Name: Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo Genleşme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin HLA A2-Ig tabanlı yapay antijen sunan hücreler kullanarak insan sitotoksik T lenfositlerini verimli bir şekilde genişletme yöntemini. Bu teknik, adoptif immünoterapi uygulamaları için antijene özgü T hücreleri üretmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Aaron Selya yararlı tartışma için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, JS, MO bir pilot hibe ve Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü, Savunma hibe PC 040.972 Departmanı, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe AI29575, CA108835, AI077097 tarafından desteklenen

1. , HLA-A2-Ig tabanlı aAPC <ol><li> Steril borat tamponu hazırlayın <ol><li> Borik asit, 0.1M yapmak için suda çözülür. PH 7.0 'ye ayarlayın. </li><li> Filtre 0.22μm steril bir filtre ve mağaza üzerinden 4 ° C </li></ol></li><li> Steril Boncuk Yıkama tamponu hazırlayın <ol><li> 956ml PBS w / o magnezyum veya kalsiyum alın. </li><li> 30ml insan AB serum ekleyin. </li><li> EDTA 2mm son konsantrasyon ekleyin. </li><li> 0.1gsodium azid ekleyin. </li><li> 0.22 mikron steril filtre ve mağaza süzülür 4 ° C </li></ol></li><li> , Stok, yaklaşık 400 milyon boncuk (boncuk hemasitometre sayılabilir) 1ml Invitrogen M-450 Epoksi boncuk alın, ve steril, vida top cam flakon koymak. </li><li> Boncuklar flakonun tarafına bağlı ise, bir Dynal mıknatıs MPC-1 karşı flakon koyun, aspirasyon ile süpernatantı çıkarın. Boncuk, borat tamponu 1ml ile bir kez yıkayın. </li><li> 1 ml borat tamponu ve HLA-A2-Ig dimer ve anti-insan CD28 mAb (Klon 9.3) 20 mg 20 mg bir karışımı süspanse edin boncuk. </li><li> Boncuk konjugasyon Protein: Rotator Cam şişe koymak ve 4 döndürmek ° C 24 saat. </li><li> MPC-1 mıknatıs tüp yerleştirin ve tüm borat tamponu çıkarın. </li><li> Boncuklar iki kez 1ml Boncuk Yıkama tamponu ile yıkayın. </li><li> 1ml Boncuk Yıkama tamponu boncuk inkübe, 4 döndürmek ° C 24 saat boyunca. Boncuk Yıkama tampon insan AB serum içerdiğinden, boncuklar üzerinde kalan protein bağlanma yeri engeller. </li><li> Cam şişeden süpernatantı 1ml taze Boncuk Yıkama tamponu ile değiştirin. </li></ol> 2. Kalite kontrol aAPC ve peptid yükleme, depolama <ol><li> FACS tüpler tampon yıkama 100μl FACS ~ 5 × 10 5 boncuk ekleyin ve anti-fare IgG1-PE 1μl (HLA-A2-Ig Fc bölümünü tanımaz) ve anti-fare IgG2a-FITC 1μl (tanımak leke anti-CD28 mAb Fc parçası). 20 dakika boyunca tampon yıkama FACS boyama sonra, akış sitometresinin (Şekil 4) hemen boyama sonucu tekrar yıkayın ve okuyun. </li><li> Boncuklar üzerine Peptid yükleme: 1 ml steril PBS ile cam flakon boncuklar iki kez yıkayın. 1ml steril PBS ile süspanse edin sonra CMV peptid (1mg/ml) 10μl eklemek </li><li> Hemasitometre boncuk sayın ve tarih ve konsantrasyon ile, tüp etiketi. </li><li> aAPC HLA-A2-Ig dimer üzerine peptid bağlama yeterli zaman tanımak için en az 3 gün, 4 peptid inkübasyon ° C, sonra kullanıma hazır. Boncuk 4 saklanabilir ° C ve en az 6 ay süreyle işlevsel kalır. </li></ol> 3. İnsan CTL izolasyon <ol><li> 10 BD Sodyum Heparin Vacutainer tüpler içine sağlıklı HLA-A2 pozitif vericiden ~ 100 ml taze periferik kan toplayın. 21-gauge iğne veya hemoliz önlemek için büyük kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 300xg santrifüjleyin </li><li> Aspirasyon üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın. Plazma kültür ortamı için ek olarak kullanılabilir. </li><li> Steril PBS ile toplanan plazma değiştirin ve steril bir T75 kültür şişelerinde veya 50ml konik tüpler içine kan transferi. Yukarı ve aşağı pipetleme kan PBS ile karıştırın. </li><li> Bir kez tüm kan toplanır, dört ek 50ml konik tüpler hazırlamak ve Ficoll-Paque Plus 15ml ekleyin. </li><li> Yavaş yavaş bindirme Ficoll her tüpün üstüne kan hücreleri 30-35ml. Ficoll ve kan hücreleri arasında arayüz ayrı tutun. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika 500xg santrifüjleyin. Fren "kapalı" ve katmanları arasında açık bir arayüz sağlamak için mümkün olduğunca düşük ivme açın. </li><li> Seriological pipet kullanarak, dikkatle PBMC tabakası aspire taze 50ml konik tüp içine PBMC toplamak. Tüm PBMC 400xg az 10 dakika süreyle PBS ve spin 30ml eklemek hasat edilir. Süpernatantı atın ve kalan tüm Ficoll kaldırmak için bir kez daha 30ml PBS ile yıkayın. </li><li> Miltenyi insan CD8 + T hücre üretici firmanın protokolüne göre izolasyon kiti kullanılarak CD8 + T hücre izolasyonu geçin. Hücreleri - Bu kit çok CD8 tüketen (genellikle&gt;% 95) CD8 + hücreler için zenginleştirir. </li><li> CD8 + T hücreleri sayın. Beklenen saflığı% 95 daha büyük olmalıdır. Onaylamak ve bu kullanım 2x10 5 hücre CD4/3/8 FACS analizi gerçekleştirmek için. Ya kalan CTL antijen-spesifik aAPC uyarılması için hemen olabilir ya da gelecekte kullanılmak üzere dondurularak muhafaza edilebilir. </li></ol> 4 in vitro aAPC temelli bir kültür sistemi <ol><li> Kültür ortamı hazırlayın <ol><li> TF (laboratuar 4 T hücre büyüme faktörü) 2X kültür ortamı: tam RPMI orta artı% 5 plazma ve% 8 T hücre büyüme faktörü otolog donör. </li><li don otolog plazma ab serumu ile inaktive edilmi insan taraf ikame edilebilir.></ol></li><li> Tam RPMI medyum TF 2X kültür ortamı artı 8 ml 8 ml yeniden süspanse 1 milyon CTL, 1 × 10 6 aAPC, iyice karıştırın. </li><li> Iyi 96 U altındaki doku kültürü plakaları üzerine plaka hücrelere bir multi-kanal pipetter kullanın. (Için de ul 160) </li><li> Kültür hücreleri 37 ° C, 7 gün süreyle% 5 CO 2 incubater. 4 gün 80 ul / TF 2X orta hücrelerin besleyin. </li><li> Hücreler 7 gün hasat edilebilir hazırız. Hasattan sonra, mıknatıs karşı hücreleri yer ve eski aAPC çıkarın. </li><li> Antijen özgüllüğü, üretici firmanın protokolüne göre tetramer boyama ile tespit edilebilir. Fenotip boyama ve hücre içi sitokin boyama önceki çalışmada 3 göre yapılmaktadır. </li><li> Hasat hücreleri aynı koşullar altında tekrar aAPC replated olabilir. Hücre sayısı ve antijen özgüllüğü tekrarlanan stimülasyon sonrasında artması beklenmektedir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: HLA-A2-Ig ve anti-CD28 konjugasyon sonra aAPC bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Başarılı protein konjugasyon net bir kayma ile ilgili antikor boyama açıktır. Periferik kan CMV spesifik CTL frekans aAPC aracılı stimülasyon tek bir hafta sonra, genellikle% 0.5-1 iken, özgüllüğü 55 ulaşabilirsiniz -% 93 (Şekil 2 ve 3). Antijen spesifik CTL genişleme farklı bağışçılar arasında çok değişken olabilir, ancak sonuçlar aynı donör içinde tekrarlanabilir. Ekstrapolasyon, CMV hücrelerin genişlemesi habercisi seviyeleri doğrudan ex vivo (veriler gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında binlerce kat olabilir. Hücre içi sitokin boyama (Şekil 3) Bu genişletilmiş CTL polifonksiyonel ziyade, bitkin, uzun süreli hücre kültürü ve önemli çoğalması. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 allojeneik HKHT evlatlık immünoterapi için insan CTL aAPC ex vivo genişlemesi Temsilcisi akış şeması <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 CMV spesifik CTL bir hafta sonra kültür aAPC tarafından oluşturulan Temsilcisi tetramer boyama sonucu <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 CMV spesifik CTL aAPC tarafından üretilen Temsilcisi hücre içi sitokin boyama sonuç (CMV özgüllük% 61) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. M-450 Epoksi boncuk Temsilcisi boyama sonucu protein konjugasyon sonra anti-fare IgG1-PE ve anti-fare IgG2-FITC ile boyandı

