Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Bu prosedür, hem bilinen hem de bilinmeyen virüsler için klinik örnekleri analiz etmek için bir pan viral mikrodizi testi olan Viro çipini kullanır. İlk olarak, nükleik asitler klinik örneklerden ekstrakte edilir. Daha sonra, ekstrakte edilen RNA, rastgele primerler kullanılarak ters çevrilir.

İkinci iplikli CD NA sentezi gerçekleştirilir ve CD NA kütüphanesi rastgele PCR ile amplifiye edilir. Daha sonra amplifiye edilmiş cd NA, floresan boyalarla etiketlenir ve bir viral çip mikrodizisine hibritlenir. Son adım, mikrodiziyi taramak ve analiz etmektir.

Sonuç olarak, çip mikrodizisinin analizi yoluyla bir virüsün veya birkaç virüsün varlığını veya yokluğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Pnömoni gibi yaygın klinik sendromlar, herhangi bir bireysel patojene özgü olmadığından ve SARS Coronavirus ve 2009 yeni H one N one influenza virüsü gibi yeni viral patojenlerin sürekli ortaya çıkan tehdidi nedeniyle, tanısal mikrobiyolojide viral chipp mikrodizisi gibi geniş spektrumlu tespit yöntemlerine ihtiyaç vardır, Bu yöntem, tanısal mikrobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, Klinik ortamda teşhis edilmemiş enfeksiyonların yüzde kaçının henüz tanımlanmamış yeni virüslerden kaynaklanabileceği gibi. Bu tekniğin etkileri, hastanede akut klinik hastalığın daha iyi teşhisine kadar uzanır, çünkü aynı anda yüzlerce ila binlerce potansiyel patojeni test ediyoruz.

Bu yöntem fikri ilk olarak 2002 yılında, UCSF'deki Dr. Joseph DeRisi'nin laboratuvarında öncülük edilen yeni geliştirilen mikrodizi teknolojisini virüslerin tespitine uygulamaya karar verdiğimizde aklımıza geldi. İlk gerçek dünya test vakamız, 2003 yılında SARS'tan sorumlu yeni bir koronavirüsü tanımlamak için viral çipi kullanmaktı ve prosedürü baştan sona göstermek, akut solunum yolu hastalığının nedenini teşhis etmek için bir çocuktan alınan burun sürüntüsü örneğinde viral çip testinin kullanımını gösterecek olan laboratuvarımdan bir teknisyen olacak. Nazofaringeal sürüntü örnekleri, viral taşıma, sıvı ortam içeren steril kaplarda toplanır ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda donmuş olarak saklanır.

Bir biyogüvenlik başlığında, numuneyi içeren tüpün çözülmesine izin verin ve swabı biyolojik olarak tehlikeli bir bel kutusuna atmadan önce swabı ortamda kısa bir süre karıştırın. Daha sonra numunenin 200 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir tüpe alın. Viral partikülleri saflaştırmak için numuneyi 0,22 mikronluk bir spin filtreden geçirin ve 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe koyun.

Ardından, konakçı genomik DNA'yı parçalamak ve korunan kapsüllenmiş viral nükleik asit için saflaştırmak için üreticinin talimatlarına göre Ambien'in Turbo DNA kitini kullanın. Bunu, üreticinin talimatlarına göre XMO ZR viral RNA ekstraksiyon kitini veya Qiagen ultrasonun virüs kitini kullanarak RNA ekstraksiyonu ile takip edin. Bir NanoDrop nükleik asit spektrofotometresi kullanarak ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu ölçün.

RNA konsantrasyonu tercihen mikrolitre başına en az 10 nanogramdır, ancak ince duvarlı 200 mikrolitrelik bir tüp kullanılarak numuneden numuneye değişecektir. Dört mikrolitre ekstrakte edilmiş RNA'ya mikrolitre başına 40 PICA mol konsantrasyonunda bir mikrolitre primer A ekleyin. Numuneyi bir termocycler'da beş dakika boyunca 65 santigrat dereceye ısıtın ve ardından tüpü beş dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

Daha sonra, iki mikrolitre beş kez RT tamponu, bir mikrolitre 12.5 milimolar, DNTP bir mikrolitre su 0.5 mikrolitre, 0.1 molar DTT ve 0.5 mikrolitre üst simge üç, ters transkriptaz içeren bir ana karışımın beş mikrolitresini ekleyin. Tüpü 42 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Ardından numuneyi iki dakika boyunca 94 santigrat dereceye ısıtın.

