Izoelektrik fokuslama nedir?

Izoelektrik fokuslama, farklı molekülleri izoelektrik noktalarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir.

pH, IEF'deki ayrımı nasıl etkiler?

pH, moleküllerin yükünü etkiler; moleküller, yüklerinin nötr olduğu pI'larına eşit bir pH'a ulaşana kadar göç eder.

IEF'de amfolitrelerin rolü nedir?

Amfolitreler, elektroforez sırasında bileşenlerin ayrılmasını kolaylaştıran istikrarlı bir pH gradyanı oluşturur.

IEF işlemi tipik olarak ne kadar sürer?

IEF işlemi, sabit bir voltaja ulaşmak için yaklaşık üç saat sürebilir.

IEF kullanılarak hangi tür örnekler analiz edilebilir?

IEF, çeşitli kaynaklardan proteinler, peptitler ve diğer yüklü biyomolekülleri analiz etmek için kullanılabilir.

IEF, diğer tekniklerle birleştirilebilir mi?

Evet, IEF, ayrılmış bileşenlerin daha fazla analizi için SDS-PAGE gibi tekniklerle birleştirilebilir.

Sıvı Faz İzoelektrik Odaklama: Biyoaktif Molekülleri Ham Gymnema sylvestre Ekstraktından Ayırmak İçin Bir Elektroforez Tekniği

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 3:11 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı fazlı bir elektroforez ünitesi olan önceden monte edilmiş bir izoelektrik odaklama, IEF hücresi ile başlayın. Bu sütun, uçlarında farklı pozitif ve negatif terminallere sahip, bölümlere ayrılmış, yatay gözenekli bir odadır.

Şimdi, bir molekül üzerindeki net yükün sıfır olduğu bir pH olan pI, değişen izoelektrik noktalara sahip farklı yüklü bileşenlerin karmaşık bir karışımını içeren bitki özünü alın.

Ekstrakt, daha sonra numune bileşenlerinin fraksiyonlanmasını kolaylaştıran değişken yüklü amfolitlerle desteklenir.

Numuneyi kolonun yükleme portlarına yükleyin. Şu anda, IEF sütunu sabit bir pH'a sahiptir. Ardından, elektroforezi başlatmak için yüksek voltaj uygulayın.

Elektrik alanı altında, çözünür amfolitler zıt yüklü elektrotlara doğru göç eder ve kolon boyunca doğrusal bir pH gradyanı oluşturur. Numune bileşenleri, sıvı faz pH gradyanı boyunca göç etmeye başlar ve pI'lerinin altındaki pH'ta konumlandırılanlar net bir pozitif yük taşır.

Bunlar, bileşenler pI'lerine ulaşana kadar negatif elektrota doğru göç eder, burada yükleri nötralize olur ve göç durur. Benzer şekilde, pI'lerinin üzerindeki pH'taki bileşenler pozitif elektrota doğru göç eder ve pI'lerine ulaştıklarında dururlar. Bu, numune bileşenlerini pI'lerine göre odaklanmış bölmelere ayırır. Daha fazla analiz için saflaştırılmış fraksiyonları hasat edin.

60 mililitre damıtılmış suya 0.6 gram Gymnema sylvestre bitki özü ekleyin. Bitki ekstraktını bir silindir tüp içinde beş dakika karıştırarak çözün.

Çözünmeyen parçacıkları çıkarmak için, çözeltiyi beş dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 150 mililitrelik bir cam behere aktarın ve hacimce% 1'lik bir çözelti, yaklaşık 0.6 mililitre oluşturmak için amfolit ekleyin.

1,5 inç, 19 gauge künt uçlu iğne ile 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak, çözeltiyi numune toplama portları aracılığıyla IEF hücresine yükleyin. Ardından, hücreyi standdan çıkarın ve kabarcıkları çıkarmak ve çıkarmak için elektrot odasına hafifçe vurun.

Üniteyi soğutma suyuna bağlayın. Sabit 15 watt'ta sağlanan güçle, fraksiyonlamaya başlayın. IEF ünitesini voltaj sabit bir değere, yaklaşık üç saate ulaşana kadar çalıştırın.

Harvest ON düğmesine bastıktan sonra, fraksiyon toplayıcı pimlerini toplama portları ile hizalayın. Gymnema sylvestre fraksiyonlarını toplamaya başlamak için pimleri sızdırmazlık bandından itin.