Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Bu video, gözenekli boru şeklindeki iskelelerin nasıl üretileceğini ve bunların arteriyel doku mühendisliği için dinamik mekanik koşullandırmaya nasıl tabi tutulacağını göstermektedir. Bu, önce iskelelerin biyolojik olarak parçalanabilen bir elastomer ve saldırı füzyon yöntemi kullanılarak imal edilmesiyle gerçekleştirilir. İskeleler daha sonra hücre tohumlama için hazırlanır ve bir biyoreaktör sistemine monte edilir.

Biyoreaktörde vasküler düz kas hücreleri iskeleleri tohumlar ve kültürlenir. Haftalar sonra, taramalı elektron mikroskobu, h ve e boyama ve elastin otofloresan kullanılarak doku toplanır ve analiz edilir. Elde edilen düz kas hem çok katmanlı hem de dikey olarak yönlendirilmiştir.

Parçacıklı ağartma gibi mevcut olan bu tekniğin ana avantajı, cam kalıbı gözenekli boru şeklindeki iskele ve hyaluronik asit imal etmek için kullanmaktır. Bir kalıp silerken, iskele kalıbı bir parça cam borudan hazırlanır. Tüpü bir tutucuya koyun ve bir gün önce hazırlanan hyaluronik asit solüsyonunu tüpe dökün.

Hyaluronik asit iç duvar boyunca yavaşça aşağı akar. Kalıbın dibine ulaştığında kalıbı ters çevirin. Kalıbın iç duvarı çözelti ile eşit şekilde kaplanana kadar bu adımı tekrarlayın.

Kaplamadan sonra, hazırlanan tüm cam kalıpları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede vakumlu bir fırında kurutun. Tipik olarak, cam kalıplar kururken aynı anda dört kalıp hazırlanır. Tuz parçacıklarını hazırlayın, dökün, öğütün ve tuz parçacıklarını 25 ila 32 mikrometreye kadar SVE edin.

Ertesi gün, hazırlanan cam kalıp mandrelini, PTFE boruyu, ısıyla daralan manşonu ve PTFE halkasını monte edin. İlk olarak, mandreli 65 milimetre uzunluğundaki PTFE boruya yükleyin ve 120 santigrat derecede beş dakika pişirin. Savaş öncesi beklerken PTFE'yi küçültmek için en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir hibridizasyon inkübatörü.

Boru mandrelleri kapladıktan sonra, ısıyla daralan manşonu mandralın üzerine itin, böylece serbestçe hareket eder. Ardından mandreli cam kalıbın içine yerleştirin ve A-P-T-F-E halkasını mandrelin altına takın. PTFE halkasının cam kalıbın altına tam olarak oturduğunu kontrol edin.

Daha sonra, bir spatula ve silikon kauçuk huni kullanarak, cam kalıba tuz parçacığı lapası ekleyin. Ardından, eşit parçacık dağılımı için kalıba spatula ile hafifçe vurun ve fazla tuzu kazıyın. Şimdi ısıtılmış inkübatörü kapatın ve hızlı bir şekilde yükleyin Tuz dolu kalıplarla, tuz önümüzdeki 30 dakika içinde kaynaşacak ve ardından kalıpları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede vakumlu bir fırında kurutacaktır.

Soğuduktan sonraki gün, PTFE halkasını sabitlerken dışarı iterek paslanmaz çelik mandreli kalıplardan çıkarın. Gerekirse iğne burunlu pense kullanın. Ardından PTFE halkasını kalıbın altından çıkarın.

Ardından, manşonu küçültmek için kalıpları pişirin ve büzülmüş manşonları kalıplardan çıkarın. Kalıpları kullanılana kadar soğumaya bırakın ve bir kapüşonda kurumuş bir şekilde saklayın. Apo damlalık kullanarak cam kalıpları 45 derece açılandırın ve kalıbı yavaşça döndürürken PGS çözeltisini iç lümenlerine bırakın.

PGS çözeltisinin kalıbın duvarı boyunca aşağı akıp akmadığını kontrol edin. Kuru bir nokta varsa, daha fazla PGS ekleyin Şimdi THF'nin başlıkta en az 30 dakika buharlaşmasına izin verin. THF bittiğinde, kalıpları vakumlu bir fırında kürleyin.

Bir gün sertleştikten sonra, kalıpları oda sıcaklığına soğutun ve yavaşça, dikey olarak 24 santigrat derecede deiyonize suya daldırın. Onları çok hızlı devirmek, iskeleyi yırtan hava kabarcıkları oluşturur. Kalıpları dikkatlice su banyosuna aktarın.

Bunları bir silikon tüp kullanarak belirli bir açıyla konumlandırın ve hyaluronik asidin bir saatten fazla çözünmesine izin verin. Bir saat sonra hyaluronik asit kalıptan çıkmadıysa, kalıp hala su altındayken, hyaluronik asidi her iki uçtan yavaşça itmek için bir spatula kullanın ve ardından kalıbı yavaşça sallayın. Şimdi, iskelelerin cam kalıbın içinde hareket etmediğini kontrol edin ve eğer öyleyse, iskeleyi kalıptan çıkarmak için forseps ile yavaşça çekin.