Ters transkriptaz reaksiyonunu iptal etmek için, iki dakika boyunca 10 santigrat dereceye çağırın ve beş saniye boyunca nabız santrifüjünü yapın. Daha sonra, bir mikrolitre beş kez quease tamponu, 3.8 mikrolitre su ve 0.15 mikrolitre quease içeren beş mikrolitre quease karışımı ekleyin, ikinci iplik sentezi. Termocycler'ı sekiz dakika içinde 10 santigrat dereceden 37 santigrat dereceye yükseltin.

Sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede tutun. Ardından, telazı etkisiz hale getirmek için iki dakika boyunca 94 santigrat dereceye ısıtın ve bu noktada 10 santigrat dereceye çağırın. İstenirse, 15 mikrolitre CDNA içeren numuneyi eksi 20 santigrat derecede saklayın.

İlk olarak, beş mikrolitre 10 kez PCR tamponu, bir mikrolitre 12.5 milimolar, DNTP bir mikrolitre 100 pomo mikrolitre astar başına 100 pomo, B bir mikrolitre cleantech LA ve 37 mikrolitre sudan oluşan 45 mikrolitre bir ana karışıma beş mikrolitre CD NA numunesi ekleyin. Ardından PCR protokolünü aşağıdaki gibi çalıştırın, iki dakika boyunca 94 santigrat derece, ardından 30 saniye boyunca 25 döngü 94 santigrat derece. 45 saniye boyunca 50 santigrat derece ve bir dakika boyunca 72 santigrat derece.

Daha sonra beş dakika boyunca 72 santigrat derece diz çökme adımı, ardından PCR'den sonra 10 santigrat derecede tutun. PCR ürününü ve %1.5 AOSE elektroforez jelini kontrol edin. Yaklaşık 200 ila 1000 baz çiftinden oluşan bir yayma görüntülenmelidir.

AAD DNTP'yi dahil etmek için, beş mikrolitre 10 kez PCR tamponu, bir mikrolitre 12.5 milimolar, A-A-D-N-T-P bir mikrolitre 100 p çoklu mikrolitre astar, B bir mikrolitre ClinTech LA ve 37 mikrolitre sudan oluşan 45 mikrolitre bir ana karışıma beş mikrolitre viral PCR ürünü ekleyin. PCR protokolünü aşağıdaki gibi çalıştırın, iki dakika boyunca 94 santigrat derece, 30 saniye boyunca 15 döngü 94 santigrat derece. 45 saniye boyunca 50 santigrat derece.

Bir dakika boyunca 72 santigrat derece ve beş dakika boyunca 72 santigrat derece diz çökme adımı ve 10 santigrat derecede tutun. Ardından, yeni PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre DNA temizleyici ve yoğunlaştırıcı üç kit ile temizleyin ve 10 mikrolitre elüsyon tamponunda yıkayın. 10 mikrolitre PCR ürününe bir mikrolitre bir molar bikarbonat ve bir mikrolitre si üç ekleyin ve karanlıkta bir saat inkübe edin.

Daha sonra, tekrar S etiketli numuneyi DNA temizliği ve yoğunlaştırıcı beş kit ile temizleyin ve 12 mikrolitre elüsyon tamponunda elute edin. CDNA konsantrasyonunu ve bir PCR şerit tüpünde bir NanoDrop spektrofotometresine dahil edilen boya miktarını kontrol etmek için 1,5 mikrolitre numune kullanın: bir mikrolitre, 25 kez parçalanma tamponu, beş mikrolitre, beş kez bloke tamponu, 9,5 mikrolitre veya mikrolitre SI başına 10 tepe veya mol normalleştirilmiş nihai konsantrasyon için gerekli miktar, üç etiketli numune ve toplam 25 mikrolitre hacme kadar su. Daha sonra 25 mikrolitre iki kez GX hibridizasyon tamponu ekleyin ve kabarcıkları çıkarmak için kısa bir süre döndürün.

Hibridizasyon odasına yeni bir conta sürgüsü yerleştirin. Conta kızağına 40 mikrolitre numune yükleyin. Ardından, Agilent baskılı viral diziyi, Agilent işaretli tarafı aşağı bakacak şekilde conta sürgüsünün üzerine yerleştirin ve vidayı sıkıca sıkın.

