Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Bu prosedür, klinik örnekleri hem bilinen hem de bilinmeyen virüsler açısından analiz etmek için pan viral bir mikroarray deneyi olan Viro çipini kullanır. İlk olarak nükleik asitler klinik örneklerden ekstrakte edilir. Ardından, ekstrakte edilen RNA rastgele primerler kullanılarak ters transkripsiyona tabi tutulur.

İkinci zincir cDNA sentezi gerçekleştirilir ve cDNA kütüphanesi rastgele PCR ile çoğaltılır. Ardından, çoğaltılan cDNA floresan boyalarla işaretlenir ve viral çip mikroarrayine hibridize edilir. Son adım, mikroarrayin taranması ve analiz edilmesidir.

Nihayetinde, çip mikroarray analiz yoluyla bir virüsün veya birkaç virüsün varlığına veya yokluğuna dair sonuçlar elde edilebilir. Viral çip mikroarray gibi geniş spektrumlu tespit yöntemlerine tanısal mikrobiyolojide ihtiyaç duyulmaktadır; çünkü zatürre gibi yaygın klinik sendromlar herhangi bir bireysel patojene özgü değildir ve SARS Koronavirüsü ile 2009 yeni H1N1 influenza virüsü gibi yeni viral patojenlerin sürekli ortaya çıkan tehdidi söz konusudur. Bu yöntem, klinik ortamdaki tanı konulmamış enfeksiyonların yüzde kaçının henüz tanımlanmamış yeni virüslerden kaynaklanabileceği gibi, tanısal mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yüzlerce hatta binlerce potansiyel patojeni eş zamanlı olarak test ettiğimiz için, bu tekniğin etkileri hastanedeki akut klinik hastalıkların daha iyi teşhis edilmesine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, UCSF'de Dr. Joseph DeRisi'nin laboratuvarında öncülük edilen yeni geliştirilmiş mikroarray teknolojisini virüslerin tespitine uygulama kararı aldığımız 2002 yılında ortaya çıktı. İlk gerçek dünya test vakamız, 2003 yılında SARS'tan sorumlu yeni bir koronavirüsü tanımlamak için viral çip kullanmak oldu; prosedürü baştan sona gösterecek olan laboratuvarımdan bir teknisyen, bir çocuğun akut solunum yolu hastalığının nedenini teşhis etmek için burun sürüntü örneği üzerinde viral çip analizinin kullanımını uygulamalı olarak gösterecektir. Nazofaringeal sürüntü örnekleri, viral taşıma sıvı ortamı içeren steril kaplarda toplayıp -80 °C dondurucuda donmuş halde saklanır.

Biyogüvenlik kabininde, numuneyi içeren tüpün çözülmesini bekleyin ve pamuklu çubuğu biyotehlikeli atık kutusuna atmadan önce besiyeri içinde kısa bir süre karıştırın. Ardından, numuneden 200 µL alarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Viral partikülleri saflaştırmak için numuneyi 0,22 µm'lik bir spin filtreden geçirerek yeni bir 1,5 mL'lik tüpe toplayın.

Ardından, konak genomik DNA'sını degrade etmek ve korunaklı kapsüllenmiş viral nükleik asidi saflaştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien'dan Turbo DNA kitini kullanın. Bunu, üretici talimatlarına göre XMO ZR viral RNA ekstraksiyon kiti veya Qiagen ultrasound virus kitini kullanarak RNA ekstraksiyonu ile takip edin. Ekstrakt RNA'nın konsantrasyonunu bir NanoDrop nükleik asit spektrofotometresi kullanarak ölçün.

RNA konsantrasyonu tercihen mikrolitre başına en az 10 nanogram olmalıdır, ancak ince duvarlı 200 mikrolitre tüp kullanıldığında örnekten örneğe farklılık gösterecektir. Ekstrakt RNA'nın dört mikrolitresine, mikrolitre başına 40 PICA mol konsantrasyonundaki primer A'dan bir mikrolitre ekleyin. Örneği bir termosiklet cihazında beş dakika boyunca 65 degrees Celsius'e ısıtın ve ardından tüpün oda sıcaklığında beş dakika soğumasını bekleyin.

