Name: Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Öğrenin fare beyninin ayrık bölgelerinden toplam RNA izolasyonu ve mikrodiseksiyon yöntemini. Bu protokol, tekrarlanabilir doku toplama ile yüksek kaliteli RNA elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve Ordu Araştırma Ofisi (ARO) tarafından W911NF-10-1-006 ödül numarası ile finanse edilmiştir.

1. Örnekleme düzeneği ve hazırlık
<ol>
	<li>Earle dengeli tuz çözeltisini (EBSS), sodyum bikarbonat (100 mL EBSS başına 0,44 g) ve glikoz (100 mL EBSS başına 0,884 g) ile tamamlayın9. EBSS'yi, vidalı kapaklı otoklavlanabilir bir şişe veya erlen içinde, 37 °C'de en az 12 saat boyunca DEPC (100 mL EBSS başına 0,1 mL) ile işleyin.</li>
	<li>5 ¾" cam Pasteur pipetlerini 1000 mL'lik bir cam behere, kılları yukarı bakacak şekilde resim fırçalarını ise 100 mL'lik bir cam mezüre yerleştirin. Pipetleri ve fırçaları sırasıyla örtecek miktarda DEPC çözeltisi (100 mL ddH2O başına 0,1 mL) ekleyin. Beheri ve mezürü alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin.</li>
	<li>DEPC ile 12 saatlik inkübasyonun ardından, DEPC ile işlenmiş tüm malzemeleri en az 15 dakika boyunca &gt;100 °C sıcaklığa ısıtın. EBSS'yi çıkarın ve 4 °C'de saklamadan önce oda sıcaklığına soğutun. Beher ve mezürdeki ddH2O'yu boşaltın; malzemeler kuruyana kadar &gt;100 °C'de inkübe etmeye devam edin. Malzemeleri çıkarın, oda sıcaklığına soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.</li>
	<li>Deney günü, tüm çalışma yüzeylerini RNaseZap ile temizleyin.</li>
	<li>EBSS'yi 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve burada tutun. EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için, bir gaz hortumunu RNase-free bir Pasteur pipetine yerleştirip pipeti EBSS'nin içine sokarak %95/%5 O2/CO2 ile infiltre edin. EBSS kabının ağzını kapatın.</li>
	<li>Beyin dokusunun seri kesitlerinin alınması için bir Stoelting doku dilimleyiciyi hazırlayın. Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini RNaseZap ile temizleyin. Pleksi cam yüzeye dikdörtgen bir parça Whatman #4 filtre kağıdı yapıştırın. Dilimleyici koluna çift kenarlı bir jilet takın. Mikrometreyle sıfırlama yapın ve jiletin filtre kağıdını kesmesine ancak pleksi cam plakayı kesmemesine izin verecek şekilde dilimleyici kolunun minimum yüksekliğini ayarlayın.</li>
	<li>Mikrodiseksiyon için gerekli olan; RNase-free 60x15 mm hücre kültürü kapları, Harris Uni-Core doku korerleri, mikroörnek alma sırasında koronal beyin kesitlerinin EBSS ile oksijenlenmesi için gaz hortumlarına takılacak 200 μL RNase-free mikropipet uçları, kavisli makaslar, kuru buz ve doku toplama tüpleri dahil tüm ek malzemeleri hazırlayın. Tüpleri kuru buz üzerine yerleştirin.</li>
</ol>
2. Beynin çıkarılması ve koronal kesit alınması
<ol>
	<li>Fareyi bir DecapiCone içine yerleştirin ve kemirgen giyotini kullanarak başsız hale getirin. Başı DecapiCone'dan çıkarın ve düz bir yüzeye yerleştirin. Bir skalpel kullanarak, burun deliğinin yaklaşık 3 mm kaudalinden başlayarak kafatasının orta hattı boyunca deriyi kesin. Kraniyumu ve göz çukurlarını açığa çıkarmak için deri kapakçıklarını yanlara doğru soyun.</li>
	<li>Kavisli makas kullanarak, her iki optik siniri keserek gözle olan bağlantılarını koparın. Oksipital ve interparietal kemikleri dikkatlice kırıp dorsal parietal ve frontal kemikleri çıkararak kranial boşluğu açın. Olfaktör bulbları açığa çıkarmak için bir kemik rongeuru ile nazal ve lakrimal kemikleri kırın. Olfaktör bulbları rostral beyinden ayırmak için kavisli makas kullanın. Tüm beyni, hindbrain kısmı sağlam kalacak şekilde çıkarın. Beyni 60 x 15 mm boyutunda, RNase-free bir Cellstar hücre kültürü kabının üst kısmına yerleştirin. Doku örnekleme çalışma yüzeyine taşıyın.</li>
	<li>Ekli doku doğrayıcının (tissue chopper) filtre kağıdını EBSS ile dikkatlice nemlendirmek için RNase-free bir pipet kullanın. Beyin dokusunu EBSS ile ıslatın.</li>
