RNA Yapısı 'peroksidatif' ve 'Oksidatif' Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, RNA moleküllerinin hidroksil radikal ayak izini kullanarak nasıl katlandığını tespit etmektir. Bu, magnezyum aracılı katlamadan önce RNA'nın doğrulayıcı bütünlüğünü sağlayan RNA'nın uç etiketlemesi, jel saflaştırılması ve ön katlanması ile elde edilir, bir sonraki adım olarak, Fenton reaktifleri, daha sonra RNA omurgasını çözücü erişilebilirliğine göre parçalayabilen hidroksil radikalleri oluşturmak üzere karıştırılır. Daha sonra, RNA bölünme ürünleri, poli akrilamid jel elektroforezi denatüre edilerek ayrılır ve oto radyografi ile görselleştirilir.

Bant integralleri, yarı otomatik ayak izi analiz yazılımı ile ölçülür. Nihai hedef, RNA'nın üçüncül yapı oluşumunu yansıtan katlanma izotermleri üretmektir. Bu, normalleştirilmiş bant integrallerinin kesirli doygunluğa ölçeklendirilmesiyle gerçekleştirilir.

İzotermler daha sonra tepe denklemine takılabilir. Hidroksi ayak izinin ana avantajı, küçük boyutlu hidroksi radikallerindeki daha yüksek aktivite nedeniyle ucuz kimyasallar kullanarak RNA'nın üçüncül yapı bilgisini elde etmenizdir, çözücü ile erişilebilir ve gömülü nükleotidler arasında ayrım yapmak için mükemmel problardır. Bu yöntem, RNA yapısal biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Örneğin, ribozomlar aktif onaylarına ulaşmak için metal iyonlarını nasıl kullanır? Hidroksi radikal ayak izi, RNA özgüllüğünün ve tanınmasının temellerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, RNA'nın üçüncül yapısı hakkında bilgi vermenin yanı sıra, RNA'daki veya DNA moleküllerindeki kesin protein bağlanma yerlerini belirlemek için de kullanılabilir.

Bu yöntemin en büyük zorlukları, ribonükleaz ile numune bozulmasını önlemek ve doğru miktarda RNA bölünmesi elde etmek için demir konsantrasyonunu optimize etmektir. Ayrıca, bant aralıklarının detay analizi oldukça zor olabilir. Bu videonun ana yararı, izleyicinin hidroksi radikal ayak izi deneyinin planlama aşamalarını ve başarılı bir şekilde yürütülmesini anlamasına yardımcı olmaktır Bu protokolün başlamasından önce, reaktiflerdeki tüm ayak izini yazılı protokolde açıklandığı gibi hazırlayın.

Bu videoya eşlik eden RNA, burada belirtildiği gibi dört ilişkili ve uç etiketli DFO'lar üretilebilir. Radyoaktif olarak etiketlenmiş RNA'yı denatüre edici jel elektroferez kullanarak saflaştırın. Saflaştırılmış RNA'yı, 0.3 molar sodyum asetat kullanarak iki müteakip jel ekstraksiyonu ile geri kazanın.

Daha sonra 0.5 mililitre sulu çözeltiyi bir mililitre etanol ile karıştırarak RNA'yı çökeltin. Karışımı kuru buz üzerinde bir dakika inkübe edin Numuneyi döndürdükten sonra supinatı atın. RNA peletini %70 etanol ile yıkayın.

Ek santrifüjlemeden sonra supinatı çıkarın ve peleti bir vakumda kurutun. Daha sonra, saflaştırılmış P 32 etiketli RNA örneklerini çözün. 330 mikrolitre tek seferlik reaksiyon tamponunda, 30 mikrolitre RNA çözeltisini yeni bir reaksiyon tüpüne pipetleyin.

RNA'yı etanol ile çökeltin ve daha sonra peleti kuruduktan sonra bir vakumda kurutun, bu pelet, kalan tamponlu RNA çözeltisini iki dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtarak doğaya dönüştürmek için yazılı prosedürde açıklandığı gibi referans merdiveni oluşturmak için kullanılabilir. Numuneleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığına getirin ve yoğuşmayı tekrar çözeltiye getirmek için hızlı bir dönüş ile takip edin. Ayak izi deneyine başlamak için, 30 kuyulu bir elektroforez jelini doldurmaya yetecek kadar numune için 27 reaksiyon tüpü kurun.