Daha sonra, hassas iskeleleri hafifçe karıştırarak deiyonize bir su banyosuna dikkatlice aktararak tuz parçacıklarını süzün. Bu en az üç gün sürecektir ve suyun günlük olarak değiştirilmesini gerektirir Tuzun tamamı süzüldükten sonra, her iskeleyi deiyonize su ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir saat boyunca kuru bir buz kutusunda dondurun. Dondurulmuş santrifüj tüplerini, kapakları açık olarak üç gün boyunca bir liyofilizatöre yerleştirin.

Dondurularak kurutulduktan sonra, iskeleleri kullanılana kadar kurumuş bir yerde saklayın. İskeleleri 25 ila 30 milimetre uzunluklarda keserek başlayın. Ardından, PTFE borularını her bir durdurucunun orta deliklerinden besleyerek iki silikon kauçuk tıpa hazırlayın.

Daha sonra bir buçuk milimetre uzunluğunda hs halkası kesin ve iskelenin bir ucuna bir uzunluk kaydırın. İskeleyi boruya sıkıca bağlamak için HS halkasının altında olacak kadar üst üste binecek şekilde durdurucuya bağlı bir PTFE borusunu iskelenin aynı ucuna itin, HS halkasını bir fırında küçültün ve düzeneğin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Şimdi, biyoreaktör odası olarak işlev gören 50 milimetrelik bir polikarbonat tüp, iskele üzerinden kaydırılıyor ve silikon kauçuk tıpanın iç yüzeyine sabitleniyor.

Daha önce olduğu gibi, başka bir PTFE tüpü ve durdurucu, odayı tamamlamak için iskelenin diğer ucuna bir hs halkası ile sabitlenir. İkinci durdurucu, polikarbonat tüpün diğer ucuna takılır. Daha sonra, durdurucuların dış yüzeyleri iki alüminyum alaşımlı plakaya tutturulur.

Her plakadaki yan deliğe iki dişli çubuk besleyin ve plakaları kelebek vidalarla sabitleyin. İskeleyi biyoreaktöre takın. Şimdi iki hs halkası arasındaki mesafe olan her bir iskelenin görülebilir uzunluğunu ölçün ve iç yüzey alanlarını hesaplayın.

Hücre tohumlaması için. Bir otoklavda, biyoreaktör ünitesinin her bir parçası ile birlikte her biri ayrı ayrı folyoya sarılmış odaları sterilize edin. Sterilize edildikten sonra, biyoreaktörü bir hücre kültürü davlumbazının içine monte edin.

Akış devresinde dakikada bir milimetre hızında bir peristaltik pompa kullanarak iskeleyi bir dizi perfüzyonla ön işleme tabi tutun ve durulayın. Her biri bir saat boyunca %70 etanol, %50 etanol ve ardından %25 etanol ile durulayarak başlayın. Üç etanol durulamasını iki saatlik bir PBS durulama ile takip edin.

Son olarak, biyoreaktörü 24 saat boyunca SMC kültür ortamı ile perfüze edin, ardından hücre tohumlama ve deney için hazır hale gelir. Şimdi, ekteki el yazmasındaki talimatları izleyerek, biyoreaktörü santimetre kare başına 2 milyon hücre ile tohumlayın ve önümüzdeki 21 gün içinde boru ortamını değiştirin ve pompa hızında ayarlamalar yapın. Yavaş yavaş, yapıdaki basınç, kültürün ilk gününde yaklaşık dört milimetre cıvadan, kültürde iki hafta sonra 100 milimetre cıvanın üzerine çıkacak, kültürde üç hafta sonra, hücreleri hasat edecek ve beraberindeki el yazmasında belirtildiği gibi analiz için hazırlayacaktır.

Bu boru şeklindeki PGS iskeleleri, tuz füzyon yöntemiyle imal edildi. Taramalı elektron mikrografları, iskelelerin tamamının homojen et kalınlıklarına sahip olduğunu ve kesitlerinde kısmi bir kusur olmadığını göstermiştir. Tüm iskelelerin luminal yüzeyinde rastgele dağılmış makro ve mikro gözenekler gözlendi.

Hücre kültüründen sonra, çok katmanlı SMC'ler akış yönüne dik bir yönelimle büyüdü. Ayrıca, hücreler ve DCM proteinleri, tüm PGS yapılarının lümenini tamamen kapladı. Elastin otofloresan ayrıca yapının luminal yüzeyinde çevresel olarak organize edilmiş elastik lifler gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, gözenekli boru şeklindeki iskelenin nasıl yapıldığını anlamalı, önceden tasarlanmış biyoreaktör kullanarak hücreleri ve kültür iskelesini görmüş olmalısınız.