	<li>Beyni doku doğrayıcıya aktarın ve uygun yönlendirmeyi ayarlayın. Not: Beyin, ventral yüzeyi filtre kağıdına yaslanacak şekilde konumlandırılmalıdır. Orta hat (interhemisferik fissür) doğrayıcı bıçağa dik olmalı ve beynin rostral kenarı bıçağa bitişik olmalıdır.</li>
	<li>Beyni sabit tutmak için DEPC işleminden geçmiş bir ressam fırçasıyla beynin dorsal yüzeyine hafifçe baskı uygulayın. Beyni sabit tutarken, bıçak tutucu kolu dorsal doku yüzeyinin yaklaşık 4-5 cm üzerinde kaldırın ve bu konumda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çekin ve mikrometre kullanarak 750 μm ayarını yapın. Kolun düşmesine izin vererek dokuyu doğrayın ve 750 μm'lik bir koronal kesit oluşturun.</li>
	<li>Doğrayıcı bıçak sabitken, ressam fırçasıyla yuvarlama hareketi yaparak doku kesitini bıçak yüzeyinden nazikçe süpürün. Doku kesitini hemen petri kabındaki oksijenlendirilmiş EBSS içine yerleştirin. İkinci bir araştırmacı adım 3.1'e başlayabilir.</li>
	<li>Tüm rostro-kaudal düzlem boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar 2.5 ve 2.6 numaralı adımları tekrarlayın.</li>
</ol>
3. Beyin bölgesi mikrodiseksiyonu
<ol>
	<li>Doku mikrodissection işlemi sırasında numune aydınlatmasının engellenmemesini sağlamak için ışıklandırmayı ayarlayın. Mikrodissection sırasında doku için tamponlanmış, oksijenle zenginleştirilmiş bir ortamı korumak amacıyla %95/%5 oranındaki O2/CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın.</li>
	<li>İlgilenilen bölgeyi içeren koronal beyin kesitini belirleyin. Bir resim fırçası kullanarak beyin kesitini petri kabının tabanına düz bir şekilde yerleştirin. Tablo 1 veya diğer referanslara dayanarak uygun çapta bir doku korer seçin. Koronal doku kesitini resim fırçasıyla sabit tutarken, doku korerin kesici ucunu doku kesitinin yüzeyine doğru indirin.</li>
	<li>Basınç uygulayarak doku korer ucunu doku kesitinden geçirin ve petri kabının tabanına sıkıca bastırın. İlgilenilen bölgenin çevre dokudan ayrıldığından emin olmak için dairesel bir döndürme hareketi uygulayın. Doku koreri dikkatlice doku kesitinden kaldırın ve mikro-punch'ı serbest bırakarak EBSS içinde yüzmesini sağlayın.</li>
	<li>Bir resim fırçası kullanarak, doku mikro-punch'ını derhal kuru buz üzerinde tutulan -80 °C'ye dayanıklı bir saklama tüpüne yerleştirin. Doku, tüpün kenarına kolayca yapışmalıdır. Mikro numune içeren tüpü kuru buza geri koyun.</li>
	<li>İlgilenilen her bir beyin bölgesi için 3.2 - 3.4 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
</ol>
4. Doku arşivleme
<ol>
	<li>Mikrodissection işlemi tamamlandıktan sonra, her bir numune içeren TrakMates tüpünün ilgili barkodlarını kaydetmek için VisionMate tarayıcı sistemini kullanın. 96 bölmeli TrakMates tüp rafı doldurulduğunda, rafı hızlıca tarayın ve doku numunelerini RNA ekstraksiyonuna kadar hemen -80 °C bir dondurucuya yerleştirin.</li>
</ol>
5. Toplam RNA ekstraksiyonu
<ol>
	<li>RNaseZap kullanarak RNase-free bir çalışma alanı hazırlayın. MagMAX-96 Total RNA Isolation Protokolü10 içerisinde açıklandığı şekilde yeterli miktarda manyetik Bead Mix ve Lysis/Binding Solution hazırlayın.</li>
	<li>Doku örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Örnek içeren bir TrakMates tüpüne 100 μL Lysis/Binding Solution ekleyin. Pellet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0,5 ml tüp boyutunda bir havan (pestle) takın ve dokuyu homojenleştirin. Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak homojenleştirilmiş örneği yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna aktarın. Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak örneğe hemen 60 μL %100 izopropanol ekleyin ve pipetle 3-4 kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.</li>
