Name: Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin sınırlayıcı seyreltme hücre transplantasyonu yöntemiyle Danio rerio'da lösemi yayıcı hücrelerin sıklığını belirleme tekniğini. Bu protokol kanser araştırmalarında tümör biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansman NIH hibe 5T32CA09216-26 (JSB için), ve K01 AR055619-01A1 ve 3 K01 AR055619-03S1 (DML için), yanı sıra Alex&#39;in Limonata Standı Vakfı tarafından, Harvard Kök Hücre Enstitüsü ve Amerikan Kanser tarafından sağlanan edilmiştir vardır Toplum.

1. Zebra balığı embriyoların DNA mikroenjeksiyon <ol><li> Rag2 Linearize: cMyc ve rag2: GFP 11 DNA yapıları 37 ° C gecede Noti her plazmid 10μg sindirerek. </li><li> Fenol: kloroform ekstresi ve plazmid çökelek ve 20μL H 2 O. her tekrar süspansiyon </li><li> DNA konsantrasyonu yüksek oranda DNA merdiveni 20μL, 10μL ve 5μL% 1 agaroz jel üzerinde her sindirilir plazmid 1:1, 1:5 ve 1:10 seyreltme çalıştıran belirleyin. Nicelikleme Bu tür genelde bir spektrometre okuma daha doğru. </li><li> DNA CG1-gerinim (ya da diğer singeneik suşu) içine enjeksiyon için 1M KCl 0,5 X TE 60ng/μL bir final konsantrasyon sulandırınız zebrafish embriyoları kullanarak 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: GFP. </li><li> Enjeksiyonlar önceden gösterilmiştir 12, 13 olarak yapılmalıdır. Kısacası, erkek ve kadın zebrafish çiftleşme odalarında bir gece önce enjeksiyon ayarlanır. Enjeksiyon gününde, DNA enjeksiyon iğnesi yüklenir, basınç 50μm çaplı bir kabarcık bir sahne mikrometre ile ölçülür, (30pg DNA) sınırdışı şekilde ayarlanır. Daha sonra, embriyolar DNA hücre içine yumurta sarısı içine enjekte ve tek hücreli aşamada enjekte edilir. Survival enjekte CG1 embriyoları ve larvaları, genellikle kötü ve sadece% 5 balık transgen başarıyla bir araya getirecek, bu yüzden&gt; 600 embriyolar bazı balık lösemi gelişecektir sağlamak için enjekte edilmelidir. </li><li> 28.5 ° C'de enjekte edilen embriyolar Mağaza ve 24 saat sonra ölü embriyolar kaldırmak. Hayvanlar daha sonra 5 gün yaşam büyük tanklara aktarılır ve daha önce 14 açıklandığı gibi kaldırdı. </li></ol> 2. Birincil T-ALL Zebra balığı larvaları için tarama <ol><li> Enjeksiyon sonrası yaklaşık 28 gün, bir petri balık sistem su 25ml 4NG / m Tricane-S 200μL ekleyerek larva zebrafish uyutmak. </li><li> T-ALL 485/20 bir dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresans (Şekil 1) tespit etmek için filtre kullanarak, 20X büyütme Epifloresans bir mikroskop kullanılarak floresan-etiketli larva gelişimi için inceleyin. </li><li> Negatif olanlar ayrı tümör pozitif larvaları. Negatif larvaları daha sonraki bir zaman noktasında muayene olabilir, bir kez tümörleri herhangi bir T-ALL olumlu balık cevapsız emin olmak için, daha büyük artış var olabilir. </li><li> Monitör T-ALL Epifloresans mikroskop kullanılarak tümör büyümesini izlemek için her hafta en az bir kez olumlu bir balık. </li></ol> 3. İzolasyon ve saflaştırma floresan etiketli birincil lösemi hücrelerinin <ol><li> GFP pozitif lösemi hücrelerinin&gt;% 50 hayvanın elinden almış, 9ml balık sistemi su içeren bir petri 4ng/mL Tricane-S 1ml ekleyerek balık kurban. </li><li> Balık hücreleri tampon% 5 fetal sığır serumu ile 1mL 0.9X PBS içeren yeni bir petri kabına yerleştirin. Bir jilet, pipetlemeyin büyük hücre kümeleri ayırmak karışımı ile balık ıslatarak yumuşatmak, sonra 50ml tüp