Hibridizasyon odasını 65 derecelik bir fırına yerleştirin ve dizileri yıkamak için dakikada 10 dönüşlük yavaş bir dönüş kullanarak gece boyunca hibritleyin. İlk olarak, ısıtma sırasında iki ila 37 santigrat derece arasında ön ısıtma tamponu. 500 mililitrelik plastik bir kabı yaklaşık 250 mililitre tamponla doldurun. Bir.

Diziyi hibridizasyon odasından çıkarın, diziyi daldırın ve conta kızağından ayırın. Diziyi temiz bir kaba aktarın ve bir dakika boyunca tamponda yıkayın. Ardından ayrı bir 500 mililitrelik plastik kap kullanarak.

Diziyi önceden ısıtılmış tampon ikide bir dakika boyunca yıkayın. Yıkadıktan sonra, diziyi yavaşça tampondan çıkarın. İki, baloncuklardan kaçınmak için dikkatli olmak.

Dizinin aktif tarafına doğrudan dokunmaktan kaçınmaya dikkat ederken fazla nemi uzaklaştırmak için bir kim'i mendil kullanın. Son olarak, slaytı Agilent tarafı yukarı bakacak şekilde sürgü tutucuya yerleştirin ve dizi tarayıcıya yerleştirin. Bu prosedürde, bir Agilent iki mikron DNA mikroarray tarayıcısı kullanıyoruz.

SI üç etiketli diziyi, cihaz standart tarama protokolüne göre beş mikron veya iki mikron olarak tarayın. Viral chipp mikrodizilerini küme analizi veya otomatik RO chipp analiz programı e unpredic ile analiz edin. Viro Chipp mikrodizisi 2009 yeni influenza H one N one virüsü, grip benzeri hastalığı olan bir çocuktan elde edilen nazal sürüntü örneğinde kolayca tespit edilir.

Ek olarak, viral çipin sadece solunum yolu virüslerini değil, aynı zamanda çeşitli farklı doku ve vücut sıvılarından gelen geniş bir virüs yelpazesini de tanımlayabildiğini gösterdik. Burada gösterildiği gibi vichi kullanılarak tam kan ve serumda virüs tespitine ilişkin bazı örnekler. Bunlar, her örnek için dört hastadan alınan tam kan veya serum kan örneklerinden alınan viro çip mikroışınına karşılık gelen çağrılardır, ilk iki virüs tahmini, en düşük P değerine sahip olan en yüksek virüs tahmini ile gösterilir.

Örneğin, açık mavi renkle vurgulanan örnekte, bu örnek için en iyi tahmin dang virüsü tip birdir. İkinci sıradaki tahmin dang virüsü tip iki olsa da, bu tam kan örneğindeki gerçek virüsün, dikte sonuçlarıyla uyumlu olarak dang virüsü tip bir olduğu doğrulandı. Viro çipinin bir başka uygulaması da yeni patojen keşfidir.

Bazı örnekler arasında sars koronavirüsü X-M-R-V-A, insanlarda prostat kanseri ve kronik yorgunluk sendromu ile bağlantılı OME retrovirüsü ve çocuklarda solunum ve ishal enfeksiyonları ile ilişkili yeni bir insan kardiyo virüsü olan HTCV'nin keşifleri yer alıyor. Bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 12 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben gerekli tüm ekipman ve reaktiflerin mevcudiyetini sağlamayı unutmamak önemlidir.

Spesifik viral PCR amplifikasyonu ve derin dizileme gibi diğer yöntemler, olağandışı viral çip hibridizasyon paternlerini veya yeni bir virüsün gelişimini düşündüren viral çip sonuçlarını doğrulamak ve takip etmek için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların, hızlı patojen tanısı için yoğunlaştırılmış mikro tabanlı testler geliştirmek için biyosavunma ve klinik mikrobiyoloji alanlarında yeni virüslerin kanserle ilişkisini araştırmalarının ve yeni virüslerin karakterizasyonu ve hastalıklarla ilişkilerinin viroloji alanında ilerlemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, nükleik asit ekstraksiyonundan klinik numunelerden mikroray hibridizasyonuna ve analizine kadar klinik numunelerdeki viral patojenleri tespit etmek için geniş spektrumlu bir gözetim testi olan viral çip mikroray testinin tüm adımlarının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Klinik numunelerle çalışmanın biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edildiğini ve nükleik asit ekstraksiyonunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek olarak derecelendirilmiş laboratuvarlarda yapılması gerektiğini unutmayın.