Ardından, bir termosiklatörde iki mikrolitre 5X RT tamponu, bir mikrolitre 12,5 mM dNTP, bir mikrolitre su, 0,5 mikrolitre 0,1 M DTT ve 0,5 mikrolitre³ ters transkriptaz içeren beş mikrolitre master mix ekleyin. Tüpü 42 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra örneği 94 °C'de iki dakika boyunca ısıtın.

Ters transkriptaz reaksiyonunu durdurmak için, sıcaklığı iki dakika boyunca 10 °C'ye düşürün ve beş saniye boyunca kısa santrifüj yapın. Ardından; 1 µL 5x quease tamponu, 3,8 µL su ve 0,15 µL ikinci zincir sentezi quease'inden oluşan beş mikrolitre quease karışımı ekleyin. Termosiklet cihazının sıcaklığını sekiz dakika içerisinde 10 °C'den 37 °C'ye yükseltin.

37 °C'de sekiz dakika bekletin. Ardından, enzimini inaktive etmek için 94 °C'de iki dakika ısıtın ve bu noktada 10 °C'ye soğutun. İstenirse, 15 µL cDNA içeren örneği -20 °C'de saklayın.

İlk olarak, beş µL CD NA örneğini; beş µL 10x PCR tamponu, bir µL 12,5 mM dNTP, bir µL 100 pmol/µL primer B, bir µL cleantech LA ve 37 µL sudan oluşan 45 µL'lik bir master mix'e ekleyin. Ardından PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 °C, ardından 25 döngü boyunca 30 saniye 94 °C, 45 saniye 50 °C ve bir dakika 72 °C.

Ardından 72 °C'de beş dakikalık bir uzatma adımı uygulanır ve PCR sonrası 10 °C'de bekletilir. PCR ürünü %1,5'luk bir agaroz elektroforez jeli ile kontrol edilir. Yaklaşık 200 ila 1000 baz çifti arasında bir yayılma (smear) gözlemlenmelidir.

AAD DNTP eklemek için, beş µL viral PCR ürününü; beş µL 10x PCR tamponu, bir µL 12.5 mM A-A-D-N-T-P, bir µL 100 p çoklu µL primer B, bir µL ClinTech LA ve 37 µL sudan oluşan 45 µL'lik bir master mix'e ekleyin. PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 °C, ardından 94 °C'de 30 saniye ve 50 °C'de 45 saniyeden oluşan 15 döngü.

Bir dakika boyunca 72 °C'de, ardından beş dakika boyunca 72 °C'de bir uzatma adımı uygulayın ve 10 °C'de bekletin. Daha sonra, yeni PCR ürününü üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA clean and concentrator three kiti ile temizleyin ve 10 µL elüsyon tamponu ile seyreltin. 10 µL PCR ürününe bir µL 1 M bikarbonat ve bir µL si three ekleyin ve karanlıkta bir saat inkübe edin.

Ardından, S etiketli örneği tekrar DNA clean and concentrator five kiti ile temizleyin ve 12 µL elüsyon tamponunda elüe edin. Bir PCR şerit tüpü içerisinde; 1 µL 25x fragmantasyon tamponu, 5 µL 5x bloklama tamponu, 10 pM/µL normalleştirilmiş nihai SI3 etiketli örnek konsantrasyonu için gerekli miktar olan 9,5 µL örnek ve toplam hacmi 25 µL'ye tamamlayacak kadar su kullanarak, NanoDrop spektrofotometrede cDNA konsantrasyonunu ve eklenen boya miktarını kontrol etmek için 1,5 µL örnek kullanın. Daha sonra 25 µL 2x GX hibridizasyon tamponu ekleyin ve kabarcıkları gidermek için kısa süreli santrifüj yapın.

Hibridizasyon odasına yeni bir conta lamı yerleştirin. Conta lamının üzerine 40 µL örnek yükleyin. Ardından, Agilent baskılı viral diziyi, Agilent işaretli tarafı aşağı gelecek şekilde conta lamının üzerine yerleştirin ve vidayı sıkıca sabitleyin.

Hibritleme odasını 65 °C'lik bir fırına yerleştirin ve dizileri yıkamak için dakikada 10 rotasyonluk yavaş bir döndürme kullanarak gece boyunca hibritleme yapın. İlk olarak, ısıtma sırasında tampon iki'yi 37 °C'ye ön ısıtın. 500 ml'lik plastik bir kabı yaklaşık 250 ml tampon bir ile doldurun.

