Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo Genleşme

Bu prosedürün genel amacı, adaptif immünoterapide potansiyel kullanım için insan antijen spesifik CTL'lerin ex vivo ekspansiyonunda yapay antijen sunan hücreleri veya bir APC'yi kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle HLA A2 IG ve anti-insan CD28 monoklonal antikorun, APC oluşturmak amacıyla manyetik dyna bead'lere konjuge edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, APC'nin kalite kontrolünün yapılması ve peptid yüklemesidir. Prosedürün üçüncü adımı, insan periferik kan CD8 pozitif T hücrelerinin izole edilmesidir. Prosedürün son adımı ise CD8 pozitif T hücrelerinin bir hafta boyunca APC ile inkübe edilmesidir.

Ardından CTL'ler hasat edilir ve karakterize edilir; daha sonra ya kullanılırlar ya da istenen spesifite ve ekspansiyon düzeyine ulaşmak için bir hafta daha yeniden stimüle edilirler. Nihayetinde, AA PC varlığında ekspande edilen CTL'lerin artmış bir antijen spesifitesine sahip olduğunu gösteren titrasyon veya boyama sonuçları elde edilebilir. Bugün size HI IG tabanlı bir AA PC sistemini ve bu sistemin, diğer mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında CMV spesifik insan CTL'lerini exvivo ortamda verimli bir şekilde ekspande etmek için nasıl kullanılacağını göstereceğim.

A A PC teknolojimiz birçok önemli avantaj sunmaktadır. Hazır olarak temin edilebilir, miktarı sınırsızdır ve A A PC'nin tüm HRAA iki pozitif donörler için kullanılabileceğini söyleyebiliriz. Tamam, başlayalım. Stoktan, yaklaşık 400 milyon boncuk içeren 1 mL M four 50 epoksi boncuğu steril, vidalı cam bir şişeye aktarın.

Bir mililitre boid tamponu ekleyip ardından boncuklar şişe kenarına yapışmış durumdayken cam şişeyi bir dyin all magnet NBC one'a yerleştirerek boncukları bir kez yıkayın. Süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırın. Boncukları; boid tamponu, HLA A iki IG dimer ve anti-insan CD 28 monoklonal antikor karışımı içinde süspande edin.

Ardından, proteinin boncuklarla konjugasyonunu kolaylaştırmak için cam viyali bir rotatör üzerinde dört derece santigrat sıcaklıkta 24 saat boyunca döndürün. Sonrasında, tüpü bir MPC mıknatısın içine yerleştirin ve borat tamponunun tamamını uzaklaştırın. Tampon uzaklaştırıldıktan sonra, boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Şimdi boncukları bir mililitre boncuk yıkama tamponunda inkübe edin ve boncuklar üzerindeki kalıntı protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için tüpü dört derece Celsius'ta 24 saat daha döndürün. Ardından cam tüpteki tamponu uzaklaştırın ve yerine bir mililitre taze boncuk yıkama tamponu ekleyin. Fax tüplerine 100 mikrolitre fax yıkama tamponu aktarın ve ardından beş × 10⁵ boncuk ekleyin.

Boncukları, bir mikrolitre anti-fare IgG1 PE ve bir mikrolitre anti-fare IgG2a FITC ile boyayın; boyama işlemini 4 °C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirin. Her bir boyama örneğine 3 mL FACS yıkama tamponu ekleyin. Ardından, örnekleri 4 °C'de 300 ×g'de 5 dakika santrifüj ederek APC'leri çöktürün.

A A PC'yi taze fax tamponunda tekrar süspanse edin ve boyama sonucunu hemen akış sitometresi ile okuyun. Boncukları daha önce olduğu gibi steril PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, boncuklara 10 µL CMV peptidi yükleyin.

Boncukları hemositometre ile sayın ve ardından üzerine tarihi ve boncuk konsantrasyonunu mililitredeki boncuk sayısı şeklinde etiketleyin. A A PC'yi peptit ile en az üç gün boyunca 4 °C'de inkübe edin; HLA A2 pozitif bir donörden alınan yaklaşık 100 mL taze periferik kanı, 10 adet sodyum heparinli vakutainer tüpünde 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, üst plazma tabakasını aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Toplanan plazmanın yerine steril PBS ekleyin ve kanı steril bir T 75 kültür flaskına aktarın. 15 mL'lik fial pack plus ile dört adet 50 mL'lik konik tüpe tüm kan toplandıktan sonra, kan ve PBS'yi pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Her bir tüpteki fialin üzerine yavaşça 30 ila 35 mililitre kan hücresi ekleyin. Fial ile kan hücreleri arasındaki ara yüzeyin belirgin kalmasını sağlayarak, kan ve fial gradyanını oda sıcaklığında, 500 GS hızda 20 dakika boyunca, katmanlar arasında net bir ara yüzey korumak amacıyla frenleme ve hızlanma en düşük seviyede olacak şekilde santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra üstteki plazma tabakasını aspire edin ve ardından PBMC tabakasını dikkatlice aspire etmek için bir serolojik pipet kullanın. PBMC'leri taze bir 50 mililitre konik tüpe aktarın; tüm PBMC'ler toplandığında hücrelere 30 mililitre PBS ekleyin ve onları santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı atın ve peleti yıkayın. Kalan fibroblastları uzaklaştırmak için 30 mililitre PBS ile bir kez daha yıkama yapın; ardından Milton Human CD eight positive T-cell isolation kit kullanarak CD eight pozitif T-hücre popülasyonunu zenginleştirin. Üreticinin protokolüne uygun olarak, CD eight pozitif T-hücrelerini sayın ve saflığı FACS analizi ile doğrulayın.

1 milyon CTL'yi sekiz mililitre T-hücresi büyüme faktörü 2x kültür ortamı artı sekiz mililitre komple RPMI ortamı içinde süspanse edin ve 1 × 10⁶ APC karışımı ekleyin. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu U tabanlı doku kültürü plağındaki her kuyucuğa 160 µL hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 ortamında yedi gün boyunca inkübe edin.

Dördüncü günde hücreleri, kuyuk başına 80 µL T-hücresi büyüme faktörü 2 x kültür medyumu ile besleyin. Yedinci günde hücreleri hasat edin ve ardından, tüm boncuklar vial duvarına yapıştığında eski A A PC'yi uzaklaştırmak için hücreleri mıknatısa yerleştirin.

Hücreleri hasat ederek başka bir 50 milliliter konik tüpe aktarın ve hücre sayısını belirleyin. Üretici protokolüne uygun olarak tetramer boyaması ile A A PC'nin antijen spesifitesini belirleyin. Antijen spesifitesi açısından hücre sayısını artırmak için hasat edilen hücreleri aynı koşullar altında yeni A A PC ile yeniden etkileşime sokun.

Burada, bir haftalık kültür sonrası A A PC tarafından üretilen CMV spesifik CTL'lerin temsili bir tetramer boyama sonucu yer almaktadır. Burada gösterilen, A-A-P-C-C-M-V tarafından üretilen CMV spesifik CTL'lerin temsili bir hücre içi sitokin boyama sonucudur; tetramer boyama ile spesifite %61 olarak belirlenmiştir. Bu yöntem, T hücresi alanındaki optimal kültür koşullarının nasıl tanımlanabileceği ve T hücresi fonksiyonel modülasyonu için gerekenler gibi temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Lowly yöntemi, viral hastalıkların tedavisine yönelik içgörüler sağlamıştır. Bu yöntem ayrıca kanser gibi diğer alanlara da uygulanabilir.