Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, komşu hücrelerden gelen RNA kontaminasyonu olmadan spinal kord motor nöronlarından yüksek kaliteli RNA elde etmektir. Bu işlem; önce kordun geri kazanılması, bölünmesi, kriyoyutma ortamına gömülmesi ve negatif 160 °C'de dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kordun negatif 20 °C'de pen membran lamlar üzerine kriyoseksiyonlarının alınmasıdır.

Ardından, lamlar %70 etanol ile yıkanır ve %70 etanol içindeki Azure B ile boyanır. Son adım, tanımlanmış motor nöron hücre gövdelerinin guanidin tiyosiyanat lizis tamponuna lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile aktarılmasıdır. Son olarak, birleştirilmiş lizatlardan toplam RNA hazırlanır ve mutant ile yabani tip hayvanların nöronlarındaki genel veya spesifik RNA transkripsiyonundaki farkları ortaya çıkarmak için test edilir.

Lazer yakalama mikrodisseksiyonu, daha sayıca fazla olan glia ve diğer hücre tipleri tarafından kontamine edilmeden omurilik kesitlerinden motor nöron hücre gövdelerinin geri kazanımına olanak tanır. Bu yöntem, RNA hazırlanmasına ve hastalıklı bir hayvan ile normal bir hayvandan alınan nöronlar arasındaki transkripsiyonun karşılaştırılmasına imkan verir. Bu prosedürün geliştirilmesindeki en zor yön, hem lazer yakalamadan önce hem de yakalama sırasında yüksek düzeyde RNA bütünlüğünü ve ekstraksiyon kapasitesini korurken, omurilik kesitlerindeki motor nöronları tespit etmemize izin verecek bir boyama yöntemi bulmaktı.

Kesişlerin Azure B ve %70 etanol ile boyanmasının, diseke edilmiş hücre gövdelerinin doğrudan Guanidin Tiyosiyanat lizis tamponuna toplanmasıyla birleştirildiğinde bu kriterleri karşıladığını ve prosedürün laboratuvarımızdaki bir postdoktora olan Van Padia tarafından en iyi sonuçlar için optimize edildiğini saptadık. En iyi sonuçlar için, ötanazi ve transkardiyal perfüzyon sonrası tüm ekipmanın önce RNA dekontaminasyon solüsyonu ve ardından RNA içermeyen %70 etanol ile temizlendiğinden emin olun. Omuriliği dikkatlice izole edin. Omuriliği 10 saniye boyunca RNA'sız suda durulayın.

Kalıntı kanı yıkamak için serbest su kullanın ve örneği bir RNase-free lam üzerine çok nazikçe ancak hızlıca yerleştirin. Ardından, omuriliği temiz bir jilet yardımıyla enine dokuz ila 10 parçaya bölün. Parçaları OCT ile doldurulmuş bir kriyokalıba yerleştirin ve temiz bir iğne kullanarak bunları dikey olarak hizalayın.

Kalıbı, sıvı azotla önceden soğutulmuş iki metil bütan içeren sığ bir tepsiye yerleştirin. RNA degradasyonunu önlemek için tepsiyi sıvı azot banyosuna yerleştirin. Omurilik parçalarını hızlıca dondurmak için bu işlemi gerçekleştirin.

Kesit alma işleminden önce, OCT gömülü bloğu altı aya kadar -80 °C'de saklayın. Kesit almaya hazır olduğunuzda, OCT gömülü bloğu soğutulmuş bir kriyostatın içine yerleştirin. Her biri dokuz ila 10 spinal kord enine kesiti içeren 20 µm kalınlığında dilimler hazırlayın.

Kesitleri RNA'sız temiz bir membrana yerleştirin. Kesitlerin yapışmasını sağlamak için iki mikronluk lamlar başlangıçta oda sıcaklığında bekletilir. Ardından, kriyostat içindeki -20 °C'lik bir yüzeyde kesiti hemen yeniden dondurun.

Slaytları, temiz bir raf düzeni üzerinde kullanılana kadar -80 °C'de saklayın. RNase-free %70 etanol ile doldurulmuş altı adet 50 mL'lik konik tüp hazırlayın. Sıvı derinliği, slayt daldırıldığında üzerindeki tüm kesitleri örtecek kadar yeterli olmalıdır.

Ardından aynı rafa %1'lik Azure B çözeltisini yerleştirin. Yıkama veya boyama sırasında çözeltileri değiştirme süresini en aza indirmek için, fazla çözeltiyi hızlıca süzmek amacıyla rafın önüne üç veya dört adet laboratuvar mendili koyun. Hazır olduğunuzda, lamları -80 °C'lik derin dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerine yerleştirin; lamları, eldivenli avuç içine koyarak tek tek çözdürün.

Kesitlere dokunmamaya dikkat ederek, bir laboratuvar mendili ile silip lam üzerindeki nemin ve yoğunlaşmanın çoğunu giderin. Tamamen kuruması için lamı, bir Petri kabındaki taze silika jel kurutucu üzerine 30 ila 40 saniye boyunca yerleştirin. Kuruduğunda, lamı RNAse-free %70 etanol içeren ilk tüpe daldırın.

Lamı 30 saniye boyunca bekletin ve ardından 45 saniye ile bir dakika arasında yukarı aşağı daldırarak OCT'yi yıkayın. Daha sonra lamı solüsyondan çıkarın ve fazla sıvıyı laboratuvar mendillerine süzdürün. Bu işlemi, lamı %70 ethanol içeren ikinci tüpe daldırarak tekrarlayın.

