Name: Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Öğrenin Virochip pan-viral mikroarray testi ile klinik örneklerde bilinen ve yeni viral patojenleri nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, tanısal mikrobiyolojide çoklu virüs tespiti için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Virochip protokolün ilk geliştirme ve optimizasyonu için David Wang, Anatoly Urisman Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, ve Alexander Greninger teşekkür ederim. Bu çalışma bir NIH K08 hibe ve Abbott Keşif Ödülü (CC) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (JLD) tarafından desteklenmektedir.

Virochip testinin adımlar (1) klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyon, (2) çıkarılan RNA ters transkripsiyon ve 2. iplikçik cDNA sentezi, rastgele astarlanmalıdır cDNA (3) PCR, (3) Cy3 floresan boya dahil (4) Virochip mikroarray etiketli malzeme hibridizasyon ve (5) tarama ve analizi (Şekil 1). Aşağıda gösterilen protokol grip benzeri bir hastalığa sahip bir çocuğun bir nazal sürüntü örneği Virochip testinin kullanımını göstermek. Primer Diziler Primer bir 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Nükleik Asit Ekstraksiyonu <ol><li> Bu örnekleri potansiyel bulaşıcı olarak klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyon, Biyolojik Güvenlik Seviye 2 (BSL-2) veya daha yüksek koşulları altında yapılmalıdır. </li><li> Nazal sürüntü örneği viral tutarak orta taşınır. 1.5 ml Eppendorf mikrosantrifüj tüp içine örnek kısım 200 mcL. </li><li> İsteğe Bağlı: 0.22 mikron filtre (viral parçacıkların arındırmak için) geçmesine örnek </li><li> İsteğe bağlı: Turbo DNAz kiti (Ambion) kullanarak üreticinin talimatlarına göre DNAz (ana bilgisayar genomik DNA aşağılamak ve arındırmak için korumalı, encapsidated viral nükleik asit) ile ön işlemden örnek </li><li> Zymo ZR viral RNA Ekstraksiyon Kiti veya üreticinin talimatlarına göre Qiagen Ultrasens Virus Kit kullanarak örnek ayıklayın. </li></ol> 2. Ters Transkripsiyon ve 2.-iplikçik cDNA sentezi ("Yuvarlak A") <ol><li> 4 uL çıkarılan RNA 1 uL 40 mcL / pmol Primer ekleyin. Isı 65 ° C PCR (örneğin GeneAmp PCR Sistemi 9700) ve daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında x 5 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> 2 mcL 5X RT tampon, 1 mcL 12.5 mM dNTP, 1 mcL su, 0.5 mcL 0.1M DTT, ve 0.5 mcL SSIII RT (Invitrogen) oluşan bir ana karışımı 5 mcL ekleyin. 42 ° C'de x 60 dakika. </li><li> Programlanabilir bir PCR, ısı 94 ° 10 serin C x 2 dk (iptal etmek için ters transkriptaz reaksiyonu), ° C, nabız santrifüj, ve ardından 1 mcL 5X Sequenase tampon, 3.8 mcL su oluşan 5 mcL Sequenase karışımı ekleyin, 0.15 mcL Sequenase (USB Corporation). 2. iplikçik sentez için, 10 ° C - 37 ° C 8 dk boyunca, 94, 8 dakika sonra, ısı tutun ° C x 2 dk (Sequenase inaktive etmek için) ve 10 ° C (basılı tutun) serin kadar rampa </li><li> İsteğe bağlı: Rd örnek bir cDNA -20 ° C'de bu noktada saklanabilir </li></ol> 3. PCR Amplifikasyon rastgele Astarlı cDNA ("Yuvarlak B") <ol><li> 5 Rd uL bir örnek, 45 mcL 5 mcL 10X PCR buffer, 1 mcL 12.5 mM dNTP, 1 mcL 100 pmol / mcL astar B, 1 mcL KlenTaq LA (Sigma), ve 37 mcL su oluşan bir ana karışımı ekleyin . </li><li> PCR protokolü aşağıdaki gibi çalıştırın: 94 ° C, 2 dakika → (25 devir 94 ° C, 30 / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 dak.) → 72 ° C, 5 dk → 10 ° C ( basılı tutun) </li><li> % 1.5 agaroz elektroforez