Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Bu gerçek zamanlı PCR test metodolojisinin genel amacı, hem DNA hem de RNA bazlı patojenleri yüksek verimli bir şekilde birlikte tespit etmektir. Klinik örneklerden elde edilen nükleik asit, bir OpenArray plakasına yüklenen ortak bir primer havuzu ile önceden amplifiye edilecek ve patojenlerin varlığı açısından analiz edilecektir. Bu yöntem, bulaşıcı hastalıklar için OneHealth sürveyans çabalarının desteklenmesine yardımcı olabilir.

Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, bu yöntem daha fazla numunenin birbiriyle rekabet etmeden daha fazla hedef için test edilmesini sağlar ve böylece test verimliliğini artırır. Yöntem, özelleştirilmiş bir nano ölçekli PCR plakası kullanır. Primerler ve problar, açık deliklerin kenarlarına basılır ve numuneler bir sıvı işleyici kullanılarak yüklenir.

Yöntemi, atların ve köpeklerin solunum yolu patojenlerinden oluşan bir panel için test edilen klinik örnekler üzerinde göstereceğiz. Bu prosedüre başlamak için, plakayı metin protokolünde açıklandığı gibi tasarlayın. Burada kullanılan plaka, üç kopya halinde 18 hedef ile yapılandırılmıştır.

Swablara ve trakeal yıkamalara ortam ekleyin, böylece en az bir ila iki mililitre sıvı olur. Swab ve DMEM'i tüpte kuvvetlice girdaplayın. Ardından, yaklaşık 1 mililitre ortamı yeni bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.

Her boncuk tüpüne 235 mikro litre lizis tamponu ve 175 mikro litre numune ekleyin. Toplam nükleik asidi çıkarmak için üreticinin protokolüne devam edin. Önce numune haritasını doğrulayarak metin protokolünde açıklandığı gibi nükleik asit veya preamp'ın ters transkripsiyonu ve ön amplifikasyonu için hazırlanın.

Plakanın yalnızca sol tarafını kullanarak standart 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 8,5 mikro litre preamp ana karışımı ve 5,5 mikro litre DNA/RNA örneği ekleyin. Numuneleri, pozitif kontrolleri ve negatif kontrolleri preamp karışımı ile birleştirdikten sonra, standart 96 oyuklu plakayı şeffaf bir yapışkan conta ile iyice kapatın. Döngü sırasında conta boşluklarının oluşmasını önlemek için bir tıraş bıçağı kullanarak fazla contayı çıkarın.

Bir PCR plaka döndürücü kullanarak kapalı plakayı 20 saniye santrifüjleyin. Tüm reaktiflerin plaka kuyularının dibinde birleştirildiğinden emin olmak için kontrol edin. Geleneksel bir termocycler'ı açtıktan sonra, preamp döngü programı ve programı başlatın.

96 oyuklu plakayı, yalnızca termodöngücünün alt kısmı, ekrandaki sıcaklık okumasını izleyerek cDNA üretimi için gereken sıcaklığa ulaştığında termocycler'a yerleştirin. Bir kez önamp çalışması tamamlandığında, plakanın kapalı kaldığını doğrulayın. Çift eldiven ve kol kapaklarını taktıktan sonra, contayı preamp plakasından çıkarın.

Ardından, dış eldivenleri dikkatlice çıkarın ve atın. 96 kuyulu preamp plakasının bir ila altı arasındaki sütunların her bir oyuğuna 56 mikro litre TE tamponu ekleyerek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırarak preamp ürünlerini bir ila beş arasında seyreltin. Bunu yapmak için, pipetin yalnızca ilk durağına gidin, alttan aspire edin ve daha yükseğe dağıtın, ancak kabarcıklar oluşturmayın.

Kullanılmayan kuyucuklardan bağımsız olarak altı sütunun tümüne TE tamponu ekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi amplifikasyon plakasına 384 oyuklu transfer için hazırlanın. Hazırlık adımlarının tamamlanmasının ardından, iyi oturan yeni çift eldiven ve kol kılıfları giyin.

Düşük hacimlerde pipetleme sırasında yüksek buharlaşma hızları nedeniyle, ana karışımı ve numuneyi verimli bir şekilde dağıtmak ve plakayı hemen kapatmak çok önemlidir. 384 oyuklu bir plakaya 2,5 mikro litre amplifikasyon ana karışımı ekleyin. Burada gösteri amaçlı beyaz plakalar kullanılır, ancak göz yorgunluğunu azaltmak için siyah plakalar kullanılmalıdır.

Seyreltilmiş preamp ürününden 2.5 mikro litre kısmını metin protokolündeki haritaya göre 384 oyuklu plakaya aktarın. Burada gösterilen renkli zarlar, sabit kanallı bir pipet için transfer sırasını göstermektedir. Plakayı hemen bir folyo conta ile sıkıca kapatın.

Dış eldivenleri ve kol kapaklarını atın. 384 oyuklu plakayı PCR plaka döndürücüde 20 saniye santrifüjleyin. Folyo contayı çıkarmayın, ancak 384 oyuklu plakayı sıvı işleyiciye yerleştirin.

Kapalı bir amplifikasyon plakası içeren paketi açın ve seri numarası sağda olacak şekilde ilk yuvadaki sıvı işleyiciye dikkatlice yerleştirin, plakanın yüzeyine dokunmadan kutuyu kenarlarından tutun. Her şey yerine oturduğunda, sıvı işleyicinin içindeki 384 oyuklu plakadan folyo contayı çıkarın. İleri'ye tıklayın ve ardından her adım tamamlandığında tüm kutuları işaretleyin.