Eğer omurilik kesitlerinin etrafında OCT kalırsa, üçüncü tüpteki yıkama işlemini tekrarlayın. Fazla sıvıyı süzdükten sonra, lamı %70'lik RNA'sız etanol içindeki %1'lik Azure B çözeltisine 30 ila 45 saniye boyunca daldırın. Fazla Azure B'yi bir laboratuvar mendili üzerinde süzün.

Bu noktada, lamın tamamı mavi renk alacaktır. Lamı %70 etanol içeren bir sonraki tüpe daldırın ve fazla boyayı uzaklaştırmak ve spesifik motor nöron boyamasını görünür kılmak için üç ila dört kez hızlıca yukarı aşağı hareket ettirin. Kesitler çok koyu boyanmış görünüyorsa, taze bir %70 etanol tüpünde boya giderme adımını tekrarlayın.

Boyama çok hafif görünürse, lamı 32 saniye daha Azure B çözeltisine geri koyun ve DES boyamasını tekrarlayın. Boyama tatmin ediciyse, lamın kısa bir süre havada kurumasını bekleyin ve bir sonraki adıma geçin. DES boyaması ve kurutmadan sonra, gri cevher açık mavi renkte olacak ve koyu mavi boyanmış motor nöronlar kolayca görülebilecektir.

Mikroskobu açtıktan hemen sonra diseksiyona başlayın. 0,6 milimetrelik bir mikro santrifüj tüpü kapağını takmak için tüp tutucuyu boşaltın. Örnek toplamak için, kapağa 30 µL guanidin ve tiyosiyanat lizis tamponu koyun ve çözeltiyi yayarak yüzeyi kaplayın.

Bir pipet ucuyla kapağı, delik ve objektif ile hizalayın. Mikroskop yazılımı kullanılarak, lazer yakalama işlemi başlayana kadar kapağı kapalı konumda tutun. Hava ile kurutulmuş lamı, membran tarafı aşağıya bakacak ve kesit deliğe hizalanacak şekilde mikroskobun tablasına ters olarak yerleştirin.

Lam yerleştirildikten sonra, 5x objektif ile bir omurilik kesitine odaklanın ve ardından diseksiyon için 20x objektife geçin. İlk olarak, ışık kalemiyle dummy bir bölge işaretleyin ve lazerin burayı toplama yapmadan kesmesine izin verin. Bu işlem membranı gevşetir ve art arda birden fazla bölgenin işaretlenip kesilmesini mümkün kılar.

Ardından, odağı yeniden ayarlayın ve ventral boynuz bölgesindeki motor nöronları tanımlayın. Bu nöronlar, konumları, morfolojileri, büyük boyutları ve Azure B ile koyu mavi boyanmaları sayesinde ayırt edilebilirler. Işık kalemini kullanarak çizim aracını seçin ve motor nöronların kenarı boyunca ilerleyerek tam bir taslak oluşturun. Diğer hücrelerden kaynaklanacak kontaminasyonu önlemek için taslağı motor nörona mümkün olduğunca yakın çizmeye çalışın.

Yazılım, kesim işlemi hazır olduğunda konumları hatırlayacağı için kesimden önce birden fazla hücre işaretlenebilir; kapağı kesim konumunun altına getirin ve lazerle motor nöron disseksiyonunu başlatmak için başlat düğmesine tıklayın. Tüm kesitlerdeki tüm motor nöronları tek bir lam üzerinden tek bir mikro füj tüpünün kapağına toplayın. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, tepsiyi boşaltarak ve tüpü nazikçe yerinden çıkararak mikro füj tüpünü tutucudan alın; çözeltiyi pipetle aşağı yukarı çekerek motor nöronları ve tamponu tamamen çözün.

Çözeltiyi santrifüj ederek tüpün gövdesine indirin, Azure B ile boyama yaptıktan sonra örneği hemen kuru buzda dondurun ve negatif 80 derece Celsius'ta saklayın. Motor nöronlar, koyu boyanmış büyük hücre gövdeleri olarak görünür. Bunlar anti CHATT antikor boyaması ile doğrulanır ve çevredeki daha küçük hücrelerden kolayca ayırt edilirler. Bu örnekte, motor nöron hücre gövdeleri ışıklı kalemle çevrelenmiş ve yazılım tarafından numaralandırılmıştır.

Burada hücre gövdeleri lazerle kesilmiş ve çevre çizgileri kapatılmış halde toplama tüpüne düşürülmüştür. Lazerin komşu bölgelerde oluşturduğu hasarın boyutu belirgindir. LMD ile toplanan yaklaşık 4.000 fare motor nöron hücre gövdesinden alınan bir örneğin RNA bütünlüğüne ilişkin elektroforetik analizinin tipik sonuçları burada gösterilmektedir.

Belirgin ribozomal RNA piklerine dikkat edin. RNA degradasyonunu minimize etmek için, tek bir lamdaki tüm kesitler için lam boyamadan motor nöron disseksiyonuna kadar olan bu işlem 30 dakika içinde tamamlanmalıdır. Bu prosedür uygulanırken, hem başlangıçtaki disseksiyon ve kord gömme aşamalarında hem de boyama ve motor nöronların lazer yakalama mikrodisseksiyonu şeklindeki son adımlarda mümkün olduğunca hızlı çalışmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.