	<li>Düşük tutulumlu, nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak örneğe 20 μL Bead Mix ekleyin. Pipetle 3-4 kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.</li>
	<li>5.3-5.4 adımlarını tüm doku örnekleri için tekrarlayın.</li>
	<li>Toplam RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için MagMAX-96 Total RNA Isolation Protokolü'nün III.A.2 ile başlayan adımlarını izleyin. NOT: Ticari olarak mevcut başka manyetik boncuk destekli toplam RNA izolasyon kitleri bulunmaktadır; ancak bunlar bu çalışmada incelenmemiştir. İlgili ürünleri kullanarak toplam RNA izolasyonuyla ilgili ayrıntılar için lütfen üreticinin kit kılavuzlarına bakın.</li>
	<li>Elde edilen toplam RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu NanoDrop 3300 spektrofotometre veya diğer düşük hacimli spektrofotometre/florometre teknolojilerini kullanarak ölçün.</li>
</ol>
6. Temsili Sonuçlar:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beyin Bölgesi/Çekirdek</td>
			<td>Doku Biopsi Punch Çapı (mm)</td>
			<td>Toplam RNA (ng/μL)</td>
			<td>260/280 Oranı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frontal Korteks</td>
			<td>2.0</td>
			<td>27.03</td>
			<td>1.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus Accumbens</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.26</td>
			<td>2.77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Striatum</td>
			<td>1.5</td>
			<td>27.94</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singulat Korteks</td>
			<td>1.5</td>
			<td>29.05</td>
			<td>2.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hipotalamus - Paraventriküler Nukleus / Suprakiyazmatik Nukleus (PVN/SCN)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>40.34</td>
			<td>2.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talamus</td>
			<td>2.0</td>
			<td>34.40</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hipotalamus - Dorsomedial Nukleus / Ventromedial Nukleus (DMH/VMH)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>44.83</td>
			<td>2.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amigdala</td>
			<td>1.0</td>
			<td>10.06</td>
			<td>1.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampus - Ca 2/3</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.31</td>
			<td>2.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hippocampus - Ca1/Dentate Gyrus</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.20</td>
			<td>2.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periakveduktal Gri Cevher</td>
			<td>1.0</td>
			<td>48.21</td>
			<td>2.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsal Raphe Nukleusu</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.56</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiküler Formasyon</td>
			<td>2.0</td>
			<td>35.35</td>
			<td>2.27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Mikrodiseksiyonla ayrıştırılmış fare beyin bölgelerinin, ilgili optimal doku korer çapları, temsilci toplam RNA verimi ve saflığı ile birlikte numaralandırılması. Rostro-kaudal sırayla listelenen 13 mikrodisekte beyin bölgesi, boyut ve yönelim açısından farklılık gösterir. PVN/SCN mikropunch; anteromedial paraventriküler nukleusu, periventriküler nukleusun bölümlerini, sub-paraventriküler zonu ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Talamus mikropunch, PVN/SCN mikropunch bölgesi ile aynı koronal planda yer alan anterior talamik nukleusları içerir. DMH/VMH mikropunch, dorsomedial nukleus ile ventromedial nukleus arasında yer alan aksesuar magnosellüler nukleusları ve diğer parvosellüler nöronları içerir. Amigdala örneği, hem merkezi hem de bazolateral alt bölgeleri kapsar. RNA verimi ve 260/280 oranları, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek amacıyla ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tekil değerlerdir.