jel üzerinde Rd B numunesi kontrol edin. A smear yaklaşık 200 - 1000 bp görüntülenmeyecektir gerekir (Şekil 2A) </li></ol> 4. Cy3 Floresan Boya Kuruluş <ol><li> İsteğe Bağlı: Cy5, floresan boya ile başka bir örnek etiketli olabilir ve aynı mikroarray için melezleşmiştir. </li><li> Aa-dNTP birleştirmek için, 5 uL 10X PCR buffer, 1 uL 12.5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL astar Yatak, 1 oluşan bir ana karışımı 45 uL Rd B numunesinin 5 uL 1 uL KlenTaq LA (Sigma), ve 37 uL su. PCR protokolü aşağıdaki gibi çalıştırın: 94 ° C, 2 dakika → (15 döngü 94 ° C, 30 / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 dak.) → 72 ° C, 5 dk → 10 ° C ( basılı tutun) </li><li> Rd C örnek üreticinin talimatlarına göre DNA Temiz ve Konsantratörü-5 Seti (Zymo Araştırma) ile temizleyin. 10 mcL Zehir. </li><li> 1M bikarbonat 1 uL (Sigma) ve Rd C Örnek 1 uL Cy5 (GE Healthcare) ekleyin. </li><li> Inkübe x 1 saat karanlıkta. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre DNA Temiz ve Konsantratörü-5 Seti (Zymo Araştırma) ile Cy3 etiketli örnek temizleyin. 12 mcL Zehir. </li></ol> 5. Hibridizasyon için Virochip Mikroarray <ol><li> İsteğe bağlı: (numune normalleşmesi için), Nanodrop spektrofotometre dahil cDNA konsantrasyon ve boya miktarını kontrol 1.5 mcL </li><li> 1 mcL 25X parçalanma tampon, 5 mcL 5X engelleme tampon, 9.5 mcL Cy3-etiketli örnek (veya normale miktarı), su ve PCR şeridi tüpü 25 mcL toplam hacmi (Agilent) eklemek </li><li> 2X GEX hibridizasyon tamponu (Agilent) 25 mcL ekleyin. Kabarcıkları kısaca aşağı spin. </li><li> Conta slayt üzerine numune 40 mcL yükleyin. </li><li> Place Agilent baskılı Virochip array (Californi Üniversitesi, San Francisco / Agilent) (aşağı "Agilent" işaretli tarafı) ve conta slayt üst sıkıca vidayı sıkın. </li><li> 65 gecede melezleşme ° C fırında 10 devirde hız ayarı. </li><li> 37 ° C'ye kadar diziler, ön ısıtma ve ön tampon 2 (Agilent) yıkamak için Tampon 1 (Agilent) conta slayt / dizi sandviç sualtı ayrı ele alalım. Tampon 1 x 1 dakika yıkayın. Önceden ısıtılmış tampon 2 x 1 dakika yıkayın. Yavaş yavaş, kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak (kimwipe uzakta doğrudan dizi aktif yüzlerine dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olmak ekstra nem fitil kullanın), tampon 2 slayt kaldırmak </li><li> Slayt slayt tutucunun içine yerleştirin ve dizi tarayıcı takın. </li></ol> 6. Virochip Tarama ve Analizi <ol><li> Tarama Cy3 etiketli dizi araç standart tarama protokolü (Şekil 2B) göre 5 mm veya 2 mm. </li><li> Virochip mikroarray'ler görsel denetim, kümeleme analizi, ya da otomatik Virochip analiz programı tarafından analiz, 11 E-tahmin edin . Bu üç yöntemin her biri tarafından, grip virüsü burun sürüntü örneği (influenza benzeri hastalığı olan bir çocuk) (Şekil 2C) kolayca tespit </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Protokol doğru yapıldığında, bir karalama Rd B adım (Şekil 2A) sonra agaroz jel elektroforez görülebilir. Agilent platformu Virochip mikroarray (Şekil 2B) görsel olarak analiz etmek zor olacak, ama bir virüs varsa kolayca görsel denetim, kümeleme analizi, ve / veya E-Tahmin (Şekil 1C) tespit edilmelidir. Tayini için bir pozitif kontrol olarak hizmet; Numuneler bilinen bir virüs (MS2 bakteriyofaj örneğin tütün mozaik virüsü) nükleik asit ölçülen miktarları ile çivili olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Virochip mikroarray işleme ve analiz şematik klinik örneklerden nükleik asit Çıkarılan rastgele amplifiye floresan boya ile işaretlenmiş ve Virochip mikroarray için melezleşmiştir. Mikroarray'ler 2 mikron çözünürlükte taranır ve E-tahmin de dahil olmak üzere, çeşitli hesaplama araçları kullanılarak analiz edildi. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Virochip tayininde Adımlar amplifikasyon sonra rastgele PCR, bir karalama 200 - 1000 bp jel elektroforezi ile görüntülendi (A) (B) Üç Virochip mikroarray'ler 8 diziler / cam slayt küçük bir bölge ile gösterilir. (C) sağ alt köşesinde, içeride havaya uçurulan bir mikroarray Otomatik mikroarray viral analizi ile klinik örnek, influenza A virüsünün varlığını gösteren E-tahmin edin. Yüksek benzerlik skoru (s = 0.55), bu nedenle bu son derece önemli bir tahmin yapmak, sıfıra yakın bir p-değeri karşılık gelir.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Virochip protokolü burada açıklandığı gibi karmaşık ve yetenekli ve titiz bir araştırma teknisyeni gerektirir. Doğru reaktif konsantrasyonu ve PCR etiketleme koşulları ve hibridizasyon kritik öneme sahiptir. Virochip protokolü nükleik asit ekstraksiyon TRIzol (Invitrogen) gibi bir doku çıkarma yönteminin kullanımı ile hastalıklı dokuların analizi kolayca uyum sağlamak için değiştirilebilir. Problar eklendi veya istenen spektrumu ve kapsamının genişliği elde etmek için gerekli silinmiş olabilir, örneğin &quot;-the-fly&quot;, bakteri ve mantarlar gibi nonviral hedeflerin saptanması için yoklamaları dizayn edilebilir ve ekledi. Henüz geliştirme aşamasında Virochip testinin bazı uygulamalar, klinik laboratuvar, salgın araştırma, saflık taraması, ilaç ve aşılar ve yeni viral patojen keşif geniş spektrumlu bir viral teşhis içerir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / malzeme Adı </th><th> Reaktif / malzeme Adı </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 mcL) </td><td> 2 mcL 5X RT tampon </td></tr><tr><td> 1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mcL su </td></tr><tr><td> 0.5 mcL 0.1M DTT </td></tr><tr><td> 0.5 mcL SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 mcL) </td><td> 1 mcL 5X Sequenase tampon </td></tr><tr><td> 3.8 mcL su </td></tr><tr><td> 0.15 mcL Sequenase (USB Corporation&#39;ın) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 mcL) </td><td> 5 mcL 10X PCR buffer </td></tr><tr><td> 1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mcL 100 mcL / B pmol astar </td></tr><tr><td> 1 mcL KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mcL su </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd C PCR Master Mix (45 mcL) </td><td> 5 uL 10X PCR buffer </td></tr><tr><td> 1 mcL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mcL 100 mcL / B pmol astar </td></tr><tr><td> 1 mcL KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mcL su </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hibridizasyon tamponu (25 mcL) </td><td> 1 mcL 25X parçalanma tampon (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 mcL 5X engelleme tamponu (Agilent) </td></tr><tr><td> Cy3-etiketli örnek (veya normale miktarı 9.5 mcL) </td></tr><tr><td> 25 mcL toplam hacim su ekleyin. </td></tr><tr><td> Agilent Virochip mikroarray </td><td> Chiu laboratuvar, UCSF edinilebilir; bekleyen lisans </td></tr></tbody></table>

viral patojenler klinik Örnekler ekranına bir pan-viral mikroarray testi (virochip)