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Biz burada açıklamak aAPC sistemi, çeşitli antijenlere karşı insan CTL ex vivo genişlemesi için verimli bir sistem. Özel bakım 96-plaka kültürü, kalitesi ve protein konjugasyon aAPC ve CTL, hatta dağıtım konusunda alınmalıdır. Biz bir milyon kat 4 antijen-spesifik CTL kadar genişletilebilir sırasında fazla 8 hafta boyunca CTL genişletmek mümkün olmuştur bu yaklaşımı kullanarak. Hücre hatları veya diğer acellular platformlarda 5 yararlanarak çeşitli yapay APC sistemleri var olmuştur, ancak her sistem, genişleme ve özgüllüğü konusunda farklı uygulamaları destekleyen ile eşsiz bir profile sahiptir yayınlanan veriler göre . KVK, kalite, miktar olarak önemli olduğundan da önemlisi, sistem tarafından üretilen CMV spesifik CTL polyfunctionality üstün anti-viral etkinliği tanımak bekleniyor.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Vacutainer tüp (heparin içeren) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> İnsan CD8 + T hücre izolasyon kiti </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 Epoksi </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 Mıknatıs </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01d </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI medyum 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig dimer X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon net bir 96-iyi Microtest plaka </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Rat anti-fare IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> İnsan serum AB tipi </td><td> Atlanta biyolojik </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Fare, anti-insan CD8a-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD8a APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Fare anti-insan IFNγ-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Fare insan anti-TNF-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

verimli hla-ig tabanlı yapay antijen sunan hücrelerin ex vivo</emİnsan ctl> genleşme