<ol><li>Pickrell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanisms+underlying+human+gene+expression+variation+with+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing.</a> Nature. 464, 768-772 (2010).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).</li>
<li>Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+big+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with big effects.</a> Transplantation. 90, 105-112 (2010).</li>
<li>Forrest, A. R., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole genome transcriptome analysis.</a> RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).</li>
<li>Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+sequencing+reveals+gene+expression+and+splicing+differences+in+brain+regions+affected+by+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).</li>
<li>Paulsen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+individual+hypothalamic+nuclei+from+single+animals+using+laser+capture+microdissection+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays.</a> J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).</li>
<li>Winrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+integration+of+glutamatergic+signals+by+little+SAAS+in+novel+suprachiasmatic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits.</a> PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22MagMAX-96+Total+RNA+Isolation+Kit+Instruction+Manual%22">MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual</a>. , Forthcoming.</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Bu protokolde dikkatli bir şekilde ele alınması ve değerlendirilmesi gereken birçok kritik adım bulunmaktadır. Her bir ilgili bölgenin çıkarılması için uygun doku delici çapının seçilmesi belirlenmelidir. Tablo 1'de sunulan doku delici çapları listelenen beyin bölgelerinin toplanması için uygun olsa da, her araştırmacı ilgili dokuların optimal şekilde toplanması için uygun boyutlu doku deliciyi belirlemelidir. İkinci olarak, bu yöntemde belirtilen koronal kesit kalınlığının (750 μm), çeşitli genetik arka planlara sahip y...

<table><tbody><tr><td>Isotemp 102 benmari cihazı</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-3Q</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar rotatörü (orbital çalkalayıcı)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314 &amp;#8211;- 1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>Pelet karıştırıcı</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 0,5 mL havan eli</td><td>VWR international</td><td>KT749521-0590</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı jiletler</td><td>Stoelting Co.</td><td>51427</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;manuel mikrometreli doku dilimleyici</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>2/0 Yuvarlak resim fırçası&amp;rsquo;s fırçası</td><td>Princeton Sanat Fırçası</td><td>4350R</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core doku biyopsi cihazı (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core doku biyopsi punch'ı (1,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15099</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core doku örnekleyici (1,5 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core doku örnekleme cihazı (2,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Giyotin</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>RG-100</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCones</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Earle&amp;rsquo;dengeli tuz çözeltisi (EBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pipetler</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>epT.I.P.S. LoRetention Çift Filtreli pipet uçları, 20 &amp;mdash; 300 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>0030 077.636</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı TrakMates vidalı kapaklı tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3741</td><td></td></tr><tr><td>VisionMate kablosuz 2D barkod okuyucu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3122MTX</td><td></td></tr><tr><td>VisionMate SR tekli raf 2D barkod okuyucu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3115</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;L üniversal uyumlu pipet uçları</td><td>Corning</td><td>4864</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>Cellstar hücre kültürü kapları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96 kuyucuklu polistiren Cellstar doku kültürü plağı, U-tabanlı</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>5665-0180</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>#4 Filtre kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 150</td><td></td></tr><tr><td>Silikon ampul tipi güvenli pipet doldurucu</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-102A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

toplam rna İzolasyonu ve alt nesil sıralama ve kaynak gösterilmeden kullanılamaz ayrık fare beyin bölgeler mikrodisseksiyon sigara lazer yakalama mikroskopi yaklaşım

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Teknolojik platformlar olarak yeni nesil dizileme, mikro dizi ve qRT-PCR gibi yaklaşımlar, moleküler düzenlemenin kapsamına dair anlayışımızı genişletmek açısından büyük vaatler sunmaktadır. Yüksek çözünürlüklü RNA dizileme (RNA-Seq)1 gibi daha yeni yaklaşımlar; bağıl transkript seviyeleri, alternatif ekleme ve mikro RNA'lar2-4 gibi dokuya veya duruma özgü ekspresyona dair yeni ve geniş kapsamlı bilgiler sağlamaktadır. Belirli dokular içinde veya fenotipik olarak farklı birey grupları arasında karşılaştırmalı tüm transkriptom profilleme5 yönteminde RNA-Seq yönteminin kullanılma imkanları, hem normal hem de anormal fizyolojik durumlarda yer alan moleküler mekanizmaların aydınlatılması için yeni yollar açmaktadır. Yakın zamanda, insan beyin dokusu üzerinde tüm transkriptom profilleme gerçekleştirilerek hastalık ilerlemesiyle ilişkili gen ekspresyon farklılıkları tanımlanmıştır6. Ancak, yeni nesil dizilemenin kullanımı memeli çalışmalarıyla henüz daha yaygın bir şekilde entegre edilmemiştir.
