Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Bu deneyin amacı, sağlıklı beyin aktivitesinin, korteksteki kritik durum dinamiklerinin ayırt edici özelliği olan nöronal çığlara kendi kendine organizasyonunu incelemektir. Bu, koronal katmanlı bir korteks diliminin, kortekse gelişimsel olarak önemli dopaminerjik girdiler sağlayan bir orta beyin dilimi ile birleştirilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, Cortex orta beyin ko-kültürü, kültürdeki nöronal aktivitelerin çok bölgeli uyarılmasına ve kaydedilmesine izin veren çok elektrotlu bir dizi üzerinde büyütülür.

Daha sonra, ko-kültürün ilk bir ila iki hafta boyunca MEA yüzeyine düzleşmesine, genişlemesine ve yapışmasına izin veriyoruz, bu da kültürü normal hava ve kültüre maruz kalma yoluyla döngüye sokar. Nöronal çığlara uzay-zamansal yerel alan potansiyel patlamalarının kendiliğinden kendi kendine organizasyonunu gösteren sıvı sonuçları elde edilir. Çığ boyutlarında güç yasasını tanımlayan MEA kayıtlarına ve çevrimdışı çığ analizine dayanmaktadır.

Bu tekniğin, ilişkili kültürler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, sistemleri, sinirbilim yönüdür. Birçok beyin bölgesini bir araya getirebiliriz ve bu çok bölgeli kültürler, kortikal katmanlar ve projeksiyon sistemleri gibi büyük ölçeklerde doğru olan bir beyin organizasyonu kurar. Bu tekniğin uygulamaları sadece nörono çığlarının incelenmesinin ötesine uzanır.

Örneğin, hassas bir şekilde kontrol edilen in vitro koşullar altında ağ düzeyinde yanıt olarak uyaranı inceleyebiliriz. Plazma trombin karışımının uygun şekilde uygulanması ve dokunun MEA üzerinde konumlandırılmasının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu adımlar, uygun zamanlamayı, doğru sıcaklık gradyanını ve hassas MEA yüzeyine doğrudan dokunmaktan kaçınmayı gerektirir.

Kayıtlar için steril sızdırmaz bir cam hazne hazırlamak için, önce ipliğin altından yaklaşık iki milimetre uzakta Teflon plastik kapaklı dişli cam silindirleri kesin. Bunlar, kültür odasının güvenli ve sıkı bir şekilde kapatılması için gereklidir. Daha sonra cam halkaları üç kez suyla durulayarak temizleyin, ardından 200 geçirmez etil alkolde beş dakika kaynatın.

Bunları kuruması için bir kenara koyun, cam halkaları MEA yüzeyine tutturmak için bir silikon solüsyonu gereklidir. Bir hücre koruyucu 180 4 silikon elastomer kiti kullanın ve 15 mililitre A ve B parçalarını iyice karıştırın. Ardından hava kabarcıklarını gidermek için 15 dakika bekletelim.

Çözeltiyi bir mililitre Eloqua'ya ayırın ve ileride kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. Şimdi, küçük bir ölçü iğnesi ile bir şırıngada 23 santigrat derecede bir mililitre silikon alarak ve cam halkanın cilasız kesilmiş yüzeyine uygulayarak bir cam halkayı MEA'ya yapıştırın. Ardından cam halkayı MEA üzerinde ortalayın ve daha güçlü bir sızdırmazlık için halkanın dışına ek bir silikon tabakası uygulayın.

Bu kürlenmeyi sıcak bir tabakta yaklaşık 60 santigrat derecede bir ila iki saat bekletin. Daha sonra, MEA haznesini ve hazne kapaklarını lamina akış başlığı altında, deiyonize suda üç kez, son durulama için %70 alkol ile üç kez durulayarak sterilize edin. Hazneyi alkolün içinde 10 dakika bekletin.

Bunu, hazneyi ve kapağın içini 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak takip edin. 120 santigrat derecede 45 dakika otoklavlayın. Sterilize edildikten sonra kurumasını bekleyin.

Şimdi kültür odasının içindeki MEA yüzeyini poli D lizin ile kaplayın. Bu deneyde kullanılan yeni ölçümler oldukça lipofiliktir, bu nedenle tekrarlanan damlacıklarla kaplanır. Çözeltinin elektrot ızgarasından aspirasyonu.

Depolama ve ileride kullanım için MEA haznesini kapatmak için kapağı takın. Bu prosedür yaklaşık 12 ko-kültür için korteks ve VTA kesitleri verir ve doğumdan bir ila iki gün sonra sağlıklı hayvanlar kullanılarak steril koşullar altında bir lamina akış başlığı içinde gerçekleştirilmelidir, doku toplama için toplam süre bir saatten az olmalıdır. Dekapitasyondan sonra, cildi kafa derisinden çıkarmak için önce iki yanal makas kesisi yaparak beynin çıkarılmasına başlayın.