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Virüslerin doğal dizisi çeşitliliği yanı sıra, geleneksel yöntemlerle algılanamaz SARS coronavirüs ve 2009 pandemik H1N1 influenza virüsü gibi roman viral patojenler, devam eden ortaya çıkması nedeniyle, pek çok bulaşıcı hastalıkların viral nedenlerin tanısı zordur. Bu zorlukları ele almak için, daha önce geliştirilmiş ve kapasitesi ile korunmuş sıra homoloji 1 dayanarak, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman varyantları tespit etmek için Virochip denilen bir pan-viral mikroarray platformu valide . Virochip kullanarak, tam spektrum, eşdeğer ya da geleneksel klinik test 2-5 üstün bir hassasiyet ile hastanede yatan hastalarda açıklanamayan kritik hastalık vakaları da dahil olmak üzere, solunum yolu enfeksiyonları ile ilişkili virüs tespit ettik. Virochip ayrıca, SARS coronavirüs 6,7, bir roman rinovirüs dalının 5, XMRV (prostat kanseri ile bağlantılı bir retrovirüs) 8, kuş bornavirus (papağanlar bir israf hastalığı nedeni) 9, dahil olmak üzere, yeni virüsleri tanımlamak için kullanılır olmuştur solunum ve ishal hastalık 10 ile çocuklarda ve yeni bir cardiovirus. Virochip güncel sürümü Agilent mikroarray platforma taşıdık ve ~ 36.000 probları Aralık 2009 itibariyle GenBank ~ üzerinde 1.500 virüslerden kaynaklanan oluşur. Burada örnek nükleik asit ekstraksiyon, rastgele primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, floresan boya dahil, ve mikroarray hibridizasyon, tarama ve analiz de dahil olmak üzere, (~ 24 saat gerçekleştirme süresi) bitirmek için baştan bir Virochip testi işleme dahil adımları ortaya koymaktadır.

Virochip korunmuş dizi homoloji temelinde aynı anda, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman virüsler tespit etmek için tasarlanmış bir pan-viral mikroarray. İşte biz, varlığı bilinen ve bilinmeyen virüslere hem de klinik örnekleri analiz etmek için bir Virochip tahlil nasıl çalıştırılacağını göstermektedir.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Birçok enfeksiyöz hastalığın viral nedenlerinin teşhisi, virüslerin doğasında bulunan sekans çeşitliliğinin yanı sıra sürekli olarak ortaya çıkan...

Bu prosedür, klinik örnekleri hem bilinen hem de bilinmeyen virüsler açısından analiz etmek için pan viral bir mikroarray testi olan Viro çipi kullanır. İlk olarak, klinik örneklerden nükleik asitler ekstre edilir. Ardından, ekstrakte edilen RNA, rastgele primerler kullanılarak ters transkripsiyona uğratılır.İkinci zincir CD NA sentezi gerçekleştirilir ve CD NA kütüphanesi rastgele PCR ile çoğaltılır. Ardından, çoğaltılmış cd NA floresan boyalarla işaretlenir ve viral çip mikroarray'ine hibridize edilir. Son adım, mikroarray'in taranması ve analiz edilmesidir.Nihayetinde, çip mikroarray analiz yoluyla bir virüsün veya birden fazla virüsün varlığı veya yokluğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Viral çip mikroarray gibi geniş spektrumlu tespit yöntemleri diyagnostik mikrobiyolojide gereklidir; çünkü pnömoni gibi yaygın klinik sendromlar herhangi bir tekil patojene özgü değildir ve SARS Koronavirüs ile 2009 yeni H1N1 influenza virüsü gibi sürekli ortaya çıkan yeni viral patojen tehditleri söz konusudur. Bu yöntem, klinik ortamdaki tanı konulmamış enfeksiyonların yüzde kaçının henüz tanımlanmamış yeni virüslerden kaynaklanabileceği gibi, diyagnostik mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yüzlerce hatta binlerce potansiyel patojeni eş zamanlı olarak test ettiğimiz