Name: Keneler de RNA Girişim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Keşfedin kenelerde RNA girişim yöntemini; çift zincirli RNA enjeksiyonu ile gen susturma tekniğini öğrenin. Bu yöntem, kene biyolojisi ve hastalık taşıyıcı mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz laboratuarımızda üyeleri, verimli tartışmalar ve teknik yardım için teşekkür ederim. Bu video sunum Araştırma ve Veteriner patobiyolojisi Anabilim Dalı Dekan Yardımcısı, Veteriner Sağlık Bilimleri Merkezi, Oklahoma State University tarafından desteklenmiştir. Araştırma Ministerio de Ciencia e Innovación, İspanya (proje BFU2008-01244/BMC), JF CSIC intramural proje PA1002451 tarafından finanse edildi, Walter R. Sitlington KMK, CVHS 2009 RAC hibe, OAES Gıda Hayvancılık Araştırma Başkanı donatılmış Hayvan Sağlığı Fonları ve USDA, Ulusal Araştırma Girişimi Rekabetçi Grant, No 2.007-04.613.

1. DsRNA, Üretimi. <ol><li> DsRNA in vitro transkripsiyon ve sentez (örneğin, Dermacentor subolesin oligonükleotid primerler D8AAT75 variabilis için T7 promotor dizisinde içeren oligonükleotid primerler sentez: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 've D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). </li><li> RT-PCR her oligonükleotid astar ve kene toplam RNA 1-10 ng 10 pmol kullanarak hedef gen artırın. </li><li> PCR ürünü arındırın. </li><li> DsRNA 8 mcL saflaştırılmış PCR ürünü kullanarak sentezlerler. </li><li> Spektrometresi ile dsRNA sayısal olarak. </li></ol> 2. DsRNA ile Keneler enjeksiyon. 2.1. Keneler enjeksiyon için hazırlanması. <ol><li> Öncelikle, her çözüm, tek bir 50 ml santrifüj tüpüne onları sallayarak tüp üst keneler korumak için üzerine ince bir örgü tel ekran yoluyla çözüm şişeden çözümleri bir dizi keneler yıkayın. Keneler çamaşır için çözümler dizisi, musluk suyu,% 3 hidrojen peroksit, distile su,% 70 etanol ve saf su ile iki kez daha yıkar iki yıkar. </li><li> Kağıt havlu üzerinde kene Blot kurulayın. </li><li> Deney bağlı olarak 20 ila 50 arasında gruba keneler Sayısı 1.25 oz plastik bardak, deneysel grup numarası ile sıkı donatılmış bir kapak ve etiket ile her gruptan keneler. </li></ol> 2.2. Enjeksiyon ekibi işaretleyin. RNAi ekip üç kişiden oluşur: (1) kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılmış çift yapışkan bant, her kene pozisyonları bir kişi, (2), sonra kenelerin izler ve keneler (3) bir kişi enjekte bir kişi enjeksiyon, keneler bunları etkinleştirmek için CO 2 nefes ve deneysel grup numarası ile etiketlenmiş bardak içine yaşayan keneler sayar. Tüm ekip üyeleri, tek kullanımlık eldivenler giymelidir. 2.3. Enjeksiyon için keneler yerleştirilmesi. <ol><li> Dumont ince forseps kullanarak kene yakalayın ve kırmızı diş balmumu 3 "x 6" levha yapıştırılmış çift yapışkan bant üzerinde ventral tarafında bir yer. Keneler 5 keneler gruplar halinde bir araya yakından konumlandırılmış. </li><li> Tüm 5 kenelerin ağız onları daha da dizginlemek için küçük bir şerit üzerinde maskeleme bandı yerleştirin ama vücudun en enjeksiyon işlemi, kene enjektör (Şekil 1) tarafından görülebilir bu yüzden maruz bırakarak. </li></ol> 2.4. Keneler Enjeksiyon. <ol><li> Keneler Exoskeleton ventral yüzeyinde sağ alt kadranda enjekte edilecektir. </li><li> İlk olarak, dış iskelet, ½ ", 29 gauge iğne (Şekil 2a) ile donatılmış bir Monoject insülin şırınga kullanarak bir delik delmek. </li><li> 45 ° Eğimli noktası ile 1 inç, 33 gauge iğne ile ısmarlama Hamilton şırınga kullanarak (mcL başına 5 x 10 11 moleküller 5 x 10 10) (Şekil 2b) dsRNA çözüm 0.2-0.5 mcL hemen kene enjekte . Kene boşluğuna iğne dsRNA yerleştirilmesi ve saklama sigortalamak için iyi yerleştirilmiş olmalıdır. Bazı sıvı enjeksiyon yerinde (Şekil 2c) kaçmak için muhtemeldir. Üzerinde hemolimf kaybına neden olan keneler, enjekte etmek ve kene ölüme neden olabilir alınmalıdır. </li><li> Hamilton şırınga her deney grubunda enjeksiyonları tamamladıktan sonra temizleyin. başka bir deney grubu için kullanmadan önce. Bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın sonra beher% 3 hidrojen peroksit içeren bir şırınga doldurun ve. Steril su içeren bir beher şırınga doldurun ve sonra bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın. Bükülmüş ise, piston düzgün hareket ve nazik bir dokunuş keneler enjeksiyon için gerekli cevap, çünkü Hamilton şırınga pistonu eğmemeye dikkat edin. </li></ol> 2.5. Enjeksiyondan sonra kene tedavisi. <ol><li> Ince forseps ile hemen çift yapışkan bant enjekte kene Pick up ve plastik bir kurtarma konteyner (yaklaşık 6 "x 6" ve keneler kaçmasını önlemek için maskeleme bandı ile halkalı) yerleştirin. Keneler, enjeksiyondan sonra kısa bir süre devre dışı olacak ama yakında çanak etrafında tarama başlamalıdır. </li><li> Nefes kurtarma konteyner keneler etkinleştirilmesine yardımcı olmak için onları yerleştirerek hemen sonra kenelerin üzerine 2 CO. Sonra, tarama ve keneler aktif enjeksiyon yara hızla iyileşir ve bunlar büyük olasılıkla