Çıkarın ve ardından ince bir göz makası kullanarak kafatasını kesin, korteks beyincik kavşağında bir koronal kesikte bir sagital orta hat kesimi yapın. Beyni ortaya çıkarmak için bu kafatası kanatlarının dördünü de geriye doğru çevirin. Daha sonra keskinleştirilmiş bir spatula ile koku ampulünden önden kesin.

Sonra spatulayı beynin altına üç ayda bir ilerletin. Beyni nazikçe kafatasından kaldırın ve soğuk bakışlara kaymasına izin verin. Hızlı soğutma ve geçici depolama için çözüm.

Yukarıdaki prosedürü iki beyin için daha tekrarlayın. VTA dokusu elde etmek için beyinleri steril bir kuru Petri kabına aktarın. Küçük bir spatula kullanarak, her bir beyni yaklaşık bir santimetre yana doğru hafifçe kaydırarak fazla sıvıyı çıkarın.

Ardından, beyincik seviyesinde koronal dikey bir kesim yaparak beyin sapını çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Şimdi, dilimleme prosedürü sırasında beyinlerin mekanik stabilizasyonu için bir agar bloğunu bir montaj diskine yapıştırın. Ardından, diskteki agar bloğunun birkaç milimetre önüne ince bir süper yapıştırıcı çizgisi yerleştirin, ancak yapıştırıcının küçük bir spatula kullanarak agar'a temas etmesini önleyin.

Her bir beyin ön kutbunu aşağı aktarın ve monte edin. Ön kutupların montaj diskine yapıştırıldığından ve ventral tarafların herhangi bir yapıştırıcı kalıntısı olmadan agarla temas ettiğinden emin olun. Bu, kesme sırasında uygun mekanik stabilizasyonu ve kesilen dilimlerin kolayca kaldırılmasını sağlar.

Ardından, monte edilmiş beyinlerle birlikte montaj diskini dikkatlice daldırın ve soğutulmuş bakış solüsyonu ile doldurulmuş bir titreşim tepsisine sabitleyin. Daha sonra dikkatlice temizlenmiş bir tıraş bıçağı kesimi ile, orta beynin 400 mikrometre kalınlığındaki koronal bölümleri en yüksek titreşim frekansında ve nispeten düşük ileri hızda, emme ampullü ters çevrilmiş bir makarna pipeti kullanarak, VTA içeren dilimleri toplayın ve kortikal bölümler için steril soğutulmuş bakış solüsyonu ile doldurulmuş 35 x 10 milimetrelik Petri kaplarına aktarın. Önceki dilimleme adımlarını tekrarlayın, ancak korteks ve beyincik arasına dikey bir kesim uygulayın ve dört beyni ön kutup yukarı bakacak şekilde monte edin.

Striatum seviyesinden başlayarak 350 mikrometre kalınlığında yaklaşık üç koronal dilim toplayın. Şimdi kırık tıraş bıçaklarından yapılmış bir mikro bıçak kullanarak, stereo mikroskop altında VTA'yı içeren frontal korteks ve orta beyin bölgelerinin yaklaşık iki milimetre genişliğindeki koronal bölümlerini inceleyin. Doku bölümünü, soğutulmuş bakış çözeltisi ile doldurulmuş küçük tabaklarda ayrı ayrı toplayın.

Dokuyu MEA odasına monte etmeye başlamak için ilk konumda, MEA oda sıcaklığında, elektrot dizisi odakta olacak şekilde bir stereo mikroskop altında. Ardından 25 mikrolitrelik bir plazma damlacığını temiz, tozsuz ve steril elektrot dizisi matrisi üzerine ortalayın. Küçük bir spatula kullanarak, bir korteks ve VTA bölümünü dikkatlice plazma damlacığına kaydırın.

Şimdi MEA'yı bir soğutma plakasına yerleştirin ve görünümü yeniden odaklayın. Plazma damlacığına 25 mikrolitre trombin eklemeden önce bunun yaklaşık 15 saniye soğumasına izin verin. Daha sonra trombin pipet ucunu kullanarak, plazma trombin karışımını MEA boyunca küçük dairesel hareketlerle dikkatlice yayın.

Kırılgan elektrot dizisine doğrudan dokunmamaya dikkat edin. Daha sonra, korteksi, dizinin ikinci elektrot sırası boyunca dorsal sınır ile dizi üzerine yavaşça yerleştirin. Bu şekilde, gelişen yüzeysel katmanlar sonunda dizinin geri kalanını kaplayacaktır.

Ardından VTA'yı korteks bölümünün ventral sınırına bitişik olarak yerleştirin. Şimdi yüksek nemi korumak için MEA haznesini kapatın ve gevşek bir şekilde kapatın. Plazma trombini, pıhtılaşmayı ve elasyonu sağlamak için MEA kültür düzeneğinin oda sıcaklığında davlumbazın içinde yaklaşık altı dakika oturmasına izin verin.