için, bu tekniğin etkileri hastanedeki akut klinik hastalıkların daha iyi teşhis edilmesine kadar uzanmaktadır.Bu yöntemle ilgili fikrimiz ilk olarak, UCSF'de Dr. Joseph DeRisi'nin laboratuvarında öncülük edilen yeni geliştirilmiş mikro-diziler teknolojisini virüslerin tespitine uygulama kararı aldığımız 2002 yılında ortaya çıktı. İlk gerçek dünya test vakamız, 2003 yılında SARS'tan sorumlu yeni bir koronavirüsü tanımlamak için viral çip kullanmaktı; prosedürün başından sonuna kadar gösterimi, bir çocuğun akut solunum yolu hastalığının nedenini teşhis etmek için bir nazal sürüntü örneği üzerinde viral çip analizinin kullanımını gösterecek olan laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından gerçekleştirilecektir. Nazofaringeal sürüntü örnekleri, viral taşıma sıvı ortamı içeren steril kaplarda toplanır ve -80 °C dondurucuda donmuş halde saklanır.Bir biyogüvenlik kabininde, numuneyi içeren tüpün çözülmesini bekleyin ve pamuklu çubuğu biyotehlikeli atık kutusuna atmadan önce besiyeri içinde kısa bir süre karıştırın. Ardından, numuneden 200 µL alarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Viral partikülleri saflaştırmak için numuneyi 0,22 µm'lik bir santrifüj filtreden geçirerek yeni bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın.Ardından, konak genomik DNA'sını degrade etmek ve korumalı kapsüllenmiş viral nükleik asidi saflaştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien marka Turbo DNA kitini kullanın. Bunu, üretici talimatlarına uygun olarak XMO ZR viral RNA ekstraksiyon kiti veya Qiagen ultrasound virus kiti ile RNA ekstraksiyonu yaparak takip edin. Ekstre edilen RNA'nın konsantrasyonunu NanoDrop nükleik asit spektrofotometresi kullanarak ölçün.RNA konsantrasyonunun tercihen mikrolitre başına en az 10 ng olması önerilir, ancak ince duvarlı 200 µL'lik tüp kullanıldığında bu değer örnekten örneğe farklılık gösterecektir. Ekstrakte edilen 4 µL RNA'ya, 40 pmole/µL konsantrasyonda 1 µL primer A ekleyin. Örneği bir termosiklet cihazında beş dakika boyunca 65 °C'ye ısıtın ve ardından tüpün beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Ardından, bir termosiklet cihazında; iki mikrolitre 5x RT tamponu, bir mikrolitre 12.5 mM dNTP, bir mikrolitre su, 0.5 mikrolitre 0.1 M DTT ve 0.5 mikrolitre ters transkriptaz içeren beş mikrolitrelik bir master mix ekleyin. Tüpü 42 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra örneği 94 °C'de iki dakika boyunca ısıtın.Ters transkriptaz reaksiyonunu durdurmak için, iki dakika boyunca 10 °C'ye çağırın ve beş saniye boyunca kısa süreli santrifüj yapın. Ardından; 1 µL 5x quease tamponu, 3,8 µL su ve 0,15 µL quease ikinci zincir sentezinden oluşan beş mikrolitre quease karışımı ekleyin. Termosiklörü sekiz dakika içinde 10 °C'den 37 °C'ye yükseltin.37 °C'de sekiz dakika boyunca bekletin. Ardından, kuazı inaktive etmek için 94 °C'de iki dakika boyunca ısıtın ve bu noktada 10 °C'ye soğutun. İsteğe bağlı olarak, 15 µL cDNA içeren örneği -20 °C'de saklayın.