Diziyi hibridizasyon odasından çıkarın, diziyi daldırın ve conta lamdan ayırın. Diziyi temiz kaba aktarın ve bir dakika boyunca birinci tampon çözelti ile yıkayın. Ardından, ayrı bir 500 mililitrelik plastik kap kullanın.

Diziyi önceden ısıtılmış ikinci tampon çözeltide bir dakika boyunca yıkayın. Yıkama işleminden sonra, kabarcık oluşmamasına dikkat ederek diziyi ikinci tampon çözeltiden yavaşça çıkarın.

Dizinin aktif tarafına doğrudan dokunmamaya dikkat ederek, fazla nemi bir kim wipe ile emdirin. Son olarak, lamı Agilent tarafı yukarı gelecek şekilde lam tutucuya yerleştirin ve dizi tarayıcısına yerleştirin. Bu prosedürde, Agilent iki mikron DNA mikroarray tarayıcısı kullanmaktayız.

SI üç etiketli diziyi, cihazın standart tarama protokoluna uygun olarak beş mikron veya iki mikron seviyesinde tarayın. Viral çip mikro-dizilerini, kümeleme analizi veya otomatik RO çip analiz programı e unpredic ile analiz edin. Viro Chipp mikro-dizisi kullanılarak, influenza benzeri hastalığı olan bir çocuktan alınan nasal sürüntü örneğinde 2009 yeni influenza H one N one virüsü kolaylıkla tespit edilir.

Ek olarak, viral çipin yalnızca solunum yolu virüslerini değil, aynı zamanda çeşitli doku ve vücut sıvılarından gelen geniş bir virüs yelpazesini tanımlayabildiğini gösterdik. Burada gösterildiği üzere, vichi kullanılarak tam kan ve serumda gerçekleştirilen virüs tespitine bazı örnekler yer almaktadır. Bunlar, kan örneklerinden (her örnek için dört hastadan alınan tam kan veya serum) elde edilen viro chip mikroarray'e karşılık gelen sonuçlardır; en düşük P değerine sahip olan en üstteki virüs tahmini ile birlikte ilk iki virüs tahmini gösterilmiştir.

Örneğin, açık mavi ile vurgulanan örnekte, söz konusu örnek için en üstteki öngörü dengue virüsü tip bir'dir. İkinci sıradaki öngörü dengue virüsü tip iki olsa da, bu tüm kan örneğindeki gerçek virüsün, dict sonuçlarıyla uyumlu olarak dengue virüsü tip bir olduğu onaylanmıştır. Viro çipin bir diğer uygulaması ise yeni patojen keşfidir.

Bazı örnekler arasında sars koronavirüs X-M-R-V-A, insanlarda prostat kanseri ve kronik yorgunluk sendromu ile bağlantılı OME retrovirüsü ve çocuklarda solunum yolu ve diyare enfeksiyonları ile ilişkili yeni bir insan kardiyovirüsü olan HTCV keşifleri yer almaktadır. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse 12 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, tüm gerekli ekipman ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olmak önemlidir.

Sıra dışı viral çip hibridizasyon modellerini veya geliştirilmesinin ardından yeni bir virüsün varlığına işaret eden viral çip sonuçlarını doğrulamak ve takip etmek için spesifik viral PCR amplifikasyonu ve derin sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik; onkoloji alanındaki araştırmacıların yeni virüslerin kanserle olan ilişkisini keşfetmelerine, biyosavunma ve klinik mikrobiyoloji alanlarında hızlı patojen teşhisi için yoğunlaştırılmış mikro tabanlı analizlerin geliştirilmesine ve viroloji alanında yeni virüslerin karakterizasyonu ile hastalıkla olan ilişkilerinin belirlenmesine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, klinik örneklerde viral patojenleri tespit etmeye yönelik geniş spektrumlu bir sürveyans testi olan viral çip mikroarray analizinin; klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyonundan başlayarak mikroarray hibridizasyonu ve analizine kadar tüm adımlarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

Klinik örneklerle çalışmanın biyotehlikeli kabul edildiğini ve nükleik asit ekstraksiyonunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek olan laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.