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

En iyi effektör fonksiyonu ile CTL, çeşitli hücre içi enfeksiyonlara ve kansere karşı koruma aracılık kritik rol oynar. Ancak, bireylerin baskılayıcı bağışıklık mikroçevresinin gösterebilir ve aktive CTL aksine, otolog antijen sunan hücreler tolerize eğilimi olabilir veya antijen spesifik CTL anergize. Sonuç olarak, hala deneysel aşamada olmasına rağmen CTL tabanlı evlatlık immünoterapi gibi kanser ve virüs enfeksiyonları gibi çeşitli hastalıklar için umut verici bir tedavi haline gelmifltir. İlk deneylerde ex vivo genişletilmiş CMV (sitomegalovirüs) immün sistemi baskılanmış allojenik kemik iliği nakli hastalarında CMV enfeksiyonu tedavisi için kullanılan spesifik CTL edilmiştir. Bu hastalarda yaşamı tehdit eden CMV viremi ortak, alan hastaların hiçbiri CTL anti-CMV bağışıklık adoptively transfer CTL 1 tarafından kurulmuştur ima, CMV ile ilgili hastalık geliştirmek genişletti. Melanom için umut verici sonuçlar da gözlenmiştir ve diğer kanser türleri 2 için uzatılabilir. Ex vivo insan CTL teşvik etmek ve genişletmek için birçok yol olmasına karşın, güncel yaklaşımların maliyet ve teknik sınırlamalar ile sınırlıdır . Örneğin, mevcut altın standarttır otolog DC dayanmaktadır. Bu, her bir hastanın önemli bir lökosit sayısı bağış gerektirir ve aynı zamanda çok pahalı ve zahmetli bir iştir. Ayrıca, bu sadece suboptimal effektör fonksiyonu 3 DC genişletilmiş CTL in vitro karakterizasyonu ayrıntılı sahip olduğunu ortaya koymuştur. Burada, evlatlık immünoterapi (Şekil 1) insan CMV spesifik CTL ex vivo genişlemesi için son derece verimli aAPC tabanlı bir sistem sunuyoruz. AAPC insan HLA-A2-Ig dimer ve anti-CD28mAb 4 hücre ölçekli manyetik boncuk kaplin tarafından yapılmıştır. AAPC yapıldıktan sonra, çeşitli ilgi peptitler ile yüklü ve ay için işlevsel kalır olabilir. Bu raporda, aAPC CMV, pp65 (NLVPMVATV) baskın bir peptit ile yüklendi. AAPC ile bir hafta boyunca sağlıklı bir donörden insan CD8 + CTL saflaştırılmış kültür sonra, CMV spesifik CTL, özgüllüğü% 98 (Şekil 2), dramatik bir şekilde artmış ve 10.000 &#39;den fazla kat güçlendirilmiş olabilir . CMV spesifik CTL gerekiyorsa, daha fazla genişleme aAPC ile tekrarlayan stimülasyonu ile kolayca elde edilebilir. Fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu bu genişletilmiş hücreleri efektör bellek fenotipi (Şekil 3) TNF ve IFNγ hem de önemli miktarda ve gösterir.

Antijen-spesifik T hücrelerinin indüksiyon ve genişleme için yeni bir DC bağımsız bir yöntem açıklanmıştır. HLA-A2-Ig tabanlı yapay Antijen sunan hücreler (aAPC), HLA-A2 verimli farklı antijen özgüllüğü CTL genişletmek için kısıtlı peptitler ile yüklenir. Bu teknoloji tabanlı CTL evlatlık immünoterapi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

Optimal efektör fonksiyona sahip CTL'ler, çeşitli hücre içi enfeksiyonlara ve kansere karşı korumanın sağlanmasında kritik roller oynarlar. Ancak, bireyler...