içine 40μm mesh süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. Bu tek hücre içine bütün doku kümeleri ayırmak gerekli değildir. </li><li> 4ml polistiren tüp hücrelerinin pipetleyin 500μL. Ölü hücreleri etiket 1μL 1mg/ml propidium iyodür (PI), ekleyin. Vortex, daha sonra buz üzerinde hücreler tutun. </li><li> , Vahşi bir CG1 balık türü Kurban ıslatarak yumuşatmak ve toplam 50ml tüp 0.9X PBS transplant.Add 4ml% 5 FBS sırasında, tümör hücreleri için bir taşıyıcı olarak hizmet normal hücreleri toplamak için, yukarıdaki gibi aynı şekilde zorlanma 5 ml'lik bir hacim. </li><li> 96 plaka pipetlemeyin 100μL/well sonra, 0.9X PBS içinde% 5 FBS normal hücreleri, sulandırmak için 3x10 5 hücre / mL sayın. </li><li> Aşağıdaki dozlarda kan hücreleri içeren 96 plaka bir Floresan Aktive Hücre Sıralayıcısı (FACS), tür, GFP pozitif, PI negatif tümör hücreleri (Şekil 2A, B): 10 hücre / 48 kuyu, 100 hücre / kuyu içine 24 kuyu, 1000 hücre içine / 12 kuyu, ve 10.000 hücre içine / 6 kuyu içine. Ayrıca, 10.000 hücreleri normal kan hücrelerinin olmadan bir kuyunun içine sıralanmış ve tekrar analiz sıralanmış hücreleri saflık ve canlılığını değerlendirmek için (Şekil 2C) FACS kullanarak olmalıdır. </li></ol> 4. Yetişkin zebrafish seyreltme nakli sınırlandırılması <ol><li> Pelet 2000xg 96-iyi bir plaka 10 dakika santrifüj edilerek hücreleri. </li><li> Süpernatantı 95μL çıkarın ve kalan 5μL hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> Bir yetişkin (&gt; 60 gün) singeneik zebrafish ventral tarafta tutun, ve 26g / 2 "mikro şırınga kullanarak, periton boşluğuna hücre süspansiyonu enjekte. Zebra balığı nakli öncesi anestezi olmak zorunda değilsiniz. Tipik olarak, 45 balık, 10 lösemi hücreleri ile nakledilen, 20 ile 100 hücre nakledilen, 7, 1000 hücreleri ve 5 balık ile nakledilen 10.000 T-ALL hücreleri nakledilen. </li></ol> 5. Lösemi başlatan hücre frekans belirlemek için analiz <ol><li> Nakli yaklaşık 28 gün sonra, bir 485/20 dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresan tespit için filtre kullanarak bir epifluoresence mikroskop ile nakledilen balık inceleyin. Enjekte edilen balıkların toplam sayısı başına olumlu bir balık numarasını kaydedin. </li><li> Tekrar gözden geçirin 90 gün kadar her 14 günde bir balık ve pozitif balık sayısını kaydedin. Can çekişen bir tümör pozitif balık hale geldiğinde, Tricane-S aşırı doz hayvan kurban. </li><li> Şekil 3 boyutlu olarak gösterildiği gibi bir tabloya sonuçları, Giriş. Web tabanlı ELDA (Extreme sınırlandırılması Seyreltme Analizi) istatistiksel yazılım veri yükleme <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> tümör pozitif ve negatif hayvanların frekansı kullanır 15, birincil T-ALL içinde kendini sürekli yenileyen lösemi hücrelerinin sıklığını belirlemek için her doz nakli. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Singeneik balık embriyolara DNA mikroenjeksiyon genellikle 24 saat boyunca hayatta kalan embriyoların &lt;% 60 ile enjekte edilen embriyoların bir hayatta kalma oranı düşük sonuçları. Ayrıca, enjekte singeneik balık yaşam genellikle larva gelişimi sırasında, genellikle kötü &lt;% 20, 28 gün boyunca hayatta. T-ALL gelişecektir transgenik balık oluşturmak için çok sayıda embriyo enjekte bu nedenle önemlidir. Bir örnek olarak, CG1 gerginlik embriyolar rag2 enjekte edildi: cMyc + rag2: GFP. Transgenlerin GFP ifade her hücre cMyc