hayatta kalacaktır. </li><li> Her deney grubu sayısına göre keneler sayın ve sıkıca monte kapaklı etiketli bir plastik bardak koyun. Yedek keneler herhangi bir sonraki deney grubu enjekte önce öldüğünü herhangi bir yerine enjekte edilmelidir. </li></ol> 2.6. Tutarak işaretleyin. <ol><li> Nem odasında keneler (12saat ışık Yeri: 22-25 az 12 saat karanlık fotoperiyodun ° C ve% 95 bağıl humidity) ve 1 gün için basılı tutun. </li><li> Yeri keneler, kene besleme hücreleri için bir deney grubu, bir koyun yapıştırılmış ve onları eşit sayıda erkek veya kadın uninjected keneler (enjekte değildi hangisi seks) ile beslenirler. Tıka basa beslemek Kadın keneler, koyun, beslenme 10 gün ya da kontrolü kadın sonra çıkarılır bu konak toplanan ve tartılır düştü. </li><li> Kartonları keneler yerleştirin ve koloni gelişimine tamamlanıncaya kadar nem odasında tutun. Yöntemlerinin koloni ağırlık gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kitle tarafından değerlendirin. </li></ol> 2.7. RNAi sonra kene fenotip analizi. <ol><li> Beslenmeden sonra fenotip kene, keneler, kene kilo yöntemlerinin koloni ve yumurta doğurganlık hayatta sayısını belirleyen değerlendirin. Ancak, çalışmanın hedeflenen gen ve hedeflerine bağlı olarak diğer analizler yapılabilir. </li></ol> 3. RT-PCR ile gen susturma Onayla Analizi. <ol><li> Beslendikten sonra, kontrol enjekte ve dsRNA enjekte grupların bireysel kene tükürük bezleri ve bağırsaklar parçalara ayır. </li><li> Bireysel doku örneklerinden total RNA ayıklayın. </li><li> GenNorm yöntemi (Bio-Rad iQ5 Standart Edition Sürüm 2.0 tarafından uygulanan ddCT) yöntemini kullanarak gerçek zamanlı RT-PCR ile bireysel dokularda hedef gen transkript analiz ve kene 16S karşı RNA düzeyleri normale rRNA. </li><li> Her örnek için aynı sıcaklık aralığında sürekli amplikonlarının doğasını sadece bir Amplikon oluşan olduğundan emin olmak için reaksiyonun sonunda ve disosiasyon eğrileri çalıştırın. </li><li> MRNA düzeyleri kontrol dsRNA enjekte keneler Öğrenci `s, t-testi (P ​​= 0.05) kullanılarak enjekte arasında (normalize Ct değerleri) karşılaştırın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolü burada RNAi için, birçok farklı ixodid kene türlerinde (Tablo 1) laboratuvarda kullanılan olmuştur nitelendirdi. Kene enjekte dsRNA miktarı kene boyutu ile değişir; büyük kene türlerinin daha büyük bir hacim barındırabilir. Negatif kontrol keneler alakasız bir dsRNA ile enjekte edilmelidir. Subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ve beta-aktin 20,21 gibi birçok dsRNAs pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Karıştırma dsRNA çözümler önlemek için tedaviler arasında şırınga yıkamak için önemli olduğunu unutmayın. Protokolü doğru yapılırsa,% 5 oranında daha az ölüm, 24 saat sonra enjeksiyon prosedürü elde edilmelidir. Keneler gen demonte sonra tipik bir fenotip için ekran koruyucu antijenler kene dsRNA havuzları enjekte keneler bir panel ile Şekil 3 gösterilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td> Türlerin işaretleyin </td><td> dsRNA enjekte </td><td> Referanslar </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> cDNA kütüphanesi, subolesin, aktin, nükleotidaz, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, ubikuitin, vATPase, selenoproteinlerin M ve W2A, hematopoietik kök / progenitör hücreleri aktin Proteazom 26S subunit, ferritin1, varisin, akirin, protein gibi </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> cDNA kütüphanesi, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus Microplus </td><td> GST, ubikuitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a flagelliform ipek proteini, von Willebrand faktör </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> ubikuitin, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> (Tablo 1). RNAi protokolü kullanılan edildiği türlerin işaretleyin. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılır çift yapışkan bant keneler Yerleştirme, ventral tarafta. Keneler, küçük bir şerit maskeleme bandı enjektör enjeksiyon sırasında vücut kene gözlemlemek için izin verirken, keneler daha da güvenli amacıyla ağız üzerine yerleştirilir, sonra, 5 gruplar halinde yerleştirilir. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 enjeksiyon prosedürü insülin sy kene dış iskelet (a) sağ alt kadranda piercingringe bir enjeksiyon sitesi oluşturmak için 29 gauge iğne ile donatılmış, (b), (c) en olası kene hemolimf bazı kaçak / 33 gauge iğne ile Hamilton şırınga kullanarak bu sitede dsRNA hemen enjeksiyon akışkanlar. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 kene altı grup RNAi Amblyomma americanum kene koruyucu antijenler için ekran için kullanılan hangi bir panel. Keneler de fenotipik değişiklikler olumlu subolesin RNAi kontrolü ve olumsuz ilgisiz dsRNA kontrol ile karşılaştırıldığında görülebilir. Bu deneyde, her grubun kene ölüm, ağırlıklar ve yöntemlerinin koloni RNAi etkisi istatistiksel olarak analiz edildi.