Merdivenleri ve bölünmüş kontrolü dahil ettikten sonra, nihai magnezyum demir konsantrasyonlarını, titrasyon orta noktası etrafında birkaç büyüklük sırası boyunca logaritmik bir ölçekte eşit aralıklarla yerleştirilecek şekilde belirleyin, magnezyum iyonlarının bir kez reaksiyon tamponunda hazırlanması metinde ayrı ayrı açıklanmıştır. RNA'yı ve magnezyum iyon çözeltilerini 50 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra 10 mikrolitre RNA çözeltisini, karşılık gelen miktarda magnezyum demir çözeltisinin 90 mikrolitresi ile karıştırın.

100 mikrolitrelik nihai hacme ulaşmak için, her karışımı 30 dakika 50 santigrat derece inkübe edin. Daha sonra, RNA katlanması meydana gelirken çözeltilerin bir saat boyunca 25 santigrat derecede dengelenmesine izin verin. Bu arada, hidroksil radikal ayak izini reaksiyona başlatmadan hemen önce, fantom reaksiyon karışımını yazılı protokolde açıklandığı gibi hazırlayın.

Peroksidasyon reaksiyonunu, RNA çözeltisini içeren reaksiyon tüpünün üst iç kısmına demir, EDTA, sodyum askorbat ve hidrojen peroksitten oluşan iki mikrolitrelik damlacıklar pipetleyerek hazırlayın, böylece damlacıklar birbirine değmez. Güçlü bir karıştırma ile ayak izi reaksiyonunu başlatın. 15 saniye sonra 300 mikrolitre saf soğuk etanol ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Tüpleri üç ila beş kez çevirin. Son olarak, peleti daha önce yapıldığı gibi çökeltin, yıkayın ve kurutun Oksidatif reaksiyon başına alternatif olarak, oksidatif hidroksil reaksiyonu, numunelere taze hazırlanmış Fenton reaksiyon karışımından beş mikrolitre eklenerek gerçekleştirilecektir. Oksidatif reaksiyonu 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra reaksiyonu söndürmek için 300 mikrolitre saf soğuk etanol ekleyin ve tüpleri çevirerek karıştırın. Bir kez daha çökeltin. Oksidatif veya oksidatif reaksiyon başına tamamlandıktan sonra peleti yıkayın ve kurulayın.

Kurutulmuş RNA peletlerini sekiz mikrolitre jel yükleme boyası ikide çözün. P 32 etiketli RNA'nın bir geer sayacı kullanılarak yeniden süspanse edildiğini onaylayın, standart protokollere göre denatüre edici %8 poli akrilamid dizileme jeli hazırlayın. 30 kuyulu bir tarak kullanarak, iki referans ve bölünmüş bir kontrol dahil olmak üzere numuneleri yükleyin.

RNA parçalarını iki buçuk saat boyunca 60 ila 75 watt'ta ayırın. Kurumuş jeli gece boyunca bir saklama fosfo süzgecine maruz bırakın. Filmsiz oto radyografi için fosfo ekranı bir görüntüleme sistemi ile tarayın.

Ardından jel görüntü dosyasını analiz için bilgisayara aktarın. Veri analizine başlamak için, tek bantlı montaj ve miktar tayini için Safa'yı ve açık kaynaklı yazılımı açın. RNA dizisini bir nokta TXT dosyası olarak yükleyin ve ardından jel resmini bir nokta jel dosyası olarak yükleyin.

Şeritleri tanımlayın ve bant yoğunluklarını ayarlayın. Daha sonra bir ankraj şeridi seçin ve RNA'ların T bir sindirim merdivenine atıfta bulunarak bantların nükleotidlere bir jel hizalama ataması gerçekleştirin. Bant yoğunluklarını ölçün ve potansiyel olarak değişmez kalıntıları normalleştirmek ve atamak için normalleştirme eğik çizgi renk grafiği özelliğini kullanın.

