklerle sonuçlanır.

Gen susturmanın gen ve protein ekspresyonu ve kene biyolojisi üzerindeki etkisini belirlemek için gerçek zamanlı R-T-P-C-R, ışık elektronu veya konfokal mikroskopi dahil olmak üzere başka yöntemler de kullanılabilir. Genomik veya proteomik. RNA interferansı, kene hücresi kültürlerinde de yapılabilir ve kene hücresi patojen etkileşimlerinin incelenmesi için in vitro bir yöntem sağlar.