Fare modellerindeki gen ekspresyon çalışmaları, örnek eksizyonu için lazer yakalama mikroskobisi (LCM) kullanarak çeşitli beyin çekirdekleri içinde belirgin profiller rapor etmiştir7,8. LCM, tek hücre ve ayrı beyin bölgesi hassasiyetinde örnek toplamaya olanak tanısa da, LCM yaklaşımından elde edilen nispeten düşük toplam RNA verimleri, fare beyin dokularındaki RNA-Seq ve diğer profilleme yaklaşımları için engelleyici olabilir ve suboptimal örnek amplifikasyon adımları gerektirebilir. Burada, ayrı fare beyin bölgelerinden mikrodiseksiyon ve toplam RNA ekstraksiyonu için bir protokol sunulmaktadır. Tek bir fare beyninin 750-μm'lik seri koronal kesitlerinden 13 dokuyu izole etmek için sabit çaplı doku korerleri kullanılır. Doku mikropunch örnekleri derhal dondurulur ve arşivlenir. Toplam RNA, manyetik boncuk destekli toplam RNA izolasyon teknolojisi kullanılarak örneklerden elde edilir. Ortaya çıkan RNA örnekleri, alt akış ekspresyon profillemesinde kullanım için yeterli verim ve kaliteye sahiptir. Bu mikrodiseksiyon stratejisi, ayrı beyin bölgelerinden toplam RNA elde etmek için mevcut örnek toplama stratejilerine uygulanabilir bir seçenek sunarak yeni gen ekspresyon keşifleri için olanakları artırmaktadır.

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Teknolojik platformlar olarak, yeni nesil dizileme, mikroarray ve qRT-PCR gibi yaklaşımlar, ... hakkındaki anlayışımızı genişletmek açısından büyük bir potansiyele sahiptir.

Bu prosedürün genel amacı, belirli beyin çekirdeklerinden toplam RNA'yı tekrarlanabilir, tutarlı, maliyet açısından verimli ve RNA'sız bir şekilde toplamaktır. Bu işlem, öncelikle RNA içermeyen bir çalışma ortamı hazırlanarak ve başı kesilmiş bir fareden tüm beynin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tekdüze boyutlarda seri doku kesitleri almak için mikrometre kontrollü bir doku kıyıcısı kullanılır.Ardından, dokular RNA'dan arındırılmış bir ortamda tutulurken, belirli bir çapta doku çekirdeği kullanılarak ilgilenilen beyin bölgelerinin mikrodiseksiyonu yapılır. Son olarak, eksize edilen beyin çekirdeklerinden toplam RNA izole edilir. Nihayetinde, spektrofotometrik veya florometrik analizler aracılığıyla, aşağı akıştaki cDNA kütüphanesi hazırlama ve transkriptom profilleme işlemleri için yeterli toplam RNA verimi ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, kaba anatomik veya lazer yakalama mikroskobisi destekli beyin bölgesi eksizyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek bir fare beyninden ilgilenilen birden fazla ayrı beyin bölgesinin tekrarlanabilir ve maliyet açısından yeterli bir şekilde toplanabilmesidir. Bu yöntem, nöronal devrelerle ilişkili olmayan beyin bölgelerindeki farklı transkript ekspresyon profillerinin belirli davranışsal özellikler, çevresel yanıtlar ve/veya hastalık durumu ile ilişkili olup olamayacağı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikrodiseksiyona hazırlanmak için, 100 mililitre Earl dengeli tuz çözeltisini veya EBSS'yi 0,44 gram sodyum bikarbonat ve 0,884 gram glikoz ile takviye edin.EBSS'yi, vidalı kapaklı otoklavlanabilir bir şişe veya erlen içerisinde 0,1 mililitre DEPC ile en az 12 saat boyunca işleme tabi tutun. 