Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, gizli beyin çekirdeklerinden toplam RNA'yı tekrarlanabilir, tutarlı, uygun maliyetli ve RNA'sız bir şekilde toplamaktır. Bu, önce RN'siz bir çalışma ortamı hazırlayarak ve tüm beyni kafası kesilmiş bir fareden çıkararak gerçekleştirilir. Daha sonra, düzgün boyutlu seri doku kesitlerini kesmek için mikrometre ile çalışan bir doku kıyıcı kullanılır.

Daha sonra, ilgilenilen beyin bölgeleri, dokuyu RNA içermeyen bir ortam ortamında korurken, belirli çaplı bir doku çekirdeği kullanılarak mikro diseke edilir. Son olarak, toplam RNA, eksize edilen beyin çekirdeğinden izole edilir. Sonuç olarak, spektra fotometrik veya floro metrik tahliller yoluyla aşağı akış CDNA kütüphanesi hazırlama ve transkriptom profillemesi için yeterli toplam RNA verimi ve kalitesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, brüt anatomik veya lazer yakalama mikroskobu destekli beyin bölgesi eksizyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tek bir fare beyninden tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir şekilde birden fazla ayrı beyin bölgesinin toplanabilmesidir. Bu yöntem, nöronal devrelerle ilişkili beyin bölgelerindeki farklı transkript ekspresyon profillerinin belirli davranışsal özellikler, çevresel tepkiler ve/veya hastalık durumu ile ilişkili olup olmadığı gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikrodiseksiyona hazırlanmak için, 100 mililitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini veya EBSS'yi 0.44 gram sodyum bikarbonat ve 0.884 gram glikoz ile destekleyin.

EBSS'yi otoklavlanabilir bir şişede veya şişede 0,1 mililitre DEPC ile en az 12 saat boyunca vidalı bir şişede tedavi edin. 37 santigrat derecede. Beş ve üç çeyrek inçlik cam pipetleri bir litrelik cam behere yerleştirin ve sanatçıların fırçalarını kılları yukarı bakacak şekilde 100 mililitrelik cam dereceli bir silindire yerleştirin.

Pipetleri ve fırçaları kaplamak için yeterli DEPC arıtılmış su solüsyonu ekleyin. Beher ve dereceli silindiri alüminyum folyo ile örtün ve DEPC ile 12 saatlik inkübasyondan sonra 37 santigrat derecede en az 12 saat inkübe edin, ısı, tüm DEPC ile muamele edilmiş malzemeleri en az 15 dakika boyunca 100 santigrat dereceden daha yüksek bir sıcaklığa getirin. Serin. EBSS, dört santigrat derecede depolanmadan önce oda sıcaklığında.

DD H2O'yu beherden ve dereceli silindirden boşaltın ve malzemeler kuruyana kadar 100 santigrat derecenin üzerinde inkübe etmeye devam edin. Bunları inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığında soğutun ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. Deney gününde, RNA'ların kontaminasyonunu gidermek için tüm çalışma yüzeylerini işlemden geçirin, yerleştirin ve EBSS'yi tamponlamak ve oksijenlendirmek için 40 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda tutun.

EBSS, gaz tüpünü RNA içermeyen bir mera pipetine yerleştirerek %5CO2 ve %95 oksijen ile sızar. Pipeti EBSS'ye yerleştirerek EBSS kabının ağzını kapatın. Beyin dokusunun seri kesitlenmesi için bir doku dilimleyici ayarlayın.

Doku dilimleyicinin üst ve alt yüzeylerini tedavi edin. RNA'ların kontaminasyonunu gidermek için, doku kıyıcının pleksiglas yüzeyine dikdörtgen bir watman Number four, filtre kağıdı parçası yapıştırın. Doğrayıcı koluna iki ucu keskin bir tıraş bıçağı takın.

Mikrometreyi sıfıra ayarlayın ve tıraş bıçağının filtre kağıdını kesmesine izin vermek, ancak pleksiglas plakayı kesmemesine izin vermek için doğrayıcı kolunun minimum yüksekliğini ayarlayın. RNA içermeyen 60 x 15 milimetre hücre kültürü kapları, doku cos 200 mikrolitre RNA içermeyen mikro pipet uçları, kavisli makas, kuru buz ve doku toplama tüpleri dahil olmak üzere mikro diseksiyon için gerekli tüm ek malzemeleri toplayın. Bir kemirgen giyotini kullanarak bir farenin kafasını kestikten ve hem arka beyin hem de optik sinirler sağlam olacak şekilde tüm beyni çıkardıktan sonra tüpleri kuru buzun üzerine yerleştirin.

Beyni 60 x 15 milimetre RNA içermeyen bir hücre kültürü kabının üstüne yerleştirin. Daha sonra doku örnekleme çalışma yüzeyine aktarın. EBSS ile doku kıyıcıya bağlı filtre kağıdını konservatif bir şekilde nemlendirmek için RNA içermeyen bir pipet kullanın.

Beyin dokusunu EBSS ile ıslatın. Beyni doku kıyıcıya aktarın ve ventral yüzey filtre kağıdının üzerinde duracak şekilde konumlandırın. Doğrayıcı bıçağına dik olan orta hat ve bıçağa bitişik beynin rostral kenarı.

