Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi
13 Ocak 2014
Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.
Bu prosedürün genel amacı, komşu hücrelerden RNA ile kontaminasyon olmadan omurilik motor nöronlarından yüksek kaliteli RNA'yı geri kazanmaktır. Bu, önce kordonun kriyo gömme ortamına geri kazanılması, bölünmesi ve gömülmesi ve eksi 160 santigrat derecede dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kordonu eksi 20 santigrat derecede kalem zarı slaytları üzerine kriyo kesiti yapmaktır.
Daha sonra, slaytlar% 70 etanol içinde yıkanır ve% 70 etanol içinde Azure B ile boyanır. Son adım, tanımlanan motor nöron hücre cisimlerinin gine tiyosiyanat lizis tamponuna lazer yakalama mikro diseksiyonudur. Sonuç olarak, toplam RNA, kombine lizatlardan hazırlanır ve mutant ve vahşi tip hayvanların nöronlarındaki genel veya spesifik RNA transkripsiyonundaki farklılıkları ortaya çıkarmak için test edilir.
Lazer yakalama mikrodiseksiyonu, motor nöron hücre gövdelerinin omurilik bölümlerinden daha çok sayıda Scalia ve diğer hücre tipleri tarafından kontaminasyon olmadan kurtarılmasına izin verir. RNA hazırlama ve hastalıklı bir hayvandan alınan nöronlar ile normal bir hayvandan alınan nöronlar arasındaki transkripsiyonu karşılaştırma şansı vermek. Bu prosedürü geliştirmenin en zor yönü, hem lazer yakalama öncesinde hem de sırasında yüksek düzeyde RNA bütünlüğü ve ekstrakte kabiliyetini korurken omurilik bölümlerindeki motor nöronları tespit etmemize izin verecek bir boyama yöntemi bulmaktı.
Azure B ve %70 etanoldeki boyama bölümlerinin, diseke hücre cisimlerinin doğrudan Gine Tiyosiyanat lizis Tamponuna toplanmasıyla birleştirildiğinde bu kriterleri karşıladığını bulduk ve bu da prosedürün en iyi sonuçlar için laboratuvarımızda bir doktora sonrası olan Van Padia olduğunu gösteriyor. Ötenazi ve trans kardiyal perfüzyondan sonra tüm ekipmanın RNA dekontamine edici solüsyon ve ardından RNA içermeyen% 70 etanol ile temizlendiğinden emin olun. Omuriliği dikkatlice izole edin. Kordonu RNA'larda 10 saniye durulayın.
Kalan kanı yıkamak için serbest su ve çok nazikçe ama hızlı bir şekilde RNA içermeyen bir cam slayta koyun. Ardından, temiz bir tıraş bıçağı kullanarak omuriliği enine dokuz ila 10 parçaya bölün. Parçaları OCT ile doldurulmuş bir kriyo kalıba yerleştirin ve temiz bir iğne kullanarak dikey olarak hizalayın.
Kalıbı, sıvı nitrojen ile önceden soğutulmuş iki metil bütan içeren sığ bir tepsiye yerleştirin. RNA bozulmasını önlemek için tepsiyi sıvı nitrojen banyosuna yerleştirin. Omurilik parçalarını hızlı dondurmak için.
OCT gömülü bloğunu bölümlere ayırmadan önce altı aya kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kesit pozisyonu için hazır olduğunda, OCT gömülü bloğu soğutulmuş bir kriyostat içine yerleştirir. Her biri dokuz ila 10 omurilik kesiti içeren 20 mikronluk dilimler üretin.
Bölümleri RNA'ların serbest kalem zarına yerleştirin. Bölümlerin yapışmasını sağlamak için başlangıçta oda sıcaklığında tutulan iki mikronluk slaytlar. Kriyostatın içindeki eksi 20 santigrat derece yüzeydeki bölümü hemen yeniden dondurun.
Slaytları temiz bir raf aralığında kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede tutun. % 70 etanol içermeyen RNA'lar ile doldurulmuş altı adet 50 mililitrelik konik tüp. Derinlik, slayt suya daldırıldığında bir slayt üzerindeki tüm bölümleri kaplamak için yeterli olmalıdır.
Sonraki olarak %1 Azure B çözümünü aynı rafa yerleştirin. Yıkama veya boyama sırasında çözelti değiştirme arasındaki süreyi en aza indirmek için, fazla çözeltiyi hızlı bir şekilde boşaltmak için rafın önünde üç veya dört laboratuvar mendili bulundurun. Hazır olduğunda, slaytları eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve kuru buzun üzerine koyun, bir slaytı eldivenli bir avuç içine yerleştirerek çözdürün.