ifade, böylece gelişmekte olan embriyonun co-ayırınız. Larva T-ALL 28 gün sonra (Şekil 1), ilköğretim için tarandı. Önceki iş enjekte balık yaklaşık% 5 (Şekil 1), timus içinde T-hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermiştir ve bu balıkların% 100, T-hücrelerinin dönüştürülmüş 11 olarak lösemi gelişecektir . Zebrafish küçük bir kısmı, 28. günde tespit etmek çok kolaydır, daha gelişmiş lösemi sahip olsa da, çoğu sadece bir GFP pozitif timus (Şekil 1) sahip olacak, böylece larva tüm olumlu sağlamak için yüksek büyütme altında tek tek incelenir olmalıdır balık seçilir. GFP pozitif T-ALL hücrelerinin&gt;% 50 hayvanın gün 45-70 arasında geçeceği tahmin ediliyor. Zebrafish verilen örnekte 65 gün yaşam kurban edildi ve lösemi hücreleri izole edildi ve FACS seyreltme nakli sınırlandırmak için sıralanır. Tek hücre propidium iyodür negatif ve GFP pozitif (Şekil 2) 96-plaka halinde sıralanır. Reanalysis canlılığı (ideal% 95) ve saflık değerlendirmek için 10.000 sıralanmış hücreleri üzerinde yapıldı (ideal&gt;% 92, Şekil 2). Nakledilen T-alls genellikle 28 gün önce ortaya çıkan, ancak bazı tümörler geliştirmek için 60 gün daha sürebilir. Bu örnekte bazı T-alls (Şekil 3C) periton boşluğu doldurmak için genişletilmiş olan, daha ilerledi iken, 28. günde, erken evre tümörler, enjeksiyon bölgesi (Şekil 3B) yakın GFP pozitif hücreler bir alan olarak görüldü . T-alls üç farklı ilköğretim seyreltme hücre nakli deneyleri sınırlayıcı elde edilen veriler Şekil 3 boyutlu olarak gösterilmiştir. Bu deneyler için, 220'den fazla hayvan, birkaç saat içinde tek bir kişi tarafından kolayca yapılabilir hangi, nakledilen. ELDA yazılımı kullanarak Veri analizi, ortalama 1 135 T-ALL hücreleri yayılan lösemi hücreleri (Şekil 3E), kendini sürekli yenileyen, o gösterdi. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Zebra balığı larvaları, bez ile tek hücreli aşamada enjekte:: cMyc + bez:-eGFP birincil lösemi büyüme için tarandı 28 gün sonrası enjeksiyon . Balık (*) T-hücrelerinin timus içinde GFP pozitif vardı; T-hücrelerinin zaman içinde dönüştürülmüş olarak bu balığın T-ALL gelişecektir. Bu aşama, 28 gün çok yaygın. Bir balık (**) gelişmiş bir T-ALL yumuşak doku içine yayıldı. Kalan iki balık tümör büyüme için olumsuz. 16x büyütme görüntü alındı. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 floresan etiketli T-ALL hücreler hastalıklı hayvanların sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme hücre nakli tayininde kullanıldı. Birincisi, bir kapı, tek hücreleri (sol üst panel) seçmek için çizilmiş oldu, sonra propidium iyodür negatif hücreler (orta sol panel) seçilir. Son olarak, bir kapı sadece GFP pozitif sıralama için lösemi hücrelerinin (sol alt panel) seçmek için çizilmiş oldu. Sıralama hücre nakli öncesi canlılığı ve saflık (sağ paneller) değerlendirmek için tekrar analiz edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Zebra balığı nakli 28 gün sonra lösemi büyüme yönünden incelendi. Fish ya tümör negatiffonlanır (A), (B) enjeksiyon yerinde büyüyen küçük bir tümör, ya da ilerlemiştir lösemi (C). 7X büyütme görüntüleri alınmıştır. Her seyreltme nakledilen balık toplam sayısı başına lösemi pozitif balık toplam sayısı (D) olarak kaydedilir. Veri sayısını hesaplamak için web tabanlı ELDA programına girdi, kendini sürekli yenileyen, lösemi hücrelerinin ve alt ve üst% 95 güven aralığı (E).

