Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi
December 3rd, 2011
Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.
Belirli insan ve hayvan virüslerini kullanarak mikrobiyal kaynak takibi için uygun maliyetli yöntem. Çalışma, mikrobiyal kaynak izleme araçları olarak önerilen insan domuzu, sığır, DNA virüsleri, adenovirüsler ve polyomavirüslerin spesifik miktar tayini için kantitatif PCR kullanarak dışkı idrar kontaminasyonu veya sudaki nitratlar tarafından kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için uygun maliyetli bir yöntemi açıklamaktadır. Yağsız süt kullanılarak organik flokülasyon, tortudan viral nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve kantitatif PCR kullanılarak insan sığır veya domuz DNI virüslerinin miktar tayini yoluyla 10 litrelik su örneklerinden virüs konsantrasyonu için bir protokol geliştirdik.
Vitaminin mikrobiyal kontaminasyonunun önemli bir sağlık riski oluşturduğu iyi bilinmektedir ve kontaminasyonun kaynaklarını bilmemiz gerekmektedir. Mikrobiyal kaynak izleme araçları olarak oldukça yaygın DNA virüslerinin kullanılmasını önerdik. Seçilen virüsler adenovirüsler ve polyomavirüslerdir.
Bu virüsler tüm yıl boyunca ve tüm coğrafi bölgelerde ısrarla salgılanmaktadır. Önceki çalışmalarda okudu. Sudaki virüsler için sağlam, düşük maliyetli konsantrasyon yöntemleri geliştirdik ve pürin adenovirüslerinin ve sığır polyomavirüslerinin miktar tayini için QPCR testleri geliştirmek için çalışıyoruz.
Ek olarak, QPCR tarafından test edilen insan adenovirüsleri, NGC Polyomavirüsleri, ayrıca sudaki insan kontaminasyonunun belirteçleri olarak, su örneklerinin toplanmasında kullanıyoruz. Bu çalışmada, su numunesi başına 10 litrelik dört kopya, düz tabanlı plastik kaplarda ve proses kontrolü olarak fazladan bir numune toplanmıştır. Bu son numune, kontrol olarak kullanılan viral partiküllerin bilinen bir miktarı ile tohumlanacaktır.
Laboratuvarda, fazladan 10 litrelik bir plastik kapta koşul musluk suyu kullanılarak negatif bir kontrol hazırlanır. Numune yüksek miktarda asılı malzeme, kum ve diğer malzemeler içeriyorsa, 15 dakika çökelmesine izin verin, suyu yeni bir kaba aktarın. Organik flokülasyon ile viral konsantrasyon.
Düşük veya orta derecede kirli su örneklerinde virüslerin tespit edilmesi, virüslerin en az birkaç litre sudan çok daha küçük bir hacme konsantrasyonunu gerektirir. Konsantrasyon prosedürü, 10 litre su numunelerinin asitleştirilmesini, yağsız süt yerçekimi kullanılarak flokülasyonunu, sürülerin çökeltilmesini ve işlemi başlatmak için çökeltinin 10 mililitre fosfat tamponunda toplanmasını içerir, 10 gram yağsız süt tozunun bir litre yapay deniz suyunda çözülmesi ve pH'ın dikkatlice 3.5'e ayarlanmasıyla yapay deniz suyuna yağsız süt yerleştirme çözeltisi hazırlanır. Hidroklorik asit ile sürü görünür olmalıdır.
Solüsyonu kullanılmadan hemen önce hazırlayın veya 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Su numuneleri karıştırılır ve numunelerdeki iletkenlik ölçülür. 1.5 milisiemens'in altındaysa, deniz tuzları eklenecektir.
Hidroklorik asit ilavesiyle su numunesinin pH'ını 3,5'e ayarlayın. Şartlandırmadan önce ve sonra numunelerin pH'ını ve kullanılan hidroklorik asit hacmini kaydedin. İletkenlik de kaydedilmelidir.