Slayttaki nem ve yoğuşmanın çoğunu, bölümlere dokunmamaya dikkat ederek bir laboratuvar mendiliyle silerek temizleyin. Slaytı, tamamen kuruması için 30 ila 40 saniye boyunca bir Petri kabında taze silika jel kurutucu üzerine koyun. Kuruduğunda, slaytı %70 etanol içeren ilk RNA tüpüne batırın.
Slaytı 30 saniye bekletin ve ardından OCT'yi 45 saniye ila bir dakika arasında yukarı ve aşağı daldırarak yıkayın. Ardından, slaytı solüsyondan çıkarın ve fazla sıvıyı laboratuvar mendillerinin üzerine boşaltın. Slaytı %70 etanol içeren ikinci tüpe batırarak bu işlemi tekrarlayın.
Omurilik bölümlerinin etrafında OCT kalırsa, üçüncü tüpte yıkamayı tekrarlayın. Fazla sıvıyı boşalttıktan sonra, slaydı %70 RNA'larda %1 Azure B çözeltisine, serbest etanole 30 ila 45 saniye daldırın. Laboratuvar temizlemesinde fazla Azure B'yi boşaltın.
Bu noktada, slaytın tamamı mavi olacaktır. Slaytı bir sonraki% 70 etanol tüpüne batırın ve fazla boyayı çıkarmak ve spesifik motor nöron boyamasını görünür hale getirmek için üç ila dört kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı daldırın. Bölümler çok koyu lekeli görünüyorsa, %70 etanol içeren yeni bir tüpte boyama adımını tekrarlayın.
Boyama çok hafif görünüyorsa, slaydı başka bir 32. için Azure B çözümüne geri döndürün ve boyamayı tekrarlayın. Lekelenme tatmin ediciyse, sürgünün kısa bir süre kurumasını bekleyin ve bir sonraki adıma geçin. DES boyama ve kurutma işleminden sonra, gri madde açık mavi olacak ve koyu mavi lekeli motor nöronlar kolayca görülebilecektir.
Mikroskobu açtıktan hemen sonra diseksiyonu başlatın. 0,6 milimetrelik bir mikro füj tüpünün kapağını takmak için tüp tutucuyu boşaltın. Numune toplama için 30 mikrolitre gine ve tiyosiyanat lizis tamponunu kapağa koyun ve solüsyonu yayarak yüzeyi kaplayın.
Bir pipet ucuyla kapağı delik ve objektif ile hizalayın. Mikroskop yazılımı aşınmasıyla, lazer yakalamaya başlayana kadar kapağı kapalı konumda tutun. Havayla kurutulmuş slaytı, zar tarafı aşağı bakacak ve bölüm delikle aynı hizaya gelecek şekilde mikroskobun sahnesine baş aşağı yerleştirin.
Slayt yerindeyken, beş x objektif ile bir omurilik bölümüne odaklanın ve ardından diseksiyon için 20 x objektife geçin. İlk olarak, ışıklı kalemle sahte bir bölgeyi işaretleyin ve lazerin toplamadan kesmesine izin verin. Bu, zarı gevşetir ve birden fazla bölgeyi art arda işaretlemeyi ve kesmeyi mümkün kılar.
Ardından, ventral boynuz bölgesindeki motor nöronları yeniden odaklayın ve tanımlayın. Bu nöronlar, konumları, parmal morfolojileri, büyük boyutları ve Azure B ile koyu mavi boyama ile tanınabilir. Işık kalemini kullanarak, çizim aracını seçin ve motor nöronların kenarı boyunca tam bir taslak oluşturarak işaretleyin. Diğer hücrelerden kontaminasyonu önlemek için taslağı motor nörona mümkün olduğunca yakın hale getirmeye çalışın.
Yazılım kesmeye hazır olduğunda konumları hatırlayacağından, kapağı kesme konumunun altına getireceğinden ve lazerle motor nöron diseksiyonunu başlatmak için başlat düğmesine tıklayacağından, kesmeden önce birden fazla hücre işaretlenebilir. Tüm bölümlerdeki tüm motor nöronları tek bir slaytta bir mikro fuge tüpünün kapağına toplayın. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, tepsiyi boşaltarak ve tüpü yavaşça yerinden çıkararak mikro fuge tüpünü tutucudan çıkarın, motor nöronları tamamen çözün ve solüsyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek tamponlayın.
Çözeltiyi santrifüjleme ile tüpün gövdesine taşıyın, numuneyi hemen kuru buzda dondurun ve Azure B ile boyandıktan sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Anti CHATT antikorları, boyama ile doğrulanırlar ve daha küçük komşu hücrelerden kolayca ayırt edilirler. Bu örnekte, motor nöron hücre gövdeleri ışıklı kalemle ana hatları çizilmiş ve yazılım tarafından numaralandırılmıştır.