İlk olarak, beş µL CD NA örneğini; beş µL 10x PCR tamponu, bir µL 12,5 mM dNTP, bir µL 100 pmol/µL primer B, bir µL cleantech LA ve 37 µL sudan oluşan 45 µL'lik bir master mix'e ekleyin. Ardından, PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 °C, ardından 25 döngü boyunca 30 saniye 94 °C, 45 saniye 50 °C ve bir dakika 72 °C.Ardından beş dakika boyunca 72 °C'de bir uzama aşaması ve PCR sonrası 10 °C'de bekletme uygulanır. PCR ürünü %1,5'lik agarose elektroforez jeli ile kontrol edilir. Yaklaşık 200 ile 1000 baz çifti arasında bir yayılma (smear) görülmelidir.AAD DNTP eklemek için, beş mikrolitre viral PCR ürününü; beş mikrolitre 10 kat PCR tamponu, bir mikrolitre 12,5 milimolar A-A-D-N-T-P, bir mikrolitre 100 p çoklu mikrolitre primer B, bir mikrolitre ClinTech LA ve 37 mikrolitre sudan oluşan 45 mikrolitrelik bir master mix'e ekleyin. PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 degrees Celsius, 94 degrees Celsius'te 30 saniye ve 50 degrees Celsius'te 45 saniyeden oluşan 15 döngü.Bir dakika boyunca 72 °C'de, ardından beş dakika boyunca 72 °C'de bir bekletme adımında ve 10 °C'de tutun. Daha sonra yeni PCR ürününü, üretici talimatlarına uygun olarak DNA clean and concentrator three kiti ile temizleyin ve 10 µL elüsyon tamponunda çözün. 10 µL'lik PCR ürününe bir µL 1 M bikarbonat ve bir µL si three ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, S işaretli örneği tekrar DNA clean and concentrator five kiti ile temizleyin ve 12 µL elüsyon tamponunda elüye edin. Bir PCR şerit tüpünde, 1 µL 25x fragmantasyon tamponu, 5 µL 5x bloklama tamponu, 9,5 µL veya S I 3 işaretli örneğin 10 pM/µL normalize edilmiş final konsantrasyonu için gerekli miktar ve toplam hacmi 25 µL'ye tamamlayacak kadar su ekleyerek, cDNA konsantrasyonunu ve eklenen boya miktarını bir NanoDrop spektrofotometrede kontrol etmek için 1,5 µL örnek kullanın. Sonra 25 µL 2x GX hibridizasyon tamponu ekleyin ve kabarcıkları gidermek için kısa süre santrifüjleyin.Hibritleşme haznesine yeni bir conta lamı yerleştirin. Conta lamının üzerine 40 µL örnek yükleyin. Ardından, Agilent işaretli tarafı aşağı gelecek şekilde Agilent basılı viral diziyi conta lamının üzerine yerleştirin ve vidayı sıkıca sabitleyin.Hibridizasyon odasını 65 °C'lik bir fırına yerleştirin ve dizileri yıkamak için dakikada 10 devir hızında yavaş rotasyon uygulayarak gece boyunca hibridize edin. İlk olarak, ısıtma işlemi sırasında tampon iki'yi 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. 500 mL'lik plastik bir kabı yaklaşık 250 mL tampon bir ile doldurun.Diziyi hibridizasyon odasından çıkarın, diziyi daldırın ve conta lamdan ayırın. Diziyi temiz bir kaba aktarın ve bir dakika boyunca birinci tamponla yıkayın. Ardından, ayrı bir 500 mililitre plastik kap kullanarak işlemi sürdürün.Diziyi, önceden ısıtılmış tampon iki içerisinde bir dakika boyunca yıkayın. Yıkama işleminden sonra, kabarcık oluşmamasına dikkat ederek diziyi tampon ikiden yavaşça çıkarın.Dizinin aktif tarafına doğrudan dokunmamaya dikkat ederek, fazla nemi almak için bir kim wipe kullanın. Son olarak, lamı Agilent tarafı yukarı gelecek şekilde lam tutucuya yerleştirin ve dizi tarayıcısına yerleştirin. Bu prosedürde, bir Agilent iki mikron DNA mikro-dizi tarayıcısı kullanıyoruz.Cihazın standart tarama protokolüne uygun olarak, etiketlenmiş üçlü diziyi beş mikron veya iki mikron seviyesinde tarayın. Viral çip mikro-dizilerini, küme analizi veya otomatik RO çip analiz programı e unpredic ile analiz edin. Viro Chipp mikro-dizisi kullanılarak, influenza benzeri hastalığı olan bir çocuktan alınan nazal sürüntü örneğinde 2009 yeni influenza H1N1 virüsü kolayca tespit edilmektedir.Ek olarak, viral çipin yalnızca solunum yolu virüslerini değil, aynı zamanda çeşitli farklı doku ve vücut sıvılarından gelen geniş bir virüs yelpazesini tanımlayabildiğini gösterdik. Burada gösterildiği üzere, vichi kullanılarak tam kan ve serumda gerçekleştirilen bazı virüs tespit örnekleri yer almaktadır. Bunlar; her bir örnek için dört hastadan alınan tam kan veya serum kan örneklerinden elde edilen viro çip mikro-dizilerine karşılık gelen sonuçlardır; en düşük P değerine sahip olan en üstteki virüs tahminiyle birlikte, ilk iki virüs tahmini gösterilmiştir.