Bu prosedürün genel amacı, adaptif immünoterapide potansiyel kullanım için insan antijen spesifik CTL'lerin ex vivo ekspansiyonunda yapay antijen sunan hücreleri veya bir APC'yi kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle HLA A2 IG ve anti-insan CD28 monoklonal antikorun, APC oluşturmak amacıyla manyetik dyna bead'lere konjuge edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, APC'nin kalite kontrolünün yapılması ve peptid yüklemesidir. Prosedürün üçüncü adımı, insan periferik kan CD8 pozitif T hücrelerinin izole edilmesidir. Prosedürün son adımı ise CD8 pozitif T hücrelerinin bir hafta boyunca APC ile inkübe edilmesidir.Ardından CTL'ler hasat edilir ve karakterize edilir; daha sonra ya kullanılırlar ya da istenen spesifite ve ekspansiyon düzeyine ulaşmak için bir hafta daha yeniden stimüle edilirler. Nihayetinde, AA PC varlığında ekspande edilen CTL'lerin artmış bir antijen spesifitesine sahip olduğunu gösteren titrasyon veya boyama sonuçları elde edilebilir. Bugün size HI IG tabanlı bir AA PC sistemini ve bu sistemin, diğer mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında CMV spesifik insan CTL'lerini exvivo ortamda verimli bir şekilde ekspande etmek için nasıl kullanılacağını göstereceğim.A A PC teknolojimiz birçok önemli avantaj sunmaktadır. Hazır olarak temin edilebilir, miktarı sınırsızdır ve A A PC'nin tüm HRAA iki pozitif donörler için kullanılabileceğini söyleyebiliriz. Tamam, başlayalım. Stoktan, yaklaşık 400 milyon boncuk içeren 1 mL M four 50 epoksi boncuğu steril, vidalı cam bir şişeye aktarın.Bir mililitre boid tamponu ekleyip ardından boncuklar şişe kenarına yapışmış durumdayken cam şişeyi bir dyin all magnet NBC one'a yerleştirerek boncukları bir kez yıkayın. Süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırın. Boncukları; boid tamponu, HLA A iki IG dimer ve anti-insan CD 28 monoklonal antikor karışımı içinde süspande edin.Ardından, proteinin boncuklarla konjugasyonunu kolaylaştırmak için cam viyali bir rotatör üzerinde dört derece santigrat sıcaklıkta 24 saat boyunca döndürün. Sonrasında, tüpü bir MPC mıknatısın içine yerleştirin ve borat tamponunun tamamını uzaklaştırın. Tampon uzaklaştırıldıktan sonra, boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.Şimdi boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponunda inkübe edin ve boncuklar üzerindeki kalıntı protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için tüpü dört derece Celsius'ta 24 saat daha döndürün. Ardından cam tüpteki tamponu uzaklaştırın ve yerine bir mililitre taze boncuk yıkama tamponu ekleyin. Fax tüplerine 100 mikrolitre fax yıkama tamponu aktarın ve ardından beş × 10⁵ boncuk ekleyin.Boncukları, bir mikrolitre anti-fare IgG1 PE ve bir mikrolitre anti-fare IgG2a FITC ile boyayın; boyama işlemini 4 °C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirin. Her bir boyama örneğine 3 mL FACS yıkama tamponu ekleyin. Ardından, örnekleri 4 °C'de 300 ×g'de 5 dakika santrifüj ederek APC'leri çöktürün.A A PC'yi taze fax tamponunda tekrar süspanse edin ve boyama sonucunu hemen akış sitometresi ile okuyun. Boncukları daha önce olduğu gibi steril PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, boncuklara 10 µL CMV peptidi yükleyin.Boncukları hemositometre ile sayın ve ardından üzerine tarihi ve boncuk konsantrasyonunu mililitredeki boncuk sayısı şeklinde etiketleyin. A A PC'yi peptit ile en az üç gün boyunca 4 °C'de inkübe edin; HLA A2 pozitif bir donörden alınan yaklaşık 100 mL taze periferik kanı, 10 adet sodyum heparinli vakutainer tüpünde 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında, üst plazma tabakasını aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Toplanan plazmanın yerine steril PBS ekleyin ve kanı steril bir T 75 kültür flaskına aktarın. 15 mL'lik fial pack plus ile dört adet 50 mL'lik konik tüpe tüm kan toplandıktan sonra, kan ve PBS'yi pipetleme yoluyla iyice karıştırın.Her bir tüpteki fialin üzerine yavaşça 30 ila 35 mililitre kan hücresi ekleyin. Fial ile kan hücreleri arasındaki ara yüzeyin belirgin kalmasını sağlayarak, kan ve fial gradyanını oda sıcaklığında, 500 GS hızda 20 dakika boyunca, katmanlar arasında net bir ara yüzey korumak amacıyla frenleme ve hızlanma en düşük seviyede olacak şekilde santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra üstteki plazma tabakasını aspire edin ve ardından PBMC tabakasını dikkatlice aspire etmek için bir serolojik pipet kullanın. PBMC'leri taze bir 50 mililitre konik tüpe aktarın; tüm PBMC'ler toplandığında hücrelere 30 mililitre PBS ekleyin ve onları santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı atın ve peleti yıkayın. Kalan fibroblastları uzaklaştırmak için 30 mililitre PBS ile bir kez daha yıkama yapın; ardından Milton Human CD eight positive T-cell isolation kit kullanarak CD eight pozitif T-hücre popülasyonunu zenginleştirin. Üreticinin protokolüne uygun olarak, CD eight pozitif T-hücrelerini sayın ve saflığı FACS analizi ile doğrulayın.1 milyon CTL'yi sekiz mililitre T-hücresi büyüme faktörü 2x kültür ortamı artı sekiz mililitre komple RPMI ortamı içinde süspanse edin ve 1 × 10⁶ APC karışımı ekleyin. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu U tabanlı doku kültürü plağındaki her kuyucuğa 160 µL hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 ortamında yedi gün boyunca inkübe edin.Dördüncü günde hücreleri, kuyuk başına 80 µL T-hücresi büyüme faktörü 2 x kültür medyumu ile besleyin. Yedinci günde hücreleri hasat edin ve ardından, tüm boncuklar vial duvarına yapıştığında eski A A PC'yi uzaklaştırmak için hücreleri mıknatısa yerleştirin.Hücreleri hasat ederek başka bir 50 milliliter konik tüpe aktarın ve hücre sayısını belirleyin. Üretici protokolüne uygun olarak tetramer boyaması ile A A PC'nin antijen spesifitesini belirleyin. Antijen spesifitesi açısından hücre sayısını artırmak için hasat edilen hücreleri aynı koşullar altında yeni A A PC ile yeniden etkileşime sokun.Burada, bir haftalık kültür sonrası A A PC tarafından üretilen CMV spesifik CTL'lerin temsili bir tetramer boyama sonucu yer almaktadır. Burada gösterilen, A-A-P-C-C-M-V tarafından üretilen CMV spesifik CTL'lerin temsili bir hücre içi sitokin boyama sonucudur; tetramer boyama ile spesifite %61 olarak belirlenmiştir. Bu yöntem, T hücresi alanındaki optimal kültür koşullarının nasıl tanımlanabileceği ve T hücresi fonksiyonel modülasyonu için gerekenler gibi temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.Lowly yöntemi, viral hastalıkların tedavisine yönelik içgörüler sağlamıştır. Bu yöntem ayrıca kanser gibi diğer alanlara da uygulanabilir.