<ol><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li>
<li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mosquito+control-Lessons+from+the+past%2C+solutions+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li>
<li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li>
<li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+control%3A+Thoughts+on+a+research+agenda%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li>
<li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+applicability+in+tick+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+ticks%3A+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Insect.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen%2C+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li>
<li>AlmazäN, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tick+protective+antigen%2C+4D8%2C+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li>
<li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86%2C+Bm91+and+subolesin%2C+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+defensin%2C+varisin%2C+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li>
<li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+%28Acari%3A+Ixodidae%29+on+female+engorgement+and+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li>
<li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li>
<li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen%2C+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li>
<li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+tool%3A+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Diğer yöntemlerle keneler 14, 33 RNAi için tarif olmasına rağmen, dsRNA enjeksiyon beslenmemiş (Tablo 1) ve beslenen keneler 16,25,34 hem de en yaygın kullanılan Burada anlatılan. RNAi kene genin fonksiyonu ile çalışma, kene patojen arayüzü karakterizasyonu ve tarama ve kene koruyucu antijenler 14,35 karakterizasyonu için değerli bir araç olarak görülmüştür. Özellikle, RNAi keneler 35 fonksiyonel analizleri için en değerli bir araç haline gelmiştir. Metodolojik, RNAi muhtemelen bireylerin çok sayıda gen demonte izin verebilir daha verimli yöntemler dönüşecek. Keneler dsRNA bağlı RNAi mekanizması, daha iyi anlaşılmasına ve bu türün 35,36 bu genetik yaklaşım kullanımı katkıda bulunmak için rafine edilmesi gerekir . Keneler de RNAi hedef etkileri ölçüde de tam 14,27 ele olması gereken önemli bir sorudur. Son olarak, RNAi büyük olasılıkla onay gen regülasyonu ve sistem biyolojisi çalışma kapsamlı katkılar sağlayacak ve kene patojen arayüzü ve kene istilası ve iletim kene kaynaklı patojenlerin kontrolü için aşı geliştirilmesi üzerinde bir etkisi olabilir.