Örneğin, açık maviyle vurgulanan örnekte, o örnek için en üst sıradaki tahmin dengue virüsü tip bir'dir. İkinci sıradaki tahmin dengue virüsü tip iki olsa da, bu tam kan örneğindeki gerçek virüsün, dict sonuçlarıyla uyumlu olarak gerçekten dengue virüsü tip bir olduğu doğrulanmıştır. Viro chipin bir başka uygulama alanı ise yeni patojenlerin keşfidir.Bazı örnekler arasında sars koronavirüsü X-M-R-V-A, insanlarda prostat kanseri ve kronik yorgunluk sendromu ile bağlantılı OME retrovirüsü ve çocuklarda solunum yolu ve ishal enfeksiyonları ile ilişkili yeni bir insan kardiyovirüsü olan HTCV'nin keşifleri yer almaktadır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında 12 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, gerekli tüm ekipman ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olunması önemlidir.Sıradışı viral çip hibridizasyon modellerini veya geliştirilmesinden sonra yeni bir virüsün varlığını düşündüren viral çip sonuçlarını doğrulamak ve takip etmek amacıyla, spesifik viral PCR amplifikasyonu ve derin sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik; onkoloji alanındaki araştırmacıların yeni virüslerin kanserle olan ilişkisini araştırmalarına, biyosavunma ve klinik mikrobiyoloji alanlarında hızlı patojen teşhisi için yoğunlaştırılmış mikro tabanlı analizler geliştirmelerine ve viroloji alanında yeni virüslerin karakterizasyonu ile hastalıklarla ilişkilerini belirlemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, klinik örneklerde viral patojenleri tespit etmeye yönelik geniş spektrumlu bir sürveyans testi olan viral çip mikroarray analizinin; klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyonundan başlayıp mikroarray hibridizasyonu ve analizine kadar olan tüm adımlarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Klinik örneklerle çalışmanın biyotehlikeli olarak kabul edildiğini ve nükleik asit ekstraksiyonunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek olan laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Bu videoda, influenza virüsü suşlarının antijenik alt tipleriyle basılmış bir mikrodizi slaytı kullanarak birden fazla insan serum örneğinde antikor izotiplerini tespit etme sürecini gösteriyoruz.

Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Bu video, antiviral bileşiklerin taranması için bir viral bağlanma testini göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş hepatit C virüsü ve lusiferaz kullanarak, tek başına virüsle tedavi edilen kuyucuklara kıyasla birlikte tedavi edilen kuyucuklarda daha düşük ışık yoğunluğu ile belirtildiği gibi, viral bağlanma üzerindeki inhibitör etkileri değerlendirir.

Antiviral Bileşiklerin Taranması için Bir Viral Bağlanma Testi

Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Öğrenin Virochip pan-viral mikroarray testi ile klinik örneklerde bilinen ve yeni viral patojenleri nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, tanısal mikrobiyolojide çoklu virüs tespiti için güçlü bir araç sunar.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Daha fazla video keşfet