Beyni sabit tutarken beynin sırt yüzeyine hafif bir baskı uygulayarak beyni sabit tutmak için A-D-E-P-C ile muamele edilmiş sanatçının fırçasını kullanın. Bıçak tutucu kolunu sırt dokusu yüzeyinin yaklaşık dört ila beş santimetre yukarısına kaldırın ve bu konumda tutun. Fırçayı beyin yüzeyinden çıkarın ve 750 mikrometreyi tuşlayın.

Mikrometreyi kullanarak. Doğrayıcı bıçak sabit kalırken kolun düşmesine izin verin, dokuyu doğrayın ve 750 mikrometrelik bir koronal bölüm oluşturun. Mendil bölümünü bıçak yüzeyinden nazikçe kaydırmak için sanatçının fırçasıyla yuvarlanma hareketi yapın.

Doku bölümünü hemen Petri kabındaki oksijenli EBSS'ye yerleştirin. Bu dilim artık mikro diseksiyon için hazırdır. Mikro diseksiyon yapmak için tüm rost kodal düzlemi boyunca seri beyin kesitleri elde edilene kadar dilimleme prosedürünü tekrarlayın.

İlk olarak, s'nin olduğundan emin olmak için aydınlatmayı kontrol edin.ample aydınlatması engellenmeyecektir. Doku için tamponlu oksijenli bir ortam sağlamak için O2 CO2 karışımının konumunu ve akışını ayarlayın. İşlem sırasında, ilgilenilen bölgeyi içeren koronal beyin bölümünü belirleyin ve bir sanatçının fırçasını kullanarak, Petri kabının dibine düz bir şekilde yönlendirin.

Uygun çapa sahip doku çekirdeğini seçin. Koronal doku bölümünü sanatçının fırçasıyla yerinde tutun ve doku çekirdeğinin kesici ucunu doku bölümünün yüzeyinin üzerine getirin. Basınç uygularken, doku çekirdek ucunu doku bölümünden ve Petri kabının altına sıkıca bastırın.

İlgilenilen bölgenin çevredeki dokudan ayrıldığından emin olmak için yuvarlanan dairesel bir hareket kullanın. Doku çekirdeğini doku bölümünden dikkatlice kaldırın ve mikro zımbayı serbest bırakın ve bir sanatçının fırçasını kullanarak EBSS'de yüzmesine izin verin. Doku mikro zımbasını hemen kuru buz üzerinde tutulan eksi 80 santigrat derece Stabil bir saklama tüpüne bırakın.

Doku, tüpün yan tarafına kolayca yapışmalıdır. Tüp içeren mikro numuneyi kuru buza geri koyun. İlgilenilen her beyin bölgesi için bu mikrodiseksiyonu tekrarlayın.

Mikrodiseksiyon tamamlandıktan sonra, tüp içeren her numune için ilgili etiketi veya barkodları kaydedin. Doku örneklerinden RNA'yı çıkarmak için doku örneklerini RNA ekstraksiyonuna kadar eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. İlk olarak, RNA içermeyen bir çalışma alanı hazırlayın.

Toplam RNA izolasyon kiti kılavuzunda açıklandığı gibi yeterli miktarda manyetik boncuk karışımı ve lizis bağlama çözeltisi yapın. Doku örneklerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve tüpleri doğrudan kuru buzun üzerine yerleştirin. Bir numune tüpüne 100 mikrolitre lizis bağlama çözeltisi ekleyin.

Pelet karıştırıcıya nükleaz içermeyen 0,5 mililitrelik tüp boyutunda bir havaneli takın ve düşük tutma noktalı nükleaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak dokuyu homojenize edin. Homojenize edilmiş numuneyi, hemen aynı tip ucu kullanarak yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakası üzerindeki bir kuyucuğa aktarın. Numuneye 60 mikrolitre %100 izopropanol ekleyin.

Numuneye 20 mikrolitre boncuk karışımı ekleyin ve üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Toplam RNA ekstraksiyonunu tamamlamak için toplam RNA izolasyon kiti protokol Adımlarını izleyin. Son olarak, elde edilen toplam RNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün toplam RNA Çeşitli beyin bölgelerinin mikro zımbalarından elde edilen veriler bu tabloda gösterilmektedir.

30 mikrolitre evrim Tamponu ile ima edilen RNA örnekleri, RNA dizileme uygulamaları için ticari olarak temin edilebilen CD NA hazırlama ürünleriyle kullanım için yeterli toplam RNA sağladı. Ek olarak, RNA verimi ve iki 60 ila iki 80 oranı, her bir beyin bölgesinden elde edilen okumaları göstermek için ilgili mikrodiseksiyon örneklerinden elde edilen tek değerlerdir ve yüksek örnek saflığını doğrularlar Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa sekiz ila 10 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yalnızca RNA içermeyen veya dsy ile muamele edilmiş malzemeler kullanarak çalışma yüzeylerinin veya doku örneklerinin RNA kontaminasyonu riskini en aza indirmeyi unutmamak önemlidir.