RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

Protokolümüz, kurbağa virüsü 3 için hızlı ve son derece hassas bir tespit sistemi sunar. Önemli bir şekilde, bu yöntem, pandemik hastalıkların ortaya çıkmasını önlemede çok önemli bir rol oynayan DNA virüslerinin bakım noktasında tespit edilmesini sağlar. Bu tekniğin birincil avantajı, taşınabilir bir akıllı telefon tabanlı mikroskop ve AI sınıflandırması ile tamamlanan RPA'nın CRISPR/Cas12a sistemi ile entegrasyonunda yatmaktadır.

Bu entegrasyon, algılama verimliliğini ve doğruluğunu önemli ölçüde artırırken aynı zamanda insan faktörlerine atfedilen hataları da azaltır. Başlamak için, reaksiyon tamponuna dört temel RPA enzimini ekleyin. Daha sonra önceden tasarlanmış astarları karışıma ekleyin.

Karışımı iyice girdaplayın. Her RPA reaksiyonuna kurbağa virüsü 3'ten elde edilen hedef DNA'nın bir mikrolitresini ekleyin ve iyice karıştırmak için girdap yapın. Daha sonra, reaksiyonu başlatmak için yedi mikrolitre 100 milimolar magnezyum klorür pipetleyin.

Tahlili tamamlamak için karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Fonksiyonel kompleksler oluşturmak için Lachnospiraceae bakterisi CAS12a proteinini CRISPR RNA ile hazırlayın. Bakteriyel proteini ve 10 X CRISPR / Cas12a reaksiyon tamponunu karıştırın.

Şimdi 500 nanomolar tek sarmallı DNA muhabir probu ekleyin. CRISPR/Cas12a CRISPR RNA reaksiyon karışımına bir mikrolitre RPA reaksiyon ürünü ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Floresan sinyalleri bir mikroplaka okuyucu ile ölçün. Bir akıllı telefon mikroskobu ile tespit için, önce hazırlanan reaksiyon karışımını geri çekilmiş bir cam slayt üzerine pipetleyin. Daha sonra inkübasyondan önce bir lamel ile örtün.

Slaytı akıllı telefon mikroskobunun sahnesine yerleştirin ve odak uzaklığını ve netliğini ayarlayın. Floresan sinyallerini ölçmek için bir görüntü yakalayın. Her görüntünün ortalama gri değerini ve bir konsantrasyon grubundaki ortalama gri değerin standart sapmasını ölçmek için ImageJ'yi kullanın.

Sınıflandırma için derin öğrenme modeli AlexNet 33'ü benimseyin. Şimdi giriş görüntülerini üç kanalla 224 x 224 olarak yeniden şekillendirmek için Python'u kullanın. Son olarak, görüntü özelliklerini çıkarmak için ImageNet veri kümesine sahip önceden eğitilmiş bir omurga ağı kullanın.

Altıncı primer çifti maksimum amplifikasyon verimliliğini sağladı ve seçildi. CRISPR RNA-3'ün kollateral bölünme için en verimli olduğu kanıtlandı. Seçilmiş RPA primerleri ve CRISPR RNA ile geliştirilmiş bir algılama sisteminin kullanılması, 10 FV3 ile kontrol arasında önemli farklılıklara neden oldu.

Hatırlanması gereken en önemli nokta, özel CAS 12a algılama adımıdır. Reaksiyonun CRISPR RNA'sı, CAS 12a tespitine dayalı olarak diğer DNA virüslerini hedeflemek için değiştirilebilir veya yeniden tasarlanabilir. Önerilen yöntem, hedef virüsün miktarının ön değerlendirmesine yardımcı olabilir.

Buna dayanarak, daha doğru bir viral yük elde etmek için qPCR gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, DNA virüslerinin taşınabilir tespitine yönelik bir ön girişim sağlar. Bu protokolde kullanılan kurbağa virüsü 3'e gelince, zamanında tespit, üreme endüstrisindeki kayıpları azaltarak etkili koruyucu önlemler alabilir.