<table><tbody><tr><td>Access RT-PCR sistemi</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR saflaştırma kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAi kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı dental mum</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaplar, 1.25 oz ve kapakları</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hassas pens</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası</td><td>Monoject</td><td></td><td>&amp;#189;&quot;, 29 gauge iğne ile donatılmış</td></tr><tr><td>Hamilton şırıngası</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Özel yapım</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green içeren iScript One-Step RT-PCR Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR tespit sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>Çeşitli</td><td>Lütfen şuraya bakınız: &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

keneler de rna girişim

RNA Interference in Ticks

Keneler evcil ve vahşi hayvanların ve insanların zorunlu hematophagous ektoparazit ve insan hastalıkları 1 ve en önemli vektörler vektörler sığır sektöründe dünya çapında 2 etkileyen sivrisinekler için dünyada ikinci olarak kabul edilir. Keneler, altsınıf Acari, sipariş Parasitiformes, alttakım Ixodida sınıflandırılır ve Arctic tropikal bölgelerde 3 dünya çapında dağıtılmaktadır . Kene istilası kontrol etmek için tüm çabalarına rağmen, bu ektoparazit 4,5, insan ve hayvan sağlığı için ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. RNA enterferans (RNAi) 6, gen fonksiyonu veya etkisi metabolik yolu belirlemek amacıyla gen ekspresyonu bozulması içeren bir nükleik asit tabanlı ters genetik yaklaşım . Küçük müdahale RNA&#39;lar (siRNA) dsRNA tetik 7-9 gibi aynı sırayla içeren sitoplazmik mRNA&#39;ların güçlü bir dizi özel bozulması, çift iplikli RNA (dsRNA) ve sonuçları tarafından başlatılan RNAi yolun efektör moleküllerdir . DsRNA tarafından başlatılan transkripsiyon sonrası gen susturulması mekanizmaları tüm ökaryotlarda tespit edilmiştir şimdiye kadar okudu ve RNAi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve diğer uygulamalar 10 için bir araç olarak hızla çeşitli organizmaların geliştirilmiştir . RNAi genetik manipülasyon için alternatif yaklaşımlar mevcut değildir ya da güvenilmez 5,11 keneler ve diğer organizmalar içinde en yaygın olarak kullanılan gen susturma tekniği haline gelmiştir. Keneler genetik karakterizasyon RNAi 12,13 son başvuru tarihine kadar sınırlı olmuştur. RNAi mevcut olduğunu kısa süre içinde, bu, karakterizasyonu ve kene patojen arayüzü tarama ve kene koruyucu antijenler 14 karakterizasyonu kene gen fonksiyonu eğitim için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Burada, içine dsRNA beslenmemiş keneler enjeksiyon yoluyla RNAi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu deneysel bir yaklaşım elde edilen bilgi, anlayış ve temel biyolojik sistemlerin kene istilası kontrolü ve kene kaynaklı patojenlerin 15-19 bulaşmasını önlemek için aşı geliştirme belirgin katkısı olacağı muhtemeldir .