<ol><li>Zhou, B. -B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-initiating+cells%3A+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li>
<li>Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+human+stem+cells+by+repopulation+of+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice.</a> Stem Cells. 15, 199-207 (1997).</li>
<li>Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+limiting+dilution+experiments+with+generalized+linear+models+results+in+a+test+of+the+single-hit+Poisson+assumption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption.</a> J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Taylor, A. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Tumor+Assays%3A+The+State+of+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation.</a> Zebrafish. 6, 339-346 (2009).</li>
<li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).</li>
<li>Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantable+Tumor+Lines+Generated+in+Clonal+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish.</a> Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).</li>
<li>Smith, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li>
<li>Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Growth+Need+Not+Be+Driven+by+Rare+Cancer+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells.</a> Science. 317, 337-337 (2007).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Increasing+Complexity+of+the+Cancer+Stem+Cell+Paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm.</a> Science. 324, 1670-1673 (2009).</li>
<li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Edn. 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).</li>
<li>Ignatius, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+identifies+that+myf5%2B+embryonal+rhabdomyosarcoma-propagating+cells+are+dynamically+reorganized+during+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li>
</ol>

Kanser araştırma zebrafish kullanarak büyük bir gücü nispeten düşük maliyetle çok sayıda hayvan kullanılabilir olması. Bu nakledilen toplam sayısı tümörler gelişir nakledilen hayvanların oranlarda tümör başlatan hücre frekansı belirlemek için kullanılan seyreltme hücre nakli deneyleri, sınırlayıcı özellikle önemlidir. Burada sunulan yöntem, 70&#39;in üzerinde transplant hayvanlar yayılan tümör hücre sayısının doğru bir tahmin, analiz başına kullanılır. Faydalı nakli dozlarda kullanılan hayvanların sayısı ve tümör hücreleri nakledilen dozu her ikisi de belli bir kanser model için optimize edilmiş olmalıdır, örneğin, ilk deneylerde, tümör başlatılması hücreler nadirdir gösterirseniz, 100.000, 50.000, 10.000 ve kişi başına 1.000 hücreleri olabilir nakli. Singenik zebrafish suşları seyreltme analizi sınırlamada yararlı. Ancak, bu suşların henüz yaygın olarak tüm laboratuarlarda kullanılan ve bazı zebrafish kanser modelleri sadece allojenik balık mevcut değildir. Kendini sürekli yenileyen hücre frekans singenik zebrafish 8 kullanılmış olsaydı göre 10-100 kat daha yüksek olarak hesaplanmıştır olabilir, ancak sınırlandırılması seyreltme hücre transplantasyonu, bağışıklık ablasyon geçiren vahşi-tip suşlar yapılabilir . Bazı tümör hücreleri yabancı bir mikroçevresinin nakli hayatta olmaz gibi, hücrelerin daha yüksek dozlarda non-immün eşlemeli, ışınlanmış alıcıların içine nakli için kullanılması gerektiğini not etmek önemlidir. Ayrıca, alıcı hayvanın bağışıklık sistemi kurtarır 21 gün sonra birçok tümörde gerileme başlayacak, bu yüzden hayvanların her 7 gün nakli sonrası tümör büyüme için değerlendirilmelidir. Burada sunulan yöntemler herhangi bir zebrafish kanser modeli ile kullanım için uygundur ve şimdiye kadar belirlemek için kullanılır olmuştur tümör başlatılması T-hücreli akut lenfoblastik lösemi 8, ve solid tümör modeli, rabdomyosarkom 16 hücre frekansı . Bu tümörler floresan bir onkogen ve floresan işaretleyici hem de embriyo ko-enjeksiyon etiketli; DNA co-ayıran, onkogen ifade herhangi bir hücreyi, floresan proteini 17 ifade çünkü . Hayvan kurban etmek gerek kalmadan tümör büyümesini izleme kolaylaştırır ve FACS tümör hücreleri izole etmek için ileri düz bir yol sağlar çünkü floresan tavsiye edilir iken, kendi arıtma kolaylaştırmak için, tümör spesifik vericiler antikorlar ile tümör hücrelerinin etiket mümkün zebrafish da olsa