PH'ı ayarladıktan sonra, 10 litrelik su numunesine %1 olmak üzere 100 mililitre pref flod yağsız süt ekliyoruz ve virüslerin sürülere emilmesi için numuneleri sekiz ila 10 saat karıştırıyoruz. Proses kontrolü olarak kullanılan spike numunesi için, kontrol virüsünün standart hacmini, örneğin bir mililitreyi numuneye ekleyin. Karıştırmayı durdurun ve sürünün yerçekimi ile sekiz ila 10 saat boyunca çökelmesine izin verin.
16 saat sonra, genellikle ertesi gün, tortuları toplayabileceğiz. Bunu yapmak için, peristaltik bir pompa kullanarak süpernatanı çıkarın. Tortuyu sürülerle birlikte, yaklaşık 500 mililitre bir santrifüj şişesine toplayın.
Tencereleri pref flod yağsız süt pH 3.5 ilavesiyle dengeleyin, tencereleri yüksek hızlı santrifüj ile santrifüjleyin, 8.000 Gs dört santigrat derecede 30 dakika. Santrifüj durur durmaz, santrifüj kaplarını santrifüjden dikkatlice çıkarın. Süpernatanı çok nazikçe dökün ve atın.
Her bir santrifüj şişesindeki peleti, 10 mililitre fosfat, nükleik asit ekstraksiyonu ve virüslerin miktar tayini gibi nihai bir hacme kadar çözün. Viral konsantre, viral nükleik asitlerin ekstraksiyonu için kullanılır ve spesifik adenovirüsler ve polyoma İlgilenilen virüsler A-Q-P-C-R ile ölçülecektir. Anahtar amp viral RNA mini kiti ile bir nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
140'ta bulunan virüslerin parçalanması. Mikrolitre viral konsantreler manuel olarak gerçekleştirilir ve toplam nükleik asitler 80 mikrolitreye ekstrakte edilir. Bu kit, Key cube gibi otomatik bir platformun kullanılmasını sağlar.
Bir sonraki adım, viral genomun nicelleştirilmesidir. Tac man probları, insan adenovirüsleri, JC Polyoma virüsleri ve sığır polyoma virüsleri ile kantitatif bir PCR kullanılarak numunelerdeki kopyalar aynı 96 kuyucuklu plakada miktar tayin edilebilir. Hepsi aynı amplifikasyon döngülerini kullandığından, domuz adenovirüsleri, hedef virüsün niceliklerinin belirlenmesi için bağımsız bir plakada ayrı ayrı test edilmelidir.
Kantitatif PCR karışımını temiz ve ayrı bir alanda hazırlayın. Karışım hazırlandıktan sonra, kontroller de dahil olmak üzere her bir oyuğa 15 mikrolitre tahsis edin. Numunelerden 10 mikrolitre nükleik asit ekstraksiyonlarını ayrı bir alana ekleyin, doğrudan çalıştırın ve her numunenin arıtılmış suyunda on kat seyreltin, hedef eklendikten sonra bir reaksiyon için toplam hacim 25 mikrolitre olacaktır, 15 karışım artı 10 numune veya standart kapak, numuneleri içeren kuyucukları yapışkan bir kapağın parçası ile kaplar.
Kapağın diğer kısmını bir sonraki adım için saklayın. DNA standart süspansiyonlarının AB seyreltilmesi. 10'dan sıfıra 10 ila altı genom kopyası arasında 10 mikrolitre, mikrolitreleri üçe katlayarak ve yalnızca standart DNA kapağı için kullanılan bir mikro pbit kullanarak taklit edin.
Standartları içeren kuyular daha önce kesilmiş yapışkan kapaklı olarak kullanılır. Bu şekil, standart süspansiyon örneklerinin ve kontrollerinin dağılımını göstermektedir. 96 kuyulu plakada.
Genlik altınının 10 dakika boyunca aktivasyonunu takiben uygun parametreleri seçerek QPCR'yi uygun bir sistemde gerçekleştirin. 95 santigrat derecede, reaksiyonlar tamamlandıktan sonra 40 döngü amplifikasyon gerçekleştirilir. Verileri ve sonuçları, kullanılan ekipmanın kullanım kılavuzunda açıklandığı şekilde saklayın.
