Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testi, deney hayvanı modellerinde kendini yenileme potansiyelini değerlendirmek için altın standarttır. Bu gösteride, floresan olarak işaretlenmiş T hücreli akut lenfoblastik lösemi geliştirecek transgenik zebra balığı oluşturmak için bir hücre evresi sinjeneik zebra balığı embriyosuna rag iki MIC ve RAG iki GFP enjekte edilir. 60 günlük yaşamda, birincil lösemi hücreleri zebra balığından izole edilir ve daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması kullanılarak saflaştırılır.

Daha sonra, hücreler yetişkin zebra balığının periton boşluğuna sınırlayıcı seyreltme ile nakledilir ve balıklar 90 güne kadar tümör büyümesi açısından izlenir. Son olarak, orijinal tümör içindeki lösemi yayan hücrelerin sıklığını ölçmek için aşırı sınırlayıcı seyreltme analizi istatistiksel yazılım programı kullanılır. Seyreltme hücre nakli analizinin sınırlandırılması, araştırmacıların tümör kütlesinin kütlesi içinde bulunan kendi kendini yenileyen hücrelerin sayısını doğru bir şekilde değerlendirmesini sağlar.

Kanser oluşumunu yönlendiren ve nihayetinde nüksetmekten sorumlu olan bu kendi kendini yenileyen hücrelerdir. Zebra balığı modelinde sınırlayıcı seyreltme transplantasyon deneyleri yapmanın temel avantajı, her deney için birçok balığın nakledilebilmesidir, bu da kendi kendini yenileyen tümör çoğalan hücrelerin sıklığını belirlerken daha iyi hassasiyet sağlar. Bu yöntem, akut lenfoblastik bir lösemi olan T hücresindeki tümör yayıcı hücreler hakkında bilgi sağlar.

Diğer zebra balığı kanser modellerini anlamak için de uygulanabilir. Laboratuvarda çalışan Jessica Blackburn ve yetenekli bir teknisyen olan Sally Liu, bugün sizin için prosedürü gösterecek Rag iki CM ve RAG iki G-F-P-D-N-A Yapılarını doğrusallaştırmak için her bir plazmitin 10 mikrogramını restriksiyon enzimi ile sindirir, bir gecede 37 santigrat derecede bir tane değil. Fenil kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesinden sonra, her bir plazmiti 20 mikrolitre suda süspanse ediyoruz.

Yüksek aralıklı bir DNA merdiveninin 1 mikrolitre, 10 mikrolitre ve beş mikrolitresi ile sindirilmiş her bir plazmitin bire bir, bir ila beş ve bir ila 10 seyreltmesini çalıştırarak% 1'lik bir tarımsal jel üzerindeki DNA konsantrasyonlarını belirleyin. Şimdi DNA'yı, CG bir suş singenine enjeksiyon için mikrolitre başına 60 nanogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Bir zebra balığı embriyosu, mikrolitre başına 250 nanolitre 30 nanogram, bez mikrolitre başına iki CM ve 30 nanogram enjekte eder.

İki GFP'yi bir hücre aşamasına birleştirin, zebra balığı embriyoları, DNA'yı yumurta sarısına değil, doğrudan hücreye dikkatlice hedefleyin. Enjekte edilen embriyoları 28.5 santigrat derecede saklayın ve ölü embriyoları 24 saat sonra beş günlük yaşamda çıkarın, hayvanları enjeksiyondan yaklaşık 28 gün sonra büyük tanklara aktarın. Bir Petri kabında 25 mililitre balık sistemi suyuna mililitre trica S başına 200 mikrolitre dört nanogram eklenerek larva zebra balığı uyuşturulmuştur.

GFP floresansını tespit etmek için bir epi floresan mikroskobu kullanarak floresan etiketli TALL gelişimi için larvaları inceleyin. Analizde hiçbir lösemik balığın kaçırılmamasını sağlamak için tümör pozitif larvaları negatif olanlardan ayırın. Negatif larvalar, tümörler büyüdükten sonra daha sonraki bir zaman noktasında incelenebilir: Tümör büyümesini izlemek için epi floresan mikroskobu kullanarak haftada en az bir kez floresan etiketli lösemik balıkları izleyin.

GFP pozitif lösemi hücreleri hayvanın% 50'sinden fazlasını ele geçirdiğinde, mililitre başına dört nanogramdan bir mililitre ekleyin. Balıkları kurban etmek için dokuz mililitre balık sistemi suyu içeren bir Petri kabına Trica S, balığı 0.9 XPBS'de bir mililitre% 5 fetal sığır serumu içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin, balığı bir tıraş bıçağıyla yumuşatın, karışımı pipetleyin büyük hücre kümelerini ayırmak için. Daha sonra hücreleri 40 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe geçirin.