Sıvı işleyicinin kapağını kapatın ve hemen doldurma işlemine başlayın. Sıvı işleyicinin yanında kalın ve plaka dolduktan hemen sonra bir sonraki adıma geçin. Sıvı işleyici çalışırken, kasa kapağının altındaki koruyucu filmi çıkarın.

Üst filmi yerinde bırakın. Yapışkandan çıkarmak için kırmızı bandı hafifçe çekerek astarlayın. Yüklü amplifikasyon plakasını sıvı işleyiciden çıkarın ve seri numarası sağda olacak şekilde yavaşça plaka presine yerleştirin.

Kapağı, çentikli ucu sağda ve yapıştırıcı altta olacak şekilde plakanın üstüne yerleştirin. Plaka baskı kolunu dikkatlice kapatarak aşağı çekin, ışık 20 saniye boyunca yanıp sönecektir. Bu süre zarfında plaka presine dokunmayın.

Işık sabit yeşile döndüğünde, kolu yukarı kaldırın ve sızdırmaz plakayı kenarlarından tutarak dikkatlice çıkarın. Sızdırmaz amplifikasyon plakasını kasanın kenarlarından dikey olarak tutarken, şırınga ucunu hemen kasanın ucundaki yükleme portuna yerleştirin, ardından plaka ile kapak arasındaki boşluğu doldurmak için daldırma sıvısını tek bir hafif sürekli hareketle yavaşça dağıtın. Plaka daldırıldıktan sonra köşede küçük bir hava kabarcığı bırakın.

Plakayı kenarlarından dikey olarak tutmaya devam ederken, tapayı porta takarak ve tapayı saat yönünde çevirerek yükleme portunu kapatın, kol kırılana kadar yeterli basınç uygulayın. Kasayı etanol ile iyice püskürtülmüş tüy bırakmayan bir mendille temizleyin. Kasayı kurutmak için kılıfı temiz bir mendille aşağı doğru silin.

Mühürlü plakayı amplifikasyon makinesine getirin. Enstrüman sekmesi altında, enstrüman konsolu'nu seçin. Amplifikasyon makinesini seçin ve ardından kapıyı aç düğmesine tıklayın.

Amplifikasyon plakasını plaka adaptörünün ilk yuvasına yerleştirin ve adaptörün sol üst köşedeki bir adaptörle doğru şekilde hizalandığını kontrol edin. Plakayı, barkod yukarı bakacak ve cihazın ön tarafına doğru yönlendirin. Kapıyı kapat düğmesine tıkladıktan sonra, ekranın altındaki ana sayfa sekmesine gidin.

Çalıştır menüsünde OpenArray'i seçin. Plaka kimliklerini al'ı tıklayın. Çalıştırmayı başlatmak için, çalıştırmayı başlat'a tıklayın.

Sonuçlar makrosunu içeren bir elektronik tablo açın. Dışa aktarılan veri dosyasında, ekranın altındaki sekmeye sağ tıklayın ve taşı veya kopyala'yı seçin. Kitap alanında, sonuçlar makrosunu seçin.

Ardından sonlandırmak için taşı'yı tıklayın ve kopya oluştur etiketli kutuyu işaretleyin. Son olarak, Tamam'ı tıklayın. Eski dışa aktarma sekmesini silin ve yeni eklenen sekmeyi dışa aktarma olarak yeniden adlandırın.

Görünüm'e ve ardından makrolar'a tıklayın ve makroyu seçin, ardından çalıştır'a tıklayın. Ardından, görünümü ve ardından makroları tıklatarak, Makro2'yi seçerek ve çalıştır'ı tıklatarak bunu Makro2 için tekrarlayın. Amplifikasyon makinesi yazılımında, her numune için eğrileri kontrol edin ve ekranın sol tarafındaki analiz/amplifikasyon grafiğini seçerek makro tablosuna göre kontrol edin.

Ardından, numune sekmesini seçin ve tablodaki pozitif sonuçların her biri için iki veya üç pozitif amplifikasyon eğrisi olduğunu doğrulamak için her bir örneğe tıklayın. Floresan okumaları, gerçek zamanlı PCR'nin başarıyla gerçekleştirildiğini göstermek için amplifikasyon döngülerine karşı çizilir. Çoğu numune, gerçek zamanlı PCR reaksiyonunun ikinci ve 25. döngüleri arasında nispi eşik seviyelerine ulaştı.

Pozitif kontroller kullanılarak doğrusallığı ve amplifikasyon aralığını göstermek için üç farklı günde çalıştırılan standart eğriler çizilir. Döngü eşik değerleri, nükleik asit standardının kopya sayısının 10 log tabanına göre çizilir. İki makro, ilk sütundaki örnek adlarını ve olumlu sonuçları olanlar için her hedef için üç Ct değerinin ortalamasını dolduracaktır.

Yükseltilmeyen hedefler bu tabloda boş görünür. 10 klinik örnek ve dört rutin kontrol için kantitatif sonuçlar gösterilmiştir, burada olduğu gibi, negatif amplifikasyon kontrolü tüm hedefler için negatif olmalı ve negatif ekstraksiyon kontrolü sadece iç kontrolü içermelidir. Bu setteki bir numune, numunedeki inhibitörlerin varlığını gösteren başarısız bir dahili kontrolü gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, nano ölçekli bir PCR deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür, veteriner teşhisinde sendrom tabanlı panellerin çalıştırılmasını kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, birçok farklı bulaşıcı hastalığa neden olan ajanlar için makaleler içerecek şekilde uyarlanabilir.