antikor boyama optimizasyon gerekebilir. Son olarak, bir kez, tümör yayılan hücrelerinin sıklığı belirli bir tümör türü için tespit edilmiştir, bu testlerin kendi cep frekansını yöneten mekanizmaları tanımlamak için kullanmak mümkündür. Örneğin, seyreltme nakli ya da kendilerini uyuşturucu ile dozajlanarak olabilir nakledilen balık sınırlayan önce primer tümör hücrelerinin yolağı spesifik inhibitörleri ile tedavi edilebilir. Ayrıca, tümörler kendilerini genetiği sonucunda primer tümör gen-express böylece, tek hücreli bir sahne balık ilgi bir gen enjekte ederek manipüle olabilir. Bu deneylerde, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı üzerinde herhangi bir etkisi sınırlayıcı seyreltme testleri görülecektir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Noti restriksiyon enzimi </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform </td><td> EMD Biyokimyasallar </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> 5M KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Yüksek Menzil DNA merdiveni </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singenik zebrafish </td><td></td><td> Referanslar 6-8 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidium İyodür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26g / 2 &quot;mikroenjektör </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μm örgü hücre süzgeç </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

singenik zebra balığı tümör propaganda hücreler frekans miktarının sınırlandırılması seyreltme hücre transplantasyonu

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Kendini sürekli yenileyen kanser hücrelerinin tümör büyümesini teşvik etmek için sınırsız bir yeteneğe sahip bir tümör içinde tek hücre tipleri, ve böylece yayılan tümör hücreleri veya tümör başlatan hücreleri olarak bilinir. Bu, hastanın prognozu 1 büyük ölçüde geliştirerek, bu yıkımı için kendini sürekli yenileyen hücreleri hedef tümörün ilerlemesini engellemek ve nüks durdurmak olacağı düşünülmektedir. Sıklığını belirlemek için en yaygın yolu kendi kendini yenileyen bir tümör hücreleri içinde artan dozlarda alıcı hayvanlar tümör hücreleri nakledilen bir sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testi tümörler gelişir hayvanların oranı sayısını hesaplamak kullanılır kendi kendini yenileyen hücreler içinde orijinal tümör örneği, 2, 3 . İdeal olarak, çok sayıda hayvan doğru yayılan tümör hücreleri, sıklığını belirlemek için her sınırlayıcı seyreltme deneyde kullanılacak. Ancak, büyük ölçekli deneyler fareler içeren pahalı ve en sınırlayıcı seyreltme testleri Deneme başına sadece 10-15 fareler kullanır. Zebra balığı, genetik manipülasyon ve büyük ölçekli deneyler yapılabilir hangi ekonomi kendi kolaylığı nedeniyle büyük bir kısmı, bir kanser model olarak önem kazanmıştır. Ayrıca, zebrafish modellenir kanser türleri kendi meslektaşı insan hastalığı 4 yakından taklit olduğu tespit edilmiştir. Alıcı hayvanların alt öldürücü ışınlama, 21 gün sonra bağışıklık sisteminin yenilenme başka bir balık tümör hücrelerinin nakli için mümkün olsa da genellikle tümör regresyonu 5 neden olur. Singeneik zebrafish son yaratılması tümör nakli çalışmaları büyük ölçüde 6-8 kolaylaştırmıştır . Bu hayvanlar sağlam alıcı balık, ve tümör büyüme içine genetik olarak aynı, nakledilen tümör hücreleri aşılamak olduğundan uzun süre üzerinden takip edilebilir. Singenik zebrafish, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı 9, 10 hafife bir yabancı mikroçevresinin büyüme, uyum sağlamak zorunda değilsiniz, bu tümör hücrelerinin seyreltme nakli deneyleri sınırlandırmak için idealdir. Ayrıca, tek hücre nakli başarıyla kendini sürekli yenileyen hücre sıklığı daha doğru bir tahmin sağlamak için hizmet, her ikisi de, kolay ve ekonomik bir kerede transplante edilebilir singeneik zebrafish 8 ve birkaç yüz hayvanlar, kullanarak tamamlanmıştır . Burada singeneik zebrafish ilköğretim floresan etiketli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) oluşturma ve kendini sürekli yenileyen hücre sıklığını belirlemek için bu tümörler erişkin balık seyreltme sınırlayıcı nakli için bir yöntem sunulmuştur. Lösemi bir örnek olarak verilmiştir iken, bu protokolü, zebrafish herhangi bir kanser modeli kullanılarak yayılan tümör hücreleri sıklığını belirlemek için uygundur.

Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Kendi kendini yenileyen kanser hücreleri, bir tümör içindeki tümör büyümesini teşvik etme konusunda sınırsız yeteneğe sahip olan tek hücre tipleridir ve bu nedenle ... olarak bilinirler.

Sınırlayıcı dilüsyon hücre transplantasyon deneyi, deneysel hayvan modellerinde kendi kendini yenileme potansiyelini değerlendirmek için altın standarttır. Bu gösterimde, floresan işaretli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi geliştirecek transgenik zebra balıkları oluşturmak için tek hücre evresindeki sinjenik zebra balığı embriyolarına rag two MIC ve RAG two GFP enjekte edilir. Yaşamın 60. gününe gelindiğinde, birincil lösemi hücreleri zebra balıklarından izole edilir ve ardından floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemi kullanılarak saflaştırılır.Ardından, hücreler sınırlayıcı dilüsyon ile yetişkin zebra balıklarının peritonal boşluğuna nakledilir ve balıklar 90 güne kadar tümör büyümesi açısından izlenir. Son olarak, orijinal tümör içindeki lösemi yayan hücrelerin frekansını belirlemek için ekstrem sınırlayıcı dilüsyon analizi istatistik yazılım programı kullanılır. Sınırlayıcı dilüsyon hücre nakli analizi, araştırmacıların tümör kitlesinin bütününde bulunan kendini yenileyen hücre sayısını doğru bir şekilde değerlendirmesine olanak tanır.Kanser oluşumunu tetikleyen ve nihayetinde nükslerden sorumlu olanlar bu kendini yenileyen hücrelerdir. Zebra balığı modelinde sınırlayıcı dilüsyon transplantasyon analizleri yapmanın temel avantajı, her deney için birçok balığa transplantasyon yapılabilmesidir; bu da kendini yenileyen tümör yayan hücrelerin frekansını belirlerken daha yüksek bir kesinlik sağlar. Bu yöntem, T-hücreli akut lenfoblastik lösemideki tümör yayan hücrelere dair bilgi sunar.Bu yöntem, diğer zebra balığı kanser modellerini anlamak için de uygulanabilir. Laboratuvar araştırmacısı Jessica Blackburn ve yetenekli teknisyen Sally Liu, bugün prosedürü size uygulamalı olarak gösterecekler. Rag2 CM ve RAG2-GFP DNA konstrüktlarını lineerize etmek için, her bir plazmidin 10 µg'ını NotI restriksiyon enzimi ile 37 °C'de gece boyunca sindirin. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesinin ardından, her bir plazmidi 20 µL su içerisinde süspande edin.Sindirilmiş her bir plazmidin bire bir, bire beş ve bire 10 seyreltmelerini, 20 microliters, 10 microliters ve beş microliters yüksek aralıklı DNA merdiveni ile birlikte %1'lik agaroz jelde çalıştırarak DNA konsantrasyonlarını belirleyin. Şimdi, CG one strain syngen'e enjekte edilmek üzere DNA'yı 60 nanograms per microliter nihai konsantrasyona seyreltin. Zebrafish embriyolarına 250 nanoliters 30 nanograms per microliter rag two CM ve 30 nanograms per microliter enjekte edin.