ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Bu prosedürün genel amacı, yara iyileşmesine yardımcı olmak için kök hücreleri iletmek ve ayırt etmek için kullanılabilecek doğal biyomalzemelerden yapılmış bir kompozit matris oluşturmaktır. Bu, ilk olarak bir test hayvanından adipoz türevli kök hücrelerin veya bir SC'nin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, A SC önceden yapılmış kitosan mikroküreciklerine yüklenir.

Daha sonra FIBRILLENMIŞ kollajen jeli dökülür ve A-S-C-C-S-M boncukları kollajen jeli üzerine katmanlanır. Son olarak, PEG fibrin jeli A-S-C-S-M kollajen jeli üzerine dökülür ve besiyeri eklenir. Sonuç olarak, A SC'nin CSM boncuğundan hem kollajen hem de PEG fibrin matrislerine çift yönlü eşzamanlı göçünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu prosedür sayesinde, tek bir kök hücre kaynağı, kollajen ve PEG fibrin mikro çevrelerinden farklı ipuçları alabilir ve pleiotropik faktörler üretmek ve bir prevasküler yapılar ağı oluşturmak için diferansiyel olarak uyarılabilir. Bu tekniğin, tek malzemeli kompozitler veya hücreden arındırılmış cilt ikameleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu diğer ürünlerin, ürünün konakçı tarafından revaskülarizasyonunu aktif olarak ele almamasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, izole edilmiş RAD A SE'nin bir domuz fibrin matrisinde kültürlendiğinde vasküler bir fenotipe doğru farklılaşma eğiliminde olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi.

Bu gözlem, tek bir kök hücre kaynağının, farklı biyomalzemelerden oluşan bir sistemde aynı anda kullanılabileceği fikrini ateşledi. Adipoz türevli kök hücreleri veya ASC'leri izole ettikten ve kültürledikten sonra, kitosan mikroküreleri veya CSM'leri hazırladıktan ve ASC'leri CSM'lere yükledikten sonra, süksinil glut derate modifiye peg'i dört mililitre tris tamponlu salin içinde çözerek polietilen glikol, fibrin hidrojel hazırlayın. Deneyden hemen önce, çözeltiyi sterilize etmek için 0.22 mikronluk bir filtre kullanın.

Altı kuyulu bir plaka karışımından oluşan bir kültür kuyusunda, 500 mikrolitre fibrinojen stoğu ve 250 mikrolitre PEG stoğu, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 20 dakika inkübe edilir. Daha sonra, önceden hazırlanmış 250 mikrolitre A-S-C-C-S-M'yi pegile fibrinojen çözeltisi ile karıştırın, hemen bir mililitre trombin stok çözeltisi ekleyin ve bir pipet kullanarak hızlı bir şekilde bir veya iki kez üçlü hız hemen hücre jel karışımını 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Daha sonra, elde edilen peg fibrini HBSS ile iki kez yıkayın ve 11 günlük bir süre boyunca standart ışık mikroskobu teknikleri kullanılarak 37 santigrat derecede %5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde %10 FBS ile takviye edilmiş alfa minimal esansiyel ortam ile inkübe edin.

Hücrelerin CSM'den jel karışımına göçünü gözlemleyin, A-S-C-C-S-M, iki normal sodyum hidroksit kullanılarak sıçan kuyruğu tendonlarından ekstrakte edilen tip bir kollajen ile. PH'ı 6.8'e ayarlayın ve fibrilatlayın. Fibrillenmiş kollajen, A-S-C-C-S-M karışımını 12 Kuyulu bir plakaya ekleyin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 30 dakika inkübe edin.

Fibrilasyonun tamamlandığını kontrol ettikten sonra, kollajen A-S-C-C-S-M jellerini 37 santigrat derecede %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde 11 güne kadar inkübe edin. Tek bir kök hücre kaynağının göç ve koindüksiyon özelliklerini incelemek için iki katmanlı yapıyı geliştirmek için standart mikroskopi tekniklerini kullanarak hücrelerin CSM'den jele göçünü 11 günlük bir süre boyunca gözlemleyin. İki biyo iskele kullanarak.

Aşağıdaki küçük değişikliklerle hem kollajeni hem de PEG fibrin jellerini hazırlayın, mililitre kollajen başına bir mililitre 7.5 miligram hazırlayın. Daha sonra karışımı altı kuyulu bir doku kültürü ekine aktarın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Tam fibrilasyondan sonra, kültür ortamında 200 mikrolitre beş miligram A-S-C-C-S-M kollajen yüzeyinin üzerine koyun.

Mikroküreler jelin üzerine yerleştikten sonra, 250 mikrolitre hücre kültürü ortamı kullanarak PEG fibrin jelini hazırlayın. Daha sonra pegile fibrinojen trombin solüsyonunu A-S-C-C-S-M kollajen tabakaları üzerine katmanlayın. Tamamlandıktan sonra, tam bir iyileşme elde etmek için yapıları %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin.

Son olarak, yapının üzerindeki üst bölmeye bir mililitre orta ve alt bölmeye üç mililitre orta ortam yerleştirin. Bu iskele içine gömülü bir SC'nin karakterizasyonu, SC yüklü bir CSM'nin aynı anda bir kollajen ve peg fibrin tabakası arasına sıkıştırılabileceğini ve yeni koşulları altında gelişmek için her iki hücre dışı ortamdan farklı şekilde ipuçları alabileceğini ortaya koydu. Burada gösterildiği gibi, kollajen, ASC'lerin kök hücreler olarak kalma yeteneğini, stro bir'in yeşil renkte ekspresyonu ve fibroblast benzeri morfolojileri ile gösterildiği gibi destekledi.

Buna karşılık, PEG fibrin, ASC'lerin, burada gösterilen tüp benzeri morfolojileri ile gösterildiği gibi, lümen ve burada kırmızı ile gösterilen von Willow markasının endotel hücresine özgü ekspresyonu ile tamamlanan avasküler fenotipe doğru farklılaşmasına neden oldu. Ek olarak, burada gösterildiği gibi, gözlemlenen bu fenotiplerin kültürün erken dönemlerinde ortaya çıktığı ve 11 gün boyunca korunduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, sıçan yağ türevli kök hücrelerin nasıl izole edileceğini, bunları chito ve mikrokürelere nasıl yükleyeceğinizi ve FDA onaylı biyomalzemeler kullanarak iki katmanlı bir hidrojele nasıl dahil edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu protokolde kullanılan biyomateryallerin ve hücrelerin hayvanlardan ve insanlardan elde edildiğini ve konakçılarından gelen patojenlerle kontamine olmaları durumunda son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu işlemler yapılırken kişisel koruyucu ekipman ve aseptik hücre kültürü teknikleri gibi önlemler her zaman alınmalıdır.