Birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için statik atomik kuvvet mikroskobu

Ökaryotik kromatinin temel tekrar eden birimi olan nükleozomlar, histon proteinlerinin bir çekirdeğinin etrafına sarılmış DNA dönüşlerini içerir.

Statik atomik kuvvet mikroskobu ile birleştirilmiş nükleozomları görselleştirmek için, AFM, yüzeyi pozitif yüklü hale getirmek için işlevselleştirilmiş ince bir mika şeridi ile başlayın. Şeridi küçük kareler halinde kesin. Monte edilmiş bir nükleozom süspansiyonunu pipetleyin.

Nükleozomdaki negatif yüklü DNA, elektrostatik etkileşimler yoluyla işlevselleştirilmiş mika şeridinin pozitif yüklü grubuna bağlanır. Nükleozomun aşırı kalabalıklaşmasını önlemek için tamponla yıkayın.

Mika şeridini bir numune destek diskine sabitleyin. AFM enstrüman tablasına monte edin.

Prob tutucuyu cihazın optik kafasına takın. Tutucu, tepesinde bir ucu olan önceden monte edilmiş bir AFM konsol içerir.

Doğru sapma ölçümü için lazer ışınını konsol arkasına hizalayın. Ucu nükleozom içeren yüzeyle doğrudan temas edecek şekilde konumlandırın.

Temas modlu görüntüleme sırasında, konsol ucu nükleozom yüzeyini tararken, ucun atomları ile numune arasındaki etkileşimleri takiben itici kuvvetler ortaya çıkar. Bu, konsolun bükülmesine neden olur. Lazer ışını farklı şekilde yansıtılır ve konuma duyarlı fotodetektöre yönlendirilir.

Geri besleme döngüsü, tarama sırasında dikey tarayıcı hareketi ile sabit konsol sapmasını korur. Bu geri besleme sinyali ayrıca topografik nükleozom görüntüleri oluşturmak için kullanılır. Nükleozom çekirdeği, yan DNA'yı temsil eden ince kollarla parlak lekeler olarak görünür.

Mika yüzeyini statik AFM görüntüleme için hazırlayın. Bunu yapmak için, önce deiyonize suda 50 milimolar bir APS stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin 1 mililitrelik alikotunu ihtiyaç duyulana kadar 4 santigrat derecede saklayın.

Stok çözeltisinden, 50 milimolar APS stoğunun 50 mikrolitresini 15 mililitre damıtılmış deiyonize su içinde çözerek mika modifikasyonu için çalışan bir APS çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi karıştırın ve ardından bir küveti çözeltiyle doldurun.

Ardından, yüksek kaliteli mika tabakalarından 1 x 3 santimetrelik mika şeritleri kesin. Bir küvete çapraz olarak yerleştirildiğinde parçanın oturup oturmadığını kontrol edin. Ardından, mika katmanlarını her iki tarafı da taze ayrılana ve parça 0,1 milimetre kadar ince olana kadar ayırın.

Mika parçasını hemen APS dolgulu küvete yerleştirin ve mika'yı 30 dakika inkübe edin. Mika parçasını damıtılmış deiyonize su ile doldurulmuş bir küvete aktarın ve 30 saniye bekletin. Ardından, APS-mika şeridinin her iki tarafını da tamamen kurutmak için argon kullanın.

Birkaç manyetik diske çift yüzlü yapışkan bant uygulayın ve bunları yana yerleştirin. Ardından, APS-mika substratını 1 santimetreye 1 santimetre kareler halinde kesin ve temiz bir Petri kabına koyun. Daha sonra, 7.5 pH'ta 10 milimolar HEPES ve 4-milimolar magnezyum klorür içeren 0.22 mikron filtrelenmiş bir tampon kullanarak birleştirilmiş nükleozomların üç seyreltmesini hazırlayın.

Düşük nihai konsantrasyonda nükleozom kaybını sınırlamak için, seyreltme, APS-mika üzerinde birikmeden hemen önce birer birer yapılmalıdır.

Her nükleozom örneğinden 5 ila 10 mikrolitreyi bir APS-mika parçasının ortasına bırakın ve 2 dakika inkübe etmelerine izin verin. Ardından, tampon bileşenlerini çıkarmak için numuneyi 2 ila 3 mililitre damıtılmış deiyonize su ile nazikçe durulayın ve biriken numuneyi hafif bir argon akışı altında kurutun.

Başlamak için, AFM kurulumunun uç tutucusuna bir uç monte edin. Ardından, numune yüzeyine temas etmemeye dikkat ederek ilk numuneyi AFM aşamasına monte edin. Lazeri, toplamı maksimuma gelene kadar konsol üzerine yerleştirin ve dikey ve yanal sapma değerlerini 0'a yakın bir değere ayarlayın. Ardından, rezonans frekansını bulmak için AFM probunu ayarlayın. Sürücü genliğini ayarlayın ve görüntü boyutunu 100 x 100 nanometre olarak ayarlayın. Kurulduktan sonra, yaklaşımı başlatmak için Engage düğmesine tıklayın.

Yaklaşım tamamlandığında, numunenin yüzeyi net bir şekilde görülene kadar genlik ayar noktasını kademeli olarak optimize edin. Ardından, tarama boyutunu 1 mikron x 1 mikron ve çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak artırın. Son olarak, tıklayın Ele geçirmek Görüntü almaya başlamak için düğmesine basın.