DNA miktarı, gerektiğinde seyreltme faktörü düzeltildikten sonra elde edilen verilerin medyanı olarak tanımlanacaktır. Domuz adenovirüslerinin miktar tayini için elde edilen amplifikasyon grafiği ve standart eğri, 0.999'luk bir korelasyon katsayısı gösterdi. Kabul edilebilir eğim değerleri, prosedürü takiben eksi 3,1 ile eksi 3,6 arasında değişir.
Tanımlanan insan ve hayvan virüsleri, kontaminasyon kaynaklarını tanımlamak için yüksek düzeyde nitrat sunan bir alandan alınan yeraltı suyu örneklerinde test edilmiştir. Analiz edilen dört kopya, domuz adenovirüslerinin ortalama değeri için pozitif sonuçlar gösterdi, litre başına 10 ila iki genom kopyası başına 7.74, bu da örnekleme alanını çevreleyen alanda domuz bulamaçlarının varlığı ile ilişkili olacak ve yeraltı suyunda dışkı domuz kontaminasyonunun varlığını kanıtlayacaktı. Test edilen numunelerin hiçbirinde insan kontaminasyonu mevcut değildi.
Virolojik veriler iç içe PCR ve sekanslama analizi ile doğrulandı. Son. Bu çalışmada, insan veya sığır kontaminasyonu olmadığında domuz kaynaklı kontaminasyonu sunan yeraltı suyu örneklerini analiz eden sonuçlar sunduk. Prosedür ayrıca yüzme suları, deniz suyu ve nehir suyunun analizine de uygulanmıştır.
Burada, bu araçların yeraltı sularındaki kirlilik kaynağının belirlenmesine uygulanma prosedürünü sunuyoruz ve çevredeki kirlenme kaynağını tespit etmek için geliştirilen yöntemlerin uygulanabilirliğine bir örnek olarak yüksek nitrat seviyelerini sunuyoruz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, sudaki dışkı ve idrar kontaminasyon kaynaklarını belirlemek için maliyet etkin bir yöntem sunmaktadır. Kantitatif PCR kullanarak, yöntem spesifik insan, domuz ve sığır DNA virüslerini, adenovirüsler ve poliomavirüsler dahil, mikrobiyall kaynak izleme araçları olarak nicellendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal Kaynak İzleme
- Çevresel Mikrobiyoloji
- Su Kalitesi Değerlendirmesi
Arka Plan
- Mikrobiyal kontaminasyon önemli sağlık riskleri oluşturur.
- Kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi halk sağlığı için kritik öneme sahiptir.
- DNA virüsleri yaygındır ve etkili izleme araçları olarak hizmet edebilir.
- Adenovirler ve poliomavirüsler alaka düzeylerinden dolayı seçilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- Sudaki dışkı kontaminasyonunu izlemek için bir yöntem geliştirmek.
- Su örneklerinden spesifik DNA virüslerini nicellendirmek.
- Kontaminasyon kaynakları hakkındaki anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 10 litre su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu.
- Viral nükleik asit ekstraksiyonu için yağsız süt kullanarak organik flokülasyon.
- İnsan, domuz ve sığır DNA virüslerinin kantitatif PCR ile nicellendirilmesi.
- Seçilmiş viral göstergeler aracılığıyla kontaminasyon kaynaklarının değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hedeflenen virüslerin başarılı bir şekilde konsantre edilmesi ve nicellendirilmesi.
- Yöntemin mikrobiyall kaynak izleme için etkinliğinin gösterilmesi.
- Adenovirler ve poliomavirüslerin güvenilir göstergeler olarak tanımlanması.
- Su kontaminasyonu değerlendirmesi için maliyet etkin bir çözüm sağlanması.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş yöntem, kontaminasyon kaynaklarını belirlemek için etkilidir.
- DNA virüslerinin kullanılması mikrobiyall kaynak izleme çabalarını artırabilir.
- Bu yaklaşım su kalitesi izlemeyi önemli ölçüde iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