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Burada yapay antijen sunan hücreler (AAPC) kullanarak toplu T hücre popülasyonlarının insan NKT hücreleri aktive ve genişletilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. CD1d bazlı AAPC kullanılması, fonksiyonel NKT hücrelerinin yüksek sayılar için bir standart bir yöntem sağlar.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC) İn Vitro İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Burada, hızlı ve tekrarlanarak ayarlanabilir boyutu, şekli ve yüzey proteini tanıtımı için T hücre genişletme ex vivo veya içinde vivo hücre (aAPC) sunan biyolojik ilham, biyolojik olarak parçalanabilen articifical antijen üretmek için bir iletişim kuralı mevcut .

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Sunulan Gama-Delta (φδ) T hücreli ilaç ürününün genişletilmesi için bir protokoldür. Lenfositler elütriasyon ile izole edilir ve zoledronik asit ve interlökin-2 ile zenginleştirilir. Alfa-beta T hücreleri klinik sınıf manyetik ayırma cihazı kullanılarak tükeniyor. δδ hücreleri K562 türevi, yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir ve genişletilir.

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Öğrenin HLA A2-Ig tabanlı yapay antijen sunan hücreler kullanarak insan sitotoksik T lenfositlerini verimli bir şekilde genişletme yöntemini. Bu teknik, adoptif immünoterapi uygulamaları için antijene özgü T hücreleri üretmeyi sağlar.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo Genleşme

Daha fazla video keşfet