Burada hücre gövdeleri lazerle kesildi ve ana hatlar kapalı olarak toplama tüpüne bırakıldı. Komşu bölgelere verilen lazer hasarının boyutu belirgindir. LMD tarafından toplanan yaklaşık 4.000 fare motor nöron hücre gövdesinden alınan bir numunenin RNA bütünlüğünün elektroforetik analizinin tipik sonuçları burada gösterilmektedir.
Belirgin ribozomal RNA zirvelerine dikkat edin. Slayt boyamadan motor nöron diseksiyonuna kadar olan bu süreç, RNA bozulmasını en aza indirmek için tek bir slayttaki tüm bölümler için 30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Bu prosedürü denerken, hem kordonun ilk diseksiyonu hem de gömülmesinde ve ayrıca motor nöronların boyanması ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun son adımlarında mümkün olduğunca çabuk çalışmayı hatırlamak önemlidir.
Genel Bakış
Bu çalışma, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak fare omurilik motor nöronlarından yüksek kaliteli RNA'yı geri kazanma yöntemi sunmaktadır. İşlem, komşu hücrelerden minimal kirlenmeyi sağlayarak doğru RNA analizini mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Moleküler Biyoloji
- Gen Ekspresyon Analizi
Arka Plan
- Motor nöronlar, nörodejeneratif hastalıkları anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Yüksek kaliteli RNA ekstraksiyonu, doğru gen ekspresyonu çalışmaları için esastır.
- Çevredeki hücrelerden gelen kirlenme sonuçları çarpıtabilir.
- Lazer yakalama mikrodiseksiyon, spesifik hücre tiplerini izole etmek için bir çözüm sunar.
Çalışmanın Amacı
- Motor nöronlardan RNA'yı izole etmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Mutant ve vahşi tip hayvanlar arasında RNA transkripsiyonunu karşılaştırmak.
- Ekstraksiyon ve analiz sırasında RNA bütünlüğünü korumak.
Kullanılan Yöntemler
- Omurilik bölümleri kriyo gömme ortamına gömülmüş ve dondurulmuştur.
- Bölümler Azure B ile boyanmış ve etanol içinde yıkanmıştır.
- Motor nöronları izole etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon gerçekleştirilmiştir.
- Lizatlardan inceleme analizleri için toplam RNA hazırlanmıştır.
Ana Sonuçlar
- 3.000-4.000 motor nörondan başarılı bir şekilde yüksek kaliteli RNA (~40-60 ng) ekstraksiyonu yapılmıştır.
- Yöntem diğer hücre tiplerinden gelen kirlenmeyi en aza indirmiştir.
- RNA bütünlüğü işlem boyunca korunmuştur.
- RNA-seq ve qRT-PCR gibi inceleme analizleri gerçekleştirilebilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, spesifik nöron popülasyonlarından RNA'yı izole etmek için etkilidir.
- Bu, hastalıklı ve normal nöronlar arasında karşılaştırmalı çalışmalara olanak tanır.
- Bu teknik, motor nöron biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from rare cell populations like motor neurons enables precise target validation in neurodegenerative disease models. This approach reduces biological noise and improves predictive confidence when comparing mutant versus wild-type transcriptional profiles. It supports early de-risking of therapeutic hypotheses by linking genotype to cell-type-specific gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant motor neurons without confounding signals from glial or neighboring cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate <10% of spinal cord cell population for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cell-type-specific RNA expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates qualified RNA inputs for downstream assays like qRT-PCR and RNA-seq with minimal cross-cell contamination.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through Azure B staining in 70% ethanol and direct lysis in guanidine thiocyanate buffer.
- Assay Readiness: Enables scalable profiling of motor neuron transcriptomes across genetic models or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by allowing direct comparison of RNA profiles between diseased and normal motor neurons.
- Operational Value: Maintains RNA integrity from sectioning through lysis, enabling reliable detection of transcriptional differences.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target validation by isolating the cellular source of signal.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing purified molecular readouts from disease-relevant neurons.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by isolating motor neuron-specific transcriptional responses.
- Screening: Produces assay-ready RNA with quantified integrity for consistent compound screening in neuronal models.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA yield, RIN values) that enable statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validity through direct comparison of mutant and wild-type neuron transcriptomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for isolating rare neuronal populations across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized staining, laser capture, and lysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner, more interpretable transcriptional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cell-type-specific expression changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, laser capture microdissection, and RNA handling to prevent degradation.
- Dependent on cryostat, UV laser microdissection system, and RNase-free reagents for consistent performance.
- Necessitates cross-team standardization of staining timing and ethanol wash steps to ensure motor neuron visibility.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to other neuronal subtypes or disease models.
- Limited by RNA yield scaling; best suited for pooled samples from multiple sections or animals.