37 °C'de. Beş üç çeyrek inçlik cam pipetleri bir litrelik cam behere yerleştirin ve kılları yukarı bakacak şekilde resim fırçalarını 100 mililitrelik cam mezür içine yerleştirin.Pipetleri ve fırçaları örtecek miktarda DEPC işlem görmüş su çözeltisi ekleyin. Beheri ve dereceli silindiri alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin; DEPC ile yapılan 12 saatlik inkübasyonun ardından, DEPC işlem görmüş tüm malzemeleri en az 15 dakika boyunca 100 °C'den daha yüksek bir sıcaklığa ısıtın. Soğutun. EBSS'yi 4 °C'de saklamadan önce oda sıcaklığına getirin.DD H2O'yu beherin ve mezürün içinden dökün ve malzemeler kuruyana kadar 100 °C'nin üzerindeki sıcaklıkta inkübasyona devam edin. Bunları inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığına kadar soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. Deney günü, RNA kontaminasyonunu gidermek için tüm çalışma yüzeylerini temizleyin; EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için 40 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve orada tutun.Gaz hortumlarını RNA içermeyen bir pastör pipetine yerleştirerek EBSS'yi %5 CO2 ve %95 oksijen ile doyurun. Pipeti EBSS'ye yerleştirip EBSS kabının ağzını kapatın. Beyin dokusunun seri kesitleri için bir doku dilimleyiciyi hazırlayın.Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini işleme tabi tutun. RNA kontaminasyonunu gidermek için, doku doğrayıcının pleksiglas yüzeyine dikdörtgen şeklinde bir parça watman Numara dört filtre kağıdı yapıştırın. Doğrayıcı koluna çift ağızlı bir jilet takın.Mikrometreyi sıfıra ayarlayın ve jiletin filtre kağıdını kesmesine ancak pleksiglas plakaya zarar vermemesine izin verecek şekilde chopper kolunun minimum yüksekliğini düzenleyin. RNA içermeyen 60 by 15 millimeter hücre kültürü kapları, doku kozu, 200 microliter RNA içermeyen mikropipet uçları, kavisli makaslar, kuru buz ve doku toplama tüpleri dahil olmak üzere mikro diseksiyon için gerekli tüm ek malzemeleri toplayın. Bir kemirgen giyotini kullanarak bir fareyi dekapi̇te ettikten ve hem arka beyin hem de optik sinirler sağlam kalacak şekilde tüm beyni çıkardıktan sonra tüpleri kuru buz üzerine yerleştirin.Beyni, 60 x 15 milimetrelik RNase içermeyen bir hücre kültürü tabağının üst kısmına yerleştirin. Ardından tabağı doku örnekleme çalışma yüzeyine aktarın. Doku kıyıcısına takılı olan filtre kağıdını, RNase içermeyen bir pipet kullanarak EBSS ile hafifçe nemlendirin.Beyin dokusunu EBSS ile nemlendirin. Beyni doku doğrayıcıya aktarın ve ventral yüzeyi filtre kağıdına dayanacak şekilde konumlandırın. Orta hat doğrayıcı bıçağa dik olmalı ve beynin rostral kenarı bıçağa bitişik durmalıdır.Beyni sabit tutmak için, beynin dorsal yüzeyine hafifçe bastırarak A-D-E-P-C ile işlem görmüş bir ressam fırçası kullanın. Bıçak tutucu kolunu dorsal doku yüzeyinin yaklaşık dört ila beş santimetre üzerine kaldırın ve bu konumda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çekin ve 750 micrometers değerini ayarlayın.Mikrometre kullanın. Kolu serbest bırakarak dokuyu kesin ve doğrayıcı bıçak sabitken 750 µm'lik bir koronal kesit oluşturun. Ressam fırçasını yuvarlayarak doku kesitini bıçak yüzeyinden nazikçe uzaklaştırın.Doku kesitini hemen Petri kabındaki oksijenle zenginleştirilmiş EBSS içerisine yerleştirin. Bu kesit artık mikrodisseksiyon için hazırdır. Mikrodisseksiyonu gerçekleştirmek amacıyla, tüm rostrokaudal düzlem boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar dilimleme prosedürünü tekrarlayın.