RNA enterferans (RNAi) dsRNA beslenmemiş keneler içine enjeksiyon için bir yöntem açıklanmıştır. RNAi genetik manipülasyon diğer yöntemlerin kullanımı sınırlı kalmıştır keneler en yaygın olarak kullanılan gen susturma tekniği.

Keneler de RNA Girişim

Keneler; vahşi ve evcil hayvanların yanı sıra insanların zorunlu hematofaj ekto-parazitleridir ve vektörler arasında dünya genelinde sivrisineklerden sonra ikinci sırada kabul edilirler...

Bu prosedürün genel amacı, kenelerde enjeksiyon yoluyla RNA interferans tekniğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle ilgili genin veya genlerin çift zincirli RNA'sının sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra RNA kenelere enjekte edilir ve ardından keneler 24 saat boyunca bir nem odasında tutulur.Bu bekletme süresinin ardından, kenelerin son olarak koyun gibi bir hayvan üzerinde beslenmelerine izin verilir. Ağırlık, tüy dökümü ve ova konumu gibi beslenme parametreleri ile hedeflenen gen veya genlerin real-time R-T-P-C-R ile ekspresyonları belirlenir. Nihayetinde, kene biyolojik parametrelerinin değerlendirilmesi ve real-time R-T-P-C-R ile gen ekspresyonu analizi yoluyla, hedeflenen genlerin susturulmasının kene biyolojisi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Grubumuz, kene istilasının kontrolü ve patojenlerin insanlara ve hayvanlara bulaşmasını önlemeye yönelik yöntemler geliştirmek amacıyla, kene-patojen arayüzündeki moleküler olayları karakterize etmeye çalışarak keneler üzerinde çalışmaktadır. RNA interferans, kenelerin genetik manipülasyonu için mevcut olan tek yöntem olması nedeniyle bu araştırmalarda temel bir araç haline gelmiştir. Birçok kene geninin işlevi henüz bilinmemektedir.RNA interferans, çiftleşme, üreme, beslenme, sindirim, tükürük bezi fonksiyonu ve kenelerin patojen iletimindeki vektör yetkinliği dahil olmak üzere kene biyolojisinin birçok yönünde kene genlerinin ve gen ekspresyonunun rolünü belirlememize olanak tanır. Prosedürü, laboratuvarımızdan kene RNA interferans ekibi olan Dr. Ed Lewin, lisansüstü öğrencisi Busby ve ben göstereceğiz. Çift zincirli RNA üretmek için öncelikle RNA'nın in vitro transkripsiyonu için T7 promotör dizileri içeren oligonükleotid primerleri sentezleyin.Örneğin, derma center vari lesin için. Burada gösterilen D eight A a T 75 ve D eight DVT 73 oligonükleotid primerlerini kullanın. Her bir oligonükleotid primerinden 10 picomoles ve 1 ila 10 nanograms kene toplam RNA'sı kullanarak R-T-P-C-R ile hedef geni amplifiye edin.Ardından, PCR ürününü saflaştırın. Daha sonra, çift zincirli RNA sentezlemek için sekiz µL veya yaklaşık 100 ng kullanın. Keneleri enjeksiyona hazırlamak için öncelikle keneleri şu çözelti serisiyle yıkayın: musluk suyu, %3 hidrojen peroksit, iki kez distile su, %70 etanol ve son olarak iki kez distile su ile yıkama yapın.Her bir yıkama işlemini 50 mililitrelik tek kullanımlık bir santrifüj tüpünde çalkalayarak gerçekleştirin. Ardından çözeltiyi ince gözenekli bir tel süzgeç aracılığıyla süzün. Keneleri kağıt havlu üzerinde kurutun, daha sonra deneye bağlı olarak keneleri 20 ila 50'li gruplar halinde paylaştırın.Her grubu, sıkı kapanan kapaklı 1,25 onsluk plastik bir kaba yerleştirin ve her kabı deney grubuyla etiketleyin. Ardından, enjeksiyon işlemini gerçekleştirecek üç kişiden oluşan bir RNAi ekibi kurun. İlk kişi, her bir keneyi, üçe altı inçlik kırmızı dental mum tabakasına sabitlenmiş çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirir.İkinci kişi kenelere enjeksiyon yapar ve üçüncü kişi enjeksiyondan sonra keneleri izler; keneleri aktive etmek için üzerlerine karbondioksit solur, canlı keneleri sayarak deneysel grup numarasıyla etiketlenmiş kaplara aktarır. Tüm ekip üyeleri tek kullanımlık eldiven giymelidir. Kene enjeksiyon sürecine başlamak için, dumont ince pens kullanarak bir kene yakalayın ve onu kırmızı dental mum tabakasına yapıştırılmış çift taraflı yapışkan bandın üzerine ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Keneleri beşli gruplar halinde yakın konumlandırın. Beş kenenin tamamının ağız kısımlarının üzerine küçük bir maskeleme bandı şeridi yerleştirin.Kene enjekte eden kişinin enjeksiyon sürecini gözlemleyebilmesi için, keneleri daha fazla sabitledikten sonra gövdelerinin çoğunu açıkta bırakın. Keneye enjeksiyon yapmak için, 29 gauge yarım inçlik bir iğne takılmış tek kullanımlık bir insülin şırıngası kullanarak ekzoskeletin ventral yüzeyinin sağ alt kadranında bir delik açın. Ardından, özel yapım bir Hamilton şırıngası ve 45 derecelik eğimli uca sahip 33 gauge bir inçlik bir iğne kullanarak kenelere derhal 0.2 ila 0.5 µL çift zincirli RNA çözeltisi enjekte edin; çift zincirli RNA'nın yerleşmesini ve kalmasını sağlamak için iğneyi kene boşluğuna iyice yerleştirin.Enjeksiyondan sonra sıvı salınsa bile, iğnenin derin yerleştirilmesi, gen susturmaya neden olacak yeterli miktarda çift sarmallı RNA'nın kene boşluğuna depolanmasını sağlayacaktır; ancak aşırı enjeksiyon yapılmamasına dikkat edilmelidir. Aşırı enjeksiyon hemolenf kaybına ve kenenin ölümüne yol açacaktır. Kenelere enjeksiyon yapıldıktan hemen sonra, keneleri ince pensle çift taraflı yapışkan banttan alın ve plastik bir toparlanma kabına yerleştirin.Keneler enjeksiyondan sonra kısa bir süre hareketsiz kalacak, ancak kısa süre içinde kabın içinde sürünmeye başlayacaklardır. Keneleri üzerlerine karbondioksit soluyarak aktive edin. Keneler sürünmeye ve aktif hale geldiğinde, enjeksiyon yarası hızla iyileşecek ve büyük olasılıkla hayatta kalacaklardır.Her deneysel gruptaki keneleri sayın ve her grubu, sıkıca kapanan kapaklı, etiketlenmiş plastik bir kaba yerleştirin. Bir sonraki deneysel grubu enjekte etmeden önce, mevcut grupta ölen kenelerin yerine yenilerini koyun. Bir sonraki deneysel grubu enjekte etmeden önce, Hamilton şırıngasını taze %3 hidrojen peroksit ile doldurup boşaltarak temizleyin.Steril su ile 15 kez yıkama işlemi uygulayın. Hamilton şırıngasının pistonunu bükmemeye dikkat edin; aksi takdirde piston pürüzsüzce hareket etmeyecek ve kene enjeksiyonu için gereken hassas dokunuşa yanıt vermeyecektir. Enjeksiyondan sonra keneleri, yüksek nemi koruyan ve onları bir gün boyunca muhafaza eden, su ve potasyum sülfat dolu bir kap içeren bir hazneye yerleştirin.Ardından, tek tek keneleri bir koyuna yapıştırılmış kene besleme hücrelerine yerleştirin ve enjekte edilmemiş erkek veya dişi kenelerle (enjeksiyon yapılmayan cinsiyet