Çıktıyı bir txt dosyası olarak kaydedin. SFA, jel üzerindeki şeritleri temsil eden sütunları ve RNA fragmanına karşılık gelen bireysel bant integrallerini temsil eden satırları içeren bir elektronik tablo çıktısı verir. İlk olarak, solvent erişilebilirliğinde gözle görülür bir değişiklik gösteren koruma bölgeleri, magnezyum iyonu içermeyen numuneden türetilen koruma profilinin son nokta magnezyum iyonu konsantrasyonunun profili ile karşılaştırılmasıyla tanımlanmalıdır.

Değer ne kadar düşükse, nükleotid hidroksil radikallerinin saldırısına karşı o kadar fazla korunur ve bunun tersi de geçerlidir. Daha sonra, bir elektronik tablo formatı kullanarak bant, tek tek veya nükleotid gruplarının yoğunluklarına karşı magnezyum demir konsantrasyonu geçiş eğrileri oluşturun, bu geçişleri bu protokolün metin bölümünde açıklandığı gibi fraksiyonel doygunluk fonksiyonuna ayrı ayrı ölçeklendirin. Son adım olarak, verileri tepe denklemine uydurun.

Bu analiz, fraksiyonel doygunluğa geçişi ölçeklendirir, geçiş orta noktasını belirler ve bir geçişin sigmoidal gösterilip gösterilmediğine dair fenomenolojik bir test sağlar. İşte P dört P altı RRNA hidroksil radikal ayak izi Deneylerinden elde edilen temsili sonuçlar. İzotermler, Safa tarafından analiz edilen sıralama jellerinden türetildi ve daha sonra analiz bölümünde tarif edildiği gibi uygun hale getirildi.

Jel görüntüsü, arka plan bölünmesinin minimal olduğunu ve T tek şeritteki iyi tanımlanmış bantlar nedeniyle tek nükleotid atamasının mümkün olduğunu gösterir. RNA'nın hidroksil radikalinin neden olduğu parçalanması, arka planın çok üzerindedir. Düşük magnezyum iyonlarından yüksek magnezyum iyonlarına geçiş, RNA oluşumunu gösteren bireysel ve bant gruplarının azalan yoğunluğu ile seçici olarak ilişkilidir.

Üçüncül yapı koruması, bölünmesi eşzamanlı olarak değişen, bant yoğunlukları saffer analizi ile ölçülen ve normalleştirilen tek veya bitişik nükleotid gruplarını ifade eder. Çıktı, hidroksil radikallerine karşı koruma derecesini görselleştiren termal bir grafiktir. Renk geçişi, magnezyum demir ilavesi üzerine erişilebilirlik değişikliğini tanımlar: beyazdan kırmızıya daha erişilebilir nükleotidleri gösterirken, beyazdan maviye daha korumalı nükleotidleri gösterir.

Her gölgeleme derecesi, bir koruma eğrisi olarak çizilebilen ve tepe denklemi gibi bir bağlama modeli ile analiz edilebilen sayısal bir değere bağlıdır. Bu örnekte, 1 5 3 ile 1 5 5 arasındaki korumanın denge ayrışma sabiti, 1 6 3 ile 1 6 4 arasındaki korumanın karşılık gelen değerinin kabaca iki katıdır. Bu hidroksi radikal ayak izi deneyi, düzgün bir şekilde yapılırsa bir buçuk günde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, herhangi bir RNA kontaminasyonunu önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, nihai demir konsantrasyonu deney sistemine bağlıdır. Bu nedenle, bu prosedürü takiben ayak izini bırakmadan önce bir doz yanıt deneyi yapmanızı öneririz.

Diğer yöntemler, hidroksi radikal ayak izi gibi zamanla çözülmüş ek sorulara cevap vermek amacıyla da gerçekleştirilebilir. Örneğin, RNA molekülleri gelişiminden sonra hangi kritik zaman noktasında yanlış katlanmış veya aktif bir doğrulamaya ulaşır? Bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların nükleik asitlerin ara ve ara moleküler üçüncül etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA moleküllerinin üçüncül yapı oluşumunun nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Kaat ve fosfor ikinci aşamanın eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi tehlikeli önlemler olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken pleksiglas koruyucu kullanılması önerildiğini unutmayın.