İki GFP'yi, DNA'yı doğrudan hücreye, sarı keseye değil olacak şekilde dikkatle hedefleyerek tek hücre evresindeki zebrafish embriyolarına enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları 28.5 °C'de saklayın ve 24 saat sonra ölü embriyoları uzaklaştırın; beş günlük yaşam süresinin sonunda, enjeksiyondan yaklaşık 28 gün sonra hayvanları büyük tanklara aktarın. Bir Petri kabındaki 25 mL balık sistem suyuna 200 µL 4 ng/mL trica S ekleyerek larval zebrafish'leri anestezi edin.GFP floresansını tespit etmek için bir epi-floresan mikroskobu kullanarak larvaları floresan işaretli TALL gelişimi açısından inceleyin. Analizde hiçbir lösemili balığın atlanmadığından emin olmak için tümör pozitif larvaları negatif olanlardan ayırın. Negatif larvalar, tümörlerin daha fazla büyümüş olabileceği daha sonraki bir zaman noktasında tekrar incelenebilir. Tümör büyümesini takip etmek için floresan işaretli lösemili balıkları epi-floresan mikroskobu kullanarak haftada en az bir kez izleyin.GFP pozitif lösemi hücreleri hayvanın %50'sinden fazlasını kapladığında, balığı sakrifiye etmek için dokuz mililitre balık sistem suyu içeren bir Petri kabına bir mililitre dört nanogram/mililitre Trica S ekleyin; ardından balığı, 0.9 XPBS içinde %5 fetal bovine serum içeren bir mililitre çözelti bulunan yeni bir Petri kabına yerleştirin, balığı bir jiletle masere edin ve büyük hücre kümelerini dağıtmak için karışımı pipetleyin. Son olarak, hücreleri 40 µm'lik bir ağ süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hücrelerden 500 µL'yi dört mililitrelik bir polistiren tüpe pipetleyin. Ölü hücreleri işaretlemek için 1 mg/mL konsantrasyonunda 1 µL peridinyum iyodür ekleyin, vorteksleyin ve ardından hücreleri buz üzerinde muhafaza edin. Ayrıca, transplantasyon sırasında tümör hücreleri için taşıyıcı görevi görecek normal kan hücrelerini toplamak amacıyla, 50 mililitrelik tüpe toplam hacim beş mililitre olacak şekilde 0.9 X PBS içinde %5 FPS'den 4 mL ekleyerek bir wild type CG1 balığı hazırlayın.Normal kan hücrelerini 0.9 x pbs içinde %5 FBS ile mililitre başına 3 x 10⁵ hücre olacak şekilde seyreltin ve ardından bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 100 µL pipetleyin. Floresan aktive hücre ayıklayıcı (FACS) kullanarak, GFP pozitif PI negatif tümör hücrelerini, belirtilen dozlarda kan hücreleri içeren 96 kuyucuklu plakaya ayıklayın. Ek olarak, normal kan hücresi bulunmayan bir kuyucuğa 10.000 hücre ayıklayın ve ayıklanan hücrelerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için FACS ile yeniden analiz edin. Hücreleri çöktürmek için 96 kuyucuklu plakayı 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatandan 95 µL uzaklaştırın ve hücreleri kalan 5 µL içerisinde tekrar süspande edin. Hücre süspansiyonunu, 26,5 gauge bir mikro şırınga kullanarak 60 günden büyük yetişkin syngeneic zebra balıklarının periton boşluğuna enjekte edin. Transplantasyon öncesinde zebra balıklarının anesteziye alınmasına gerek yoktur.Transplantasyonun yaklaşık 28 gün sonrası; 45 balığa 10 lösemi hücresi, 20 balığa 100 hücre, yedi balığa 1000 hücre ve beş balığa 10,000 TALL hücresi nakledin. GFP floresansını tespit etmek için alıcı zebra balıklarını, 4 85 20 eksitasyon dalga boyu ve 5 30 25 emisyon filtresi kullanarak bir epifloresan mikroskop ile inceleyin.Enjekte edilen toplam balık sayısına oranla pozitif balık sayısını kaydedin. Balıkları 90 güne kadar her 14 günde bir yeniden inceleyin ve pozitif balık sayısını kaydedin. Tümör pozitif balıklar daha yaygın hale geldiğinde.Hayvanı trica US aşırı dozu ile sakrifiye edin, sonuçları bir tabloya girin ve primer TALL CG one suşu içindeki kendini yenileyen lösemi hücrelerinin frekansını belirlemek için verileri web tabanlı ekstrem sınırlayıcı dilüsyon analiz yazılımına yükleyin; embriyolar RAG two cmic ile enjekte edilmiş ve RAG two GFP larvaları primer TALL için taranmıştır. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, 28 gün sonra enjekte edilen balıkların yaklaşık %5'inin timusunda GFP pozitif T hücreleri bulunur ve bu balıkların %100'ünde lösemi gelişir. Burada, floresanla işaretlenmiş TALL hücreleri 65 günlük hasta hayvanlardan ayrıştırılmış ve sınırlayıcı dilüsyon hücre transplantasyon analizinde kullanılmıştır. İlk olarak, tek hücreleri seçmek için bir kapı (gate) çizilmiştir.Ardından propidyum iyodür negatif hücreler seçildi. Ve son olarak, ayıklama işlemi için yalnızca GFP pozitif lösemi hücrelerini seçmek amacıyla bir kapı (gate) çizildi. TALL nakledilmiş balıkların 28. günündeki bu örneğinde, erken evre tümörler enjeksiyon bölgesinin yakınındaki GFP pozitif hücre alanları şeklinde görüldü.Bazı TLS'ler bu deneyler için periton boşluğunu dolduracak şekilde genişleyerek daha fazla ilerlemiş olsa da, tek bir kişi tarafından birkaç saat içinde kolayca gerçekleştirilebilen bir işlemle 220'den fazla hayvana transplantasyon yapılmıştır. elda yazılımı kullanılarak yapılan veri analizi, ortalama her 135 T tüm hücresinden birinin kendi kendini yenileyebilen lösemi yayıcı hücre olduğunu göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücrelerinin sınırlayıcı dilüsyonla syngenetic zebra balıklarının periton boşluğuna nasıl transplant edileceği ve elde edilen verilerin belirli bir tümör içindeki tümör yayıcı hücrelerin frekansını belirlemek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanıldığı daha ileri çalışmalar, bu tümör yayan hücrelerin kendi kendini yenilemesini yöneten mekanizmaların belirlenmesine yardımcı olabilir.

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, in vivo tümör oluşumunu değerlendirmek ve terapötik ajanların etkisini incelemek için zebra balığı ksenogreft testi açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Ksenogreft Testi: Zebra Balığı İn Vivo Tedavisinde Terapötiklerin Tümörojenite Üzerine Anti-kanser Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Burada, zebra balığı iskelet kası ve embriyonal rabdomiyosarkomun (ERMS) erişkin bağışıklık sistemi baskılanmış rag2E450fs homozigot mutant zebra balığına hücre nakli için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, kas hücrelerinin rejenerasyonu ve malign dönüşümünün verimli bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Preklinik modeller, kanser biyolojisi bilgisini ilerletmeyi ve tedavi etkinliğini öngörmeyi amaçlamaktadır. Bu yazıda, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftlerin (zPDX'ler) tümör doku fragmanları ile üretilmesi açıklanmaktadır. zPDX'ler, terapötik etkisi nakledilen dokunun hücre apoptozu açısından değerlendirilen kemoterapi ile tedavi edildi.

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.

Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini

Keşfedin sınırlayıcı seyreltme hücre transplantasyonu yöntemiyle Danio rerio'da lösemi yayıcı hücrelerin sıklığını belirleme tekniğini. Bu protokol kanser araştırmalarında tümör biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Daha fazla video keşfet