Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Spesifik insan ve hayvan virüslerini kullanarak mikrobiyal kaynak takibi için maliyet etkin yöntem. Çalışma, mikrobiyal kaynak takip araçları olarak önerilen insan, domuz ve sığır DNA virüslerinin, adenovirüslerin ve polyomavirüslerin spesifik kantifikasyonu için kantitatif PCR kullanarak suyla temas eden fekal idrar kontaminasyonunun veya nitrat kontaminasyonunun kaynağının belirlenmesine yönelik maliyet etkin bir yöntemi açıklamaktadır. 10 litrelik su örneklerinden virüslerin organik flokülasyon yoluyla konsantrasyonu, sedimentten viral nükleik asitlerin yağsız süt ekstraksiyonu ile elde edilmesi ve insan, sığır veya domuz DNA virüslerinin kantitatif PCR kullanılarak kantifikasyonu için bir protokol geliştirdik.

Vitaminlerin mikrobiyal kontaminasyonunun ciddi bir sağlık riski oluşturduğu iyi bilinmektedir ve kontaminasyon kaynaklarını belirlememiz gerekmektedir. Yaygın görülen DNA virüslerinin, mikrobiyal kaynak izleme araçları olarak kullanılmasını önermekteyiz. Seçilen virüsler adenovirüsler ve polyomavirüslerdir.

Bu virüsler yıl boyunca ve tüm coğrafi bölgelerde sürekli olarak atılmaktadır. Önceki çalışmalarda incelenmiştir. Sudaki virüsler için düşük maliyetli ve güçlü konsantrasyon yöntemleri geliştirdik ve purin adenovirüsleri ile bovine polyomavirüslerinin nicel tayini için QPCR analizleri geliştirmek üzerine çalışmaktayız.

Ek olarak, QPCR ile test edilen insan adenovirüslerini ve NGC Polyomavirüslerini de sudaki insan kontaminasyonunun belirteçleri olarak kullanıyoruz, su örneklerinin toplanması. Bu çalışmada, her su örneğinden 10 litrelik dört tekrar, düz tabanlı plastik kaplara toplanır ve süreç kontrolü olarak bir adet ekstra örnek alınır. Bu son örnek, kontrol olarak kullanılan viral partiküllerin bilinen bir miktarıyla ekim yapılacaktır.

Laboratuvarda, ek bir 10 litrelik plastik kapta şebeke suyu kullanılarak bir negatif kontrol hazırlanır. Numunede yüksek miktarda askıda katı madde, kum ve diğer materyaller varsa, 15 dakika boyunca çökelmeye bırakın ve ardından suyu yeni bir kaba aktarın. Organik flokülasyon yoluyla viral konsantrasyon.

Düşük veya orta derecede kirlenmiş su örneklerinde virüslerin tespit edilmesi, virüslerin en az birkaç litrelik sudan çok daha küçük bir hacme konsantre edilmesini gerektirir. Konsantrasyon prosedürü; 10 litrelik su örneklerinin asitlendirilmesini, yağsız süt kullanılarak flokülasyon yapılmasını, flokların çöktürülmesini ve çökeltenin işlemleri başlatmak için 10 mililitre fosfat tamponu içinde toplanmasını içerir; yapay deniz suyunda yağsız süt çözeltisi hazırlamak için 10 gram yağsız süt tozu bir litre yapay deniz suyunda çözülür ve pH değeri hidroklorik asit ile dikkatlice 3,5'e ayarlanır. Flok görünür olmalıdır.

Çözeltiyi kullanmadan hemen önce hazırlayın veya 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın. Su örnekleri karıştırılır ve örneklerdeki iletkenlik ölçülür. Eğer iletkenlik 1,5 millisiemens'in altındaysa, deniz tuzları eklenir.

Hidroklorik asit ekleyerek su örneğinin pH'ını 3,5'e ayarlayın. Hazırlama öncesi ve sonrası örneklerin pH değerini ve kullanılan hidroklorik asit hacmini kaydedin. Kondüktivite de kaydedilmelidir.

pH ayarlandıktan sonra, 10 litrelik su örneğine 1% oranında 100 mililitre yağsız süt eklenir ve virüslerin floklara absorbe olmasını sağlamak için örnekler sekiz ila 10 saat boyunca karıştırılır. Proses kontrolü olarak kullanılan spike örneği için, örneğe kontrol virüsünün standart hacmi (örneğin bir mililitre) eklenir. Karıştırma işlemi durdurulur ve flokların yerçekimi ile çökelmesi için sekiz ila 10 saat beklenir.

16 saat sonra, genellikle ertesi gün, çökelekleri toplayabileceğiz. Bunun için, bir peristaltik pompa kullanarak süpernatantı uzaklaştırın. Çökeleği kümeleriyle birlikte, yaklaşık 500 mililitre olacak şekilde bir santrifüj şişesine toplayın.

Çanakları pH 3.5'lik önceden yüklü yağsız süt ekleyerek dengeleyin, çanakları yüksek hızlı santrifüj ile 4 °C'de 30 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüj durur durmaz, santrifüj çanaklarını dikkatlice santrifüjden çıkarın. Süpernatantı çok nazikçe dökün ve atın.