hangisiyse) eşit sayıda beslenmelerine izin verin. Beslenme işlemi yaklaşık 10 gün sürdüğünde veya kontrol grubu dişileri konaktan ayrıldığında, dişi keneleri besleme hücresinden toplayın ve yumurtlama işlemi tamamlanana kadar her kene grubunu nem odasında inkübe edin. Beslenme sonrası kene fenotipini değerlendirmek için, her gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kütlesini tartarak grup bazlı yumurtlama durumunu değerlendirin.Hayatta kalan kene sayısını belirleyin ve kene ağırlığının yanı sıra ova konumunu ve yumurtaların fertilitesini hesaplayın. Hedeflenen gene ve çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, R-T-P-C-R ile gen susturulmasını doğrulamak için diğer analizler gerçekleştirilebilir. Beslemeden sonra, kontrol enjeksiyonu yapılan ve çift zincirli RNA enjeksiyonu yapılan gruplardaki tekil kenelerden tükürük bezlerini ve bağırsakları disseke edin ve ardından bireysel doku örneklerinden toplam RNA ekstre edin.Hedef gen transkriptlerini gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile tekil dokularda analiz edin ve RNA seviyelerini kene 16 s ribozomal RNA'ya göre normalize edin. Gen norm yöntemini kullanarak, yalnızca tek bir amplikon oluştuğundan ve amplikonların her örnek için tutarlı bir şekilde aynı sıcaklık aralığında denatüre olduğundan emin olmak amacıyla reaksiyon sonunda dissosiyasyon eğrileri çalıştırın; kontrol enjekte edilen ve çift zincirli RNA enjekte edilen keneler arasındaki mRNA seviyeleri için normalize edilmiş CT değerlerini Student's T-testi kullanarak karşılaştırın.Burada açıklanan protokol, laboratuvarımızda birçok farklı ekzotik kene türünde RNAi için kullanılmıştır. Kenelere enjekte edilen çift sarmallı RNA miktarı, kenenin boyutuna göre değişir. Daha büyük kene türleri, daha yüksek hacimleri tolere edebilir.Referanslar, protokolün beraberindeki yazılı bölümde bulunabilir. Protokol doğru şekilde uygulandığında, 24 saat sonra enjeksiyon işleminden kaynaklı mortalite %5'ten az olmalıdır. Kenelerde gen susturulması sonrası tipik bir fenotip burada gösterilmiştir; bu örnekte, kene koruyucu antijenlerin taranması için kullanılan çift zincirli RNA havuzları bir grup keneye enjekte edilmiştir.Işık mikroskobu ile incelenen kenelerde, kene dokularında hücresel dejenerasyon gözlemlenebilir. Fenotipik değişikliklere fonksiyon kaybı da eşlik edebilir. Örneğin, SUBIN'in RNAI'si, dişi kenelerle başarılı bir şekilde çiftleşemeyen steril erkeklerin ortaya çıkmasıyla sonuçlanır. RNA interferansı ve keneler.Real-time R-T-P-C-R, ışık, elektron veya konfokal mikroskobi, genomik veya proteomik dahil olmak üzere, gen susturmanın gen ve protein ekspresyonu ile kene biyolojisi üzerindeki etkisini belirlemek için diğer yöntemler kullanılabilir. RNA interferans ayrıca kene hücre kültürlerinde de uygulanabilir ve kene hücre-patojen etkileşimlerinin incelenmesi için in vitro bir yöntem sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Sağlıklı laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, kene biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine çalışmalar için gereklidir. Burada, fare için düşük maliyetli ve stresli olgunlaşmamış kene beslemesi için basit bir protokolü gösteriyoruz.