İlk olarak, örnek aydınlatmasının engellenmeyeceğinden emin olmak için ışıklandırmayı kontrol edin. Dokunun tamponlanmış oksijenli ortamını korumak için O2 CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın. Prosedür sırasında, ilgi bölgesini içeren koronal beyin kesitini belirleyin ve bir resim fırçası kullanarak bu kesiti Petri kabının tabanına düz bir şekilde yerleştirin.Uygun çapa sahip doku örneği alma ucunu seçin. Koronal doku kesitini ressam fırçasıyla sabit tutun ve doku örneği alma ucunun kesme kısmını doku kesitinin yüzeyine doğru indirin. Baskı uygulayarak, doku örneği alma ucunu doku kesitinin içinden geçirip Petri kutusunun tabanına sıkıca bastırın.İlgi bölgesinin çevre dokudan ayrıldığından emin olmak için yuvarlayıcı dairesel bir hareket uygulayın. Bir resim fırçası kullanarak doku örneğini doku kesitinden dikkatlice kaldırın ve mikro punch'ı EBSS içinde yüzmesini sağlayarak serbest bırakın. Doku mikro punch'ını derhal kuru buz üzerinde tutulan -80 °C'lik bir stabil saklama tüpüne yerleştirin.Dokunun tüpün kenarına kolayca yapışması gerekir. Mikro örnek içeren tüpü kuru buza geri yerleştirin. Bu mikrodissection işlemini ilgilenilen her bir beyin bölgesi için tekrarlayın.Mikrodiseksiyon tamamlandıktan sonra, her bir örnek içeren tüp için ilgili etiketi veya barkodları kaydedin. Doku örneklerinden RNA ekstraksiyonu yapmak için, RNA ekstraksiyonuna kadar doku örneklerini -80 °C dondurucuya yerleştirin. İlk olarak, RNA içermeyen bir çalışma alanı hazırlayın.Toplam RNA izolasyon kiti kılavuzunda belirtildiği şekilde yeterli miktarda manyetik boncuk karışımı ve lizis bağlama solüsyonu hazırlayın. Doku örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buz üzerine yerleştirin. Bir örnek tüpüne 100 µL lizis bağlama solüsyonu ekleyin.Pellet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0.5 mililitrelik tüp boyutunda bir havan ekleyin ve düşük tutunumlu nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak dokuyu homojenize edin. Homojenize edilmiş örneği, aynı tip uçla derhal yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu doku kültürü plağındaki bir kuyucuğa aktarın. Örneğe 60 µL %100 izopropanol ekleyin.Örneğe 20 µL boncuk karışımı ekleyin ve pipetle üç ila dört kez yukarı aşağı çekerek karıştırın. Total RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için total RNA izolasyon kiti protokolündeki adımları takip edin. Son olarak, elde edilen total RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün; çeşitli beyin bölgelerinden alınan mikro punchların total RNA verileri bu tabloda gösterilmektedir.30 µL elüsyon tamponu ile elüye edilen RNA örnekleri, RNA dizileme uygulamaları için ticari olarak mevcut cDNA hazırlama ürünleriyle kullanmak üzere yeterli miktarda toplam RNA sağlamıştır. Ek olarak, RNA verimi ve 260/280 oranları, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek amacıyla ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tekil değerlerdir ve yüksek örnek saflığını doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında 8 ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, çalışma yüzeylerinin veya doku örneklerinin RNA kontaminasyonu riskini en aza indirmek için yalnızca RNA'dan arındırılmış veya DEPC ile işlem görmüş malzemelerin kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

non-laser-capture-microscopy-approach-for-microdissection-discrete

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Öğrenin fare beyninin ayrık bölgelerinden toplam RNA izolasyonu ve mikrodiseksiyon yöntemini. Bu protokol, tekrarlanabilir doku toplama ile yüksek kaliteli RNA elde edilmesini sağlar.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım (Video) | JoVE Journal

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Daha fazla video keşfet