Her bir santrifüj şişesindeki peleti, toplam 10 mililitre fosfat tamponu hacmine ulaşana kadar çözün; virüslerin nükleik asit ekstraksiyonu ve kantifikasyonunu gerçekleştirin. Viral konsantre, viral nükleik asitlerin ekstraksiyonu için kullanılır ve ilgilenilen spesifik adenovirüsler ile polyoma virüsleri A-Q-P-C-R ile kantifiye edilecektir. Key amp viral RNA mini kiti ile nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin.

140 µL viral konsantrelerde bulunan virüslerin lizisi manuel olarak gerçekleştirilir ve toplam nükleik asitler 80 µL hacme ekstrakte edilir. Bu kit, Key cube gibi otomatik bir platformun kullanımına olanak sağlar.

Sıradaki adım, viral genomun kantifikasyonudur. TaqMan probları kullanılarak gerçekleştirilen kantitatif PCR ile örneklerdeki kopya sayıları belirlenebilir; insan adenovirüsleri, JC Polyoma virüsleri ve sığır polyoma virüsleri aynı 96 kuyucuklu plakada kantifiye edilebilir. Hepsi aynı amplifikasyon döngülerini kullandığından, hedef virüsün kantifikasyonu için porcine adenovirüsler bağımsız bir plakada ayrı olarak test edilmelidir.

Kantitatif PCR karışımını temiz ve ayrı bir alanda hazırlayın. Karışım hazırlandıktan sonra, kontroller dahil olmak üzere her bir kuyuya 15 mikrolitre dağıtın. Örneklerden elde edilen nükleik asit ekstraksiyonlarını ayrı bir alanda, her bir örneği mükerrer olarak doğrudan vele purifiye edilmiş su ile on kat dilüsyon şeklinde 10 mikrolitre ekleyin; hedef eklendikten sonra tek bir reaksiyon için toplam hacim, 15 mikrolitre karışım artı 10 mikrolitre örnek veya standart olmak üzere 25 mikrolitre olacaktır. Örneklerin bulunduğu kuyucukları yapışkanlı bir kapak parçasıyla kapatın.

Kapağın diğer kısmını sonraki adım için saklayın. DNA standart süspansiyonlarının seyreltilmesi. 10⁻⁰ ile 10⁻⁶ genom kopyası arasından 10 µL'lik örnekleri, standart DNA kapağı için özel olarak kullanılan bir mikropipet ile üç paralel şeklinde ekleyin.

Yapışkan kapağı önceden kesilmiş, standartları içeren kuyucuklar. Bu şekil, 96 kuyucuklu plaka içindeki standart süspansiyon örneklerinin ve kontrollerin dağılımını göstermektedir.

AmpliTude Gold'u 10 dakika boyunca aktive ettikten sonra uygun parametreleri seçerek QPCR'ı yeterli bir sistemde gerçekleştirin. Reaksiyonlar tamamlandıktan sonra 95 °C'de 40 amplifikasyon döngüsü uygulanır. Verileri ve sonuçları, kullanılan cihazın kullanım kılavuzunda belirtildiği şekilde kaydedin.

DNA miktarı, gerektiğinde dilüsyon faktörü düzeltmesi yapıldıktan sonra elde edilen verilerin medyanı olarak tanımlanacaktır. Porcine adenovirüslerin kantifikasyonu için elde edilen amplifikasyon grafiği ve standart eğri 0,999'luk bir korelasyon katsayısı göstermiştir. Prosedür sonrası kabul edilebilir eğim değerleri -3,1 ile -3,6 arasındadır.

Kirlilik kaynaklarını belirlemek amacıyla, yüksek nitrat seviyelerinin görüldüğü bir bölgedeki yeraltı suyu örneklerinde tanımlanmış insan ve hayvan virüsleri test edilmiştir. Analiz edilen dört tekrarlanan ölçüm, litre başına ortalama 7,74 x 10² genom kopyası ile porcine adenovirüsler için pozitif sonuçlar göstermiştir; bu durum örnekleme alanını çevreleyen bölgedeki domuz gübresi çamurlarının varlığıyla ilişkili olabilir ve yeraltı suyunda fıkal porcine kontaminasyonun mevcut olduğunu kanıtlamaktadır. Test edilen örneklerin hiçbirinde insan kaynaklı kontaminasyona rastlanmamıştır.

Virolojik veriler, nested PCR ve sekanslama analizi ile doğrulanmıştır. Sonuç. Bu çalışmada, insan veya sığır kaynaklı kontaminasyonun bulunmadığı, domuz kaynaklı kontaminasyonun mevcut olduğu yer altı suyu örneklerinin analiz sonuçlarını sunduk. Bu prosedür ayrıca yüzme suları, deniz suyu ve nehir suyu analizlerine de uygulanmıştır.

Burada, geliştirilen yöntemlerin çevredeki kontaminasyon kaynağını tespit etmedeki uygulanabilirliğine örnek olarak yüksek nitrat seviyeleri sergileyen yer altı sularındaki kontaminasyon kaynağının belirlenmesinde bu araçların uygulanmasıyla ilgili prosedürü sunuyoruz.