yetiştirme<em&gt; Geyik kenesi,</em&gt; Siyah Ayaklı Tik Tak: Fare üzerinde Olgunlaşmamış Evreleri Besleme

İç içe geçmiş PCR DNA Borrelia burgdorferiiçin hastalığının Lyme hastalığı araştırma ayıklar kene için uygulanan hassas, belirli ve basit bir tekniktir. İlk PCR deney gene özgü astar iç primerler kullanılarak bir sonraki tepki için şablonlar haline uzun amplicons oluşturmak için kullanılır.

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

Bu çalışmada, laboratuvar faresine bağlı bir kapsül kullanılarak sert kenenin nymphal ve larva evreleri için bir besleme sistemi geliştirilmiştir. Besleme kapsülü esnek malzemelerden yapılır ve en az bir hafta boyunca fareye sıkıca bağlı kalır ve kene beslemenin rahat bir şekilde izlenmesini sağlar.

Laboratuvar Farelerde Olgunlaşmamış Sert Kene Aşamaları Enfestasyon için Kapsül Tabanlı Model

Mevcut protokol, mikroRNA'ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA'larla sonuçlanır.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Burada sunulan, çeşitli kene yaşam aşamalarının kısmi veya tam olarak engorgementine izin vermek için yapay bir membran sistemi aracılığıyla keneleri in vitro olarak kan beslemek için bir yöntemdir.

Ixodes scapularis için Kene Yapay Membran Besleme

Bu makale, klinik araştırmalar için insanları larva Ixodes scapularis'e maruz bırakma metodolojisini sunmaktadır. Teknik nispeten basittir, araştırma gönüllüleri tarafından tolere edilebilir ve deneysel ihtiyaçlara göre değiştirilebilir. İnsan denekleri içeren bu tür araştırmalar, uygun düzenleyici makamlar tarafından onaylanan klinik çalışma protokolleri kapsamında yürütülmelidir.

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

Burada, vektör yeterliliği ve patojen-mikrobiyom etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için kene kaynaklı patojenlerin dokuya özgü lokalizasyonunu incelemek için, beslenen bir kenenin diseksiyonunu takiben tükürük, hemolenf, tükürük bezleri ve orta bağırsak toplamak için bir protokol sunuyoruz.

Bireysel Kenelerden Tükürük, Hemolenf, Tükürük Bezleri ve Orta Bağırsağın Ekstraksiyonu (Acari: Ixodidae)

Keşfedin kenelerde RNA girişim yöntemini; çift zincirli RNA enjeksiyonu ile gen susturma tekniğini öğrenin. Bu yöntem, kene biyolojisi ve hastalık taşıyıcı mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

Keneler de RNA Girişim

Daha fazla video keşfet