Hücrelerin 500 mikrolitresini dört mililitrelik bir polistiren tüpe pipetleyin. Mililitre başına bir miligramın bir mikrolitresi, ölü hücrelerin girdabını etiketlemek için peridyum iyodür ekleyin, ardından hücreleri buz üzerinde tutun. Ayrıca, toplam beş mililitre hacim için 50 mililitrelik tüpe 0.9 X PB S'de dört mililitre% 5 FPS'de nakil sırasında tümör hücreleri için bir taşıyıcı görevi gören normal kan hücrelerini toplamak için vahşi bir CG bir balık hazırlayın.

Normal kan hücrelerini sayın, 0.9 x pbs'de% 5 FBS'de mililitre başına 10 ila beşinci hücreye üç kez seyreltin, daha sonra floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralayıcı kullanarak 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 100 mikrolitre pipetleyin, GFP pozitif PI negatif tümör hücrelerini belirtilen dozlarda kan hücrelerini içeren 96 oyuklu plakaya sıralayın. Ek olarak, 10.000 hücreyi normal kan hücreleri olmayan bir kuyuya sıralayın ve sıralanan hücre santrifüjünün saflığını ve canlılığını değerlendirmek için gerçekleri kullanarak yeniden analiz edin. Hücreleri peletlemek için 2000 GS'de 96 kuyulu plaka 10 dakika bekletilir.

Snat'ın 95 mikrolitresini çıkarın ve kalan beş mikrolitredeki hücreleri yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, 26 buçuk gauge mikro şırınga kullanarak 60 günlükten daha eski yetişkin sinjeneik zebra balığının periton boşluğuna enjekte edin. Zebra balığının nakilden önce uyuşturulması gerekmez.

Nakilden yaklaşık 28 gün sonra 10 lösemi hücreli 45 balık, 100 hücreli 20 balık, 1000 hücreli yedi balık ve 10.000 TALL hücreli beş balık nakli. Alıcı zebra balığı 4 85 20 uyarma dalga boyu ve 5 30 25 emisyon filtresi kullanılarak epi floresan mikroskobu ile incelendi. GFP floresansını tespit etmek için.

Enjekte edilen toplam balık sayısı başına pozitif balık sayısını kaydedin. Balıkları her 14 günde bir 90'a kadar tekrar inceleyin ve pozitif balık sayısını kaydedin. Bir tümör pozitif balık daha bol hale geldiğinde.

Hayvanı trica US doz aşımı ile sakrifiye edin, sonuçları bir tabloya girin ve verileri primer TALL içindeki kendi kendini yenileyen lösemi hücrelerinin sıklığını belirlemek için web tabanlı aşırı sınırlayıcı seyreltme analiz yazılımına yükleyin. Bir suş embriyolarına RAG iki cmic ve RAG iki GFP larvası enjekte edildi Önceki çalışmalarla tutarlı olarak 28 gün sonra primer TALL için tarandı, Enjekte edilen balıkların yaklaşık% 5'i timüslerinde GFP pozitif T hücrelerine sahiptir ve bu balıkların% 100'ünde lösemi gelişecektir. Burada, floresan işaretli TALL hücreleri 65 günlük hastalıklı hayvanlardan ayrıldı ve sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testinde kullanıldı. İlk olarak, tek hücreleri seçmek için bir yürüyüş çizildi.

Daha sonra propidyum iyodür negatif hücreler seçildi. Ve son olarak, sıralama için sadece GFP pozitif lösemi hücrelerini seçmek için bir yürüyüş çizildi. 28. günde nakledilen TALL balıklarının bu örneğinde, erken evre tümörler, enjeksiyon bölgesinin yakınında GFP pozitif hücrelerin bir alanı olarak görüldü.

Bazı TLS'ler daha ilerlemiş olsa da, bu deneyler için periton boşluğunu doldurmak için genişledikten sonra, 220'den fazla hayvan nakledildi ve bu da birkaç saat içinde bir kişi tarafından kolayca gerçekleştirilebilir. Elda yazılımı kullanılarak yapılan veri analizi, ortalama olarak 135 T'de bir hücrenin tüm hücrelerin kendi kendini yenileyen lösemi yayan hücreler olduğunu gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, singenetik zebra balığının periton boşluğuna sınırlayıcı seyreltmede tümör hücrelerinin nasıl nakledileceğini ve elde edilen verilerin belirli bir tümör içindeki tümör yayıcı hücrelerin sıklığını belirlemek için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Genetiği değiştirilmiş hayvanları kullanan daha ileri çalışmalar, bu tümör yayıcı hücrelerin kendini yenilemesini yöneten mekanizmaların belirlenmesine yardımcı olabilir.