Bu arada, üç kültür daha hazırlamak için prosedürü tekrarlayın. Daha sonra, küçük damlacıklar halinde, 25 x beş sekizde bir iğne ile bir cc'lik bir şırınga kullanarak, kültür odalarına dikkatlice 600 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Ardından MEA haznesini sıkıca kapatın ve MEA kültür tertibatını inkübatörün içindeki sallanan saklama tepsisine yerleştirin.

İki gün sonra, in vitro, 10 mikrolitre mitoz inhibitörü ekleyin. Daha sonra kültür ortamını dört günde bir in vitro olarak ve daha sonra her dört günde bir% 60 oranında yenileyin. Normal büyüme sırasında, kültür önemli ölçüde düzleşecek ve dorsal olarak hafifçe genişleyecektir.

Yüzeysel kortikal tabakaların gelişmesi nedeniyle, sağlıklı bir kültür, parlak alandaki opak grimsi dokusu ile tanımlanır. Tersine, kültürleri hazırladıktan yaklaşık 10 ila 12 gün sonra ölü dejeneratif hücrelerin bir özelliği olan parlak yansıtıcı veziküller, kayıt ve stimülasyon için hazırdırlar. Bir kayıt oturumunu başlatmak için MEA, saklama tepsisinden kayıt kafası aşamasına aktarılır.

Yerel alan potansiyelini veya LFP'yi kaydetmek için bir ila 200 hertz arasında bir bant geçiren filtre kullanın. Çok birimli aktivite, 300 ila 3000 hertz'lik bir bant geçiren filtre kullanılarak da incelenebilir. Sağlıklı spontan aktivite, farklı boyut ve sürelerde patlamalar halinde ortaya çıkma eğilimindedir.

LFP ile birim aktivite arasındaki ilişkiyi incelemek için, LFP'nin ani tetiklenen ortalamalarını hesaplayabiliriz. Bu korteks kültürleri için, negatif LFP sapmaları, uyaran uyarılmış aktiviteyi kaydetmek için nöronal spiking ile ilişkilidir. İlk olarak, zamansal dalga formu ve uyaranların genliği, bir uyaran üretecini kontrol eden bir yazılımla belirtilir.

Yararlı bir stimülasyon paradigması, bipolar kare dalga formuna sahip akım kontrollü yük nötr tek şoktur. Daha sonra, uyaranları iletmek için kullanılacak bir elektrot seçilir. Tipik uyaranla uyarılan LFP yanıtları, spontan aktivite patlamalarına benzer görünmektedir.

Körleme devresi, uyaran artefaktlarını azaltmak ve amplifikatör doygunluğunu önlemek için stimülasyon sırasında amplifikatörlerin bağlantısını keser. Stimülasyon elektrodu, stimülasyondan kurtulmak için birkaç saniye gerektirir ve bu nedenle yanıt aktivitesini kaydetmek için kullanılamaz. MEA'da, bir elektrotta aktivite ile uzay-zamansal kümelerde ortaya çıkma eğilimindedir ve genellikle diğer bölgelerdeki aktivite eşlik eder.

Aynı zamanda, bu tür aktivite dönemleri sırasında LFP'nin tipik dalga biçimleri, her küme için birkaç saniye arayla meydana gelen üç kümenin aşırı çizimi ile burada gösterilir. Negatif LFP sapmaları, birden fazla negatif sd eşiğini geçen NLFP tepe noktaları çıkarılırken bir saniyelik bir pencere içinde birkaç elektrotta görülebilir, NLFP tepe süreleri biçimindeki aktivite, nokta sütunlarının çeşitli elektrotlarda neredeyse çakışan NPS'yi temsil ettiği bir Rasta'da uygun bir şekilde görselleştirilir. Bu aktivitenin mekansal-zamansal organizasyonu oldukça karmaşıktır.

Düşük zamansal çözünürlükte az ya da çok homojen görünen sütunlar, daha yüksek zamansal çözünürlükte ayrı kümelerden oluşur ve bu böyle devam eder. Uzay, GEOTEMPORAL ve LFP kümelerinin ortaya çıkışı, kortikal ağlarda oldukça organizedir. Daha spesifik olarak, organizasyon nöronal çığlar için varyant olarak ölçeklendirilir.

Bu, belirli bir zamansal çözünürlükte küme boyutlarının olasılığının hesaplanmasıyla gösterilir. Delta T.Here kümeleri, aynı veya ardışık zaman bölmelerinde meydana gelen NL FPS'den oluşur Böyle bir kümenin boyutu, küme başına toplam NFPS sayısı veya küme başına entegre NLFP genlikleri olarak ifade edildiğinde, küme boyutu dağılımları, eksi 1.5'e yakın bir üsse sahip bir güç yasası ortaya çıkarır. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal aktivitenin kendi kendine organizasyonunu incelemek için beyin dokusunu dikkatlice nasıl inceleyeceğinizi ve çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürleri nasıl büyüteceğinizi iyi anlamalısınız.

Bu yöntemler aynı zamanda kortikal ağlarda spontan aktivite ile uyaran aktivite arasındaki ilişkiyi incelemek için de kullanılmıştır.