Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo Genleşme

Bu prosedürün genel amacı, adoptif immünoterapide potansiyel kullanım için insan antijenine özgü CTL'nin ex vivo genişlemesi için yapay antijen sunan hücreler veya bir A PC kullanmaktır. Bu, önce HLA A iki IG ve anti-insan CD 28 monoklonal antikorun manyetik dyna boncuklarına konjuge edilmesiyle gerçekleştirilir ve A A PC yapar. Prosedürün ikinci adımı, A A PC'nin kalite kontrolünü ve peptit yüklemesini gerçekleştirmektir. Prosedürün üçüncü adımı, insan periferik kan CD'si sekiz pozitif T hücresini izole etmektir. Prosedürün son adımı, CD sekiz pozitif T hücresini bir hafta boyunca bir A PC ile inkübe etmektir.

CTL daha sonra kullanılmadan önce hasat edilir ve karakterize edilir veya istenen özgüllük ve genişleme seviyesine ulaşmak için bir hafta daha yeniden uyarılır. Sonuç olarak, A A PC varlığında genişleyen CTL'nin artmış bir antijen özgüllüğüne sahip olduğunu gösteren teum veya boyama sonuçları elde edilebilir. Bugün size HI IG tabanlı bir PC sistemi göstereceğim ve bu sistemin CMV'ye özgü insan CTL exvivo'yu diğer mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında verimli bir şekilde genişletmek için nasıl kullanılacağını göstereceğim.

A A PC teknolojimiz birçok önemli avantaj sunar. Rafta mevcut, sınırsız miktarda ve diyelim ki tüm HRAA iki pozitif bağışçıları için bir PC kullanılabilir. Tamam, başlayalım Yaklaşık 400 milyon boncuktan oluşan bir stoktan bir mililitre M dört 50 epoksi boncuk steril bir vidalı cam eğeye aktarın.

Boncukları bir mililitre boid tampon ekleyerek bir kez yıkayın ve ardından boncuklar şişenin yan tarafına yapıştırılırken cam şişeyi bir dyin all magnet NBC one'a yerleştirin. Snat aspirasyon Resus'u ile çıkarın. Boncukları, boid tampon HLA A, iki IG dimer ve anti-insan CD 28 monoklonal antikoru karışımı içinde askıya alın.

Daha sonra proteinden boncuk konjugasyonunu kolaylaştırmak için, cam şişeyi 24 saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü üzerinde döndürün. Ardından, tüpü bir MPC bir mıknatısa yerleştirin ve tüm borat tamponunu çıkarın. Tampon çıkarıldıktan sonra, boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Şimdi boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponunda inkübe edin ve boncuklar üzerindeki artık protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için şişeyi 24 saat daha dört santigrat derecede döndürün. Ardından tamponu cam şişeden çıkarın ve bir mililitre taze boncuk yıkama tamponu ile değiştirin. 100 mikrolitre faks yıkama tamponunu faks tüplerine aktarın ve ardından beşinci boncuklara beş kez 10 ekleyin.

Dört santigrat derecede 20 dakika boyadıktan sonra boncukları bir mikrolitre anti muse IgG, bir PE ve bir mikrolitre anti muse IgG iki fit ile boyayın. Boyama numunelerinin her birine üç mililitre faks yıkama tamponunda. Ardından, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 Gs'de harcayarak A A PC'yi peletleyin.

Reus, A A PC'yi yeni faks tamponunda askıya alır ve boyama sonucunu hemen akış sitometresi ile okur. Boncukları daha önce olduğu gibi steril PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, boncukları 10 mikrolitre CMV peptidi ile yükleyin.

Boncukları hemo sitometre ile sayın ve ardından boncukların tarihi ve konsantrasyonu ile etiketleyin. Mililitre başına boncuk olarak. A, A, PC'yi peptit ile en az üç gün boyunca dört santigrat derece santrifüjleyin, bir HLA A iki pozitif donörden yaklaşık 100 mililitre taze periferik kanı, 10 sodyum heparin vakutainer tüpünde, 300 G'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında, üst plazma tabakasını aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Toplanan plazmayı steril PBS ile değiştirin ve kanı steril bir T 75 kültür şişesine aktarın. Tüm kan 15 mililitre fial pakette ve dört adet 50 mililitrelik konik tüpte toplandıktan sonra pipetleyerek kanı ve PBS'yi iyice karıştırın.

Her tüpteki fialin üzerine 30 ila 35 mililitre kan hücresini yavaşça yerleştirin. Fial ve kan hücreleri arasındaki arayüzü farklı tutarak, kan ve fial gradyanı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 GS'de santrifüjleyin, kopma ve ivme mümkün olduğunca düşük, spin sonrası katmanlar arasında net bir arayüz sağlamak için üst plazma katmanını aspire edin ve ardından PBMC katmanını dikkatlice aspire etmek için serolojik bir pipet kullanın. Tüm PBMC'ler hücrelere 30 mililitre PBS'de hasat edildiğinde, PBMC'yi 50 mililitrelik taze bir konik tüpe aktarın ve santrifüjleyin.

Sonra, süpernatı atın ve peleti yıkayın. Artık fi çağrısını çıkarmak için 30 mililitre PBS ile bir kez daha karıştırın, ardından bir Milton İnsan CD'si sekiz pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanarak CD sekiz pozitif T hücresi popülasyonu için zenginleştirin. Üreticinin protokolüne göre, CD'yi sekiz pozitif T hücresi sayın ve faks analizi ile saflığı onaylayın.

Sekiz mililitre T hücresi büyüme faktörü, iki x kültür ortamı artı sekiz mililitre tam RPMI ortamında 1 milyon CTL'yi askıya alın ve altı A A PC karışımından bir kez 10 ekleyin. Daha sonra, 96 oyuklu U alt doku kültürü plakasına oyuk başına 160 mikrolitre hücre kaplamak için çok kanallı bir pipet kullanın. Hücreleri yedi gün boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hücreleri dördüncü günde, T hücresi büyümesinin kuyusu başına 80 mikrolitre ile besleyin. Faktör iki x kültür ortamı. Hücreleri yedinci günde hasat edin ve daha sonra tüm boncuklar şişenin duvarına yapıştığında eski A A PC'yi çıkarmak için hücreleri mıknatısa karşı yerleştirin.

Hücreleri toplayın ve başka bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve hücre sayısını sayın. Üreticinin protokolüne göre tetramer boyama ile A A PC'nin antijen özgüllüğünü belirleyin. Antijen özgüllüğüne artan hücre sayıları oluşturmak için hasat edilen hücreleri aynı koşullar altında yeni A A A PC ile tekrar oynatın.

İşte bir haftalık kültürden sonra A A PC tarafından üretilen CMV'ye özgü CTL'nin temsili bir tetramer boyama sonucu. Burada, A-A-P-C-C-M-V özgüllüğü ile oluşturulan CMV spesifik CTL'nin temsili bir hücre içi sitokin boyama sonucu gösterilmiştir, tetramer boyama ile %61 idi. Bu yöntem, optimal kültürel koşulları ve T hücresi fonksiyonel modülasyonu için gereksinimleri nasıl tanımlayabileceğimiz gibi T hücresi alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Lowly yöntemi, viral hastalıkların tedavisine ilişkin içgörüler sağladı. Kanser gibi diğer alanlara da uygulanabilir.