Yüksek Sıralı Nanosheets Peptoid Polimerler ve Self-Meclis Solid-faz Submonomer Sentezi

Bu prosedürün genel amacı, katı faz peptit sentezi ve peptitlerin yüksek dereceli nano tabakalar halinde sulu kendi kendine montajı için basit ve verimli bir yöntemi tanımlamaktır. Yapısal olarak polipeptitlere benzer şekilde, peptitler, yan zincirlerin alfa karbondan ziyade nitrojene bağlandığı ikame edilmiş glisin polimerlerindedir. İşlem, diğer alt monomer yöntemi ile spesifik bir peptit dizisinin sentezlenmesiyle başlar.

Alt monomer yöntemi, her bir monomeri zincire sırayla sokan iki basit kimyasal adımdan oluşur. İlk olarak, katı bir desteğe bağlı bir amin bromo asetillenir. İkinci olarak, bromür bir birincil amin ile yer değiştirir.

Bu adımlar, istenen zincir uzunluğu elde edilene kadar tekrarlanır: Zincir uzamasından sonra, peptit katı destekten ayrılır ve elde edilen ham peptit yağı, HPLC ile saflaştırılır ve peptitlerin nano tabakalar halinde kendi kendine montajını başlatmak için karakterize edilir. Peptidin seyreltik bir sulu tampon çözeltisi bir cam şişede hazırlanır ve hafifçe karıştırılır. Son adım olarak.

Nano levhalar mikroskop altında incelenir. Sonuçlar, iki basit kimyasal adımın yinelemeli bir döngüsünün, kendiliğinden nano tabakalar halinde kendi kendine bir araya gelen diziye özgü bir polimer verebileceğini göstermektedir. Peptitler, proteinler ve geleneksel polimerler arasında özelliklere sahip yeni bir biyo-esinlenmiş polimer sınıfıdır.

Geleneksel polimerler gibi sağlam ve sentetik olarak çok yönlüdürler, ancak aynı zamanda proteinler ve DNA peptitleri gibi son derece ayarlanabilir ve diziye özgüdürler, biyoaktif ilaçların tanımlanması veya yapay proteinlerin tasarımı gibi biyotıp ve malzeme bilimindeki temel sorunları ele almak için gelişmiş bir malzeme olarak ortaya çıkmaktadır. Peptitlerin başlıca avantajları arasında hassas dizi kontrolü, inanılmaz derecede çeşitli yapı taşlarının mevcudiyeti, verimli sentez ve proteaz stabilitesi yer alır. Temel ekipman ve ticari olarak temin edilebilen reaktifleri içeren genel peptit manuel sentez yöntemi, peptitlerin çoğu Laboratuvarda kolayca sentezlenmesini sağlayacak şekilde özetlenmiştir.

Sentetik adımların görsel gösterimi kritiktir ve katı faz sentezi alanına giren bireyler için değerli bir referans görevi görür. Burada ilk kez, bir amfifilik peptit 36 mers'in saflaştırılması ve karakterizasyonunun yanı sıra, yüksek derecede düzenli nano tabakalar halinde kendi kendine montajı da tanımlanmıştır. Bu protokole, yazılı protokolde açıklandığı gibi deney cihazının kurulumu ile başlayın.

Aşağıdaki adımlar, netlik için tek kullanımlık polipropilen fritli kartuş yerine bir cam reaksiyon kabında gerçekleştirilecektir. 100 miligram R amid reçinesinde fritlenmiş bir reaksiyon kabına kurulumun ardından, iki mililitre dimetil form amid veya DMF çalkalama ekleyerek reçineyi 10 dakika köpürterek şişirin. Daha sonra şişmiş reçineyi izole etmek için çözeltiyi vakumla boşaltın.

Ardından, FM O grubunu korumak için DMF'ye bir mililitre %20 tam metil piridin ekleyin. İki dakika çalkalayın ve süzün. Bu işlemi 12 dakika boyunca tekrarlayın, ardından iki mililitre DMF ekleyerek, 15 saniye çalkalayarak ve boşaltarak reçineyi durulayın.

Bir bromo asetilasyonu ve bir yer değiştirme adımı içeren ilk alt monomer döngüsü ile peptit zincirini büyütmeye başlayın. Bromo asetilasyonu için, DMF'ye bir mililitre 0.6 molar bromo asetik asit ve 86 mikrolitre di izopropil karbo akarı ekleyin. 30 dakika çalkaladıktan sonra süzün ve iki mililitre DMF ile durulayın.

Daha sonra, inkübasyonu takiben 30 ila 120 dakika boyunca uç metil pyrogenone inkübatına bir mililitre bir ila iki molar amin ekleyerek yer değiştirmeyi gerçekleştirin, süzün ve iki mililitre DMF ile durulayın. Yine, alt monomer döngüsünü tekrarlayarak peptit zincirini büyütmeye devam edin. Son yer değiştirme yapıldıktan sonra, iki mililitre DMF ile durulayın.

Bunu bir diora metan yıkama kapağı ile takip edin ve reaksiyon kabını bölünmeye kadar saklayın. Bölünmeye başlamak için, kurutulmuş reçinenin tamamını bir başlık içinde çalışan 20 mililitrelik bir parıldama cam şişesine aktarın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın, parıldama cam şişesine ve kapağına dört mililitre tri floro asetik asit veya TFA bölünme kokteyli ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika ila iki saat arasında sıkıca karıştırın.

Alternatif olarak, çözeltiyi karıştırmak için döner bir çalkalayıcı kullanın. Reçineyi tek kullanımlık bir polipropilen fritli kartuştan önceden tartılmış yeni bir 20 mililitrelik parıldama cam şişesine süzerek TFA bölünme solüsyonunu toplayın. Daha sonra, reçineyi durulamak ve kalan peptidi toplamak için bir mililitre taze bölünme kokteyli ekleyin.

Bunu tekrarlayın, iki kez durulayın. Hafif bir nitrojen akışı üfleyerek veya bir biyot yükü kullanarak TFA'yı buharlaştırın. V 10 evaporatör kırmızısı, ham petrolü altı mililitre bire bir asetonitril ve su içinde çözer.

Daha sonra numuneyi dondurun ve liyofilize edin. İkinci liyofilizasyondan sonra bu işlem bir kez daha tekrarlanmalıdır. Ham ürün deposunun ağırlığını, küflü analitik HPLC ve/veya elektro sprey LCMS kombinasyonu ile eksi 20 santigrat derecede kuru toz olarak kaydedin.

Ham ürünün saflığı ve istenen moleküler ağırlığın mevcut olup olmadığı, metinde belirtilen prosedürler izlenerek belirlenebilir. Ham peptit karışımı daha sonra yazılı prosedüre göre ters faz hazırlama HPLC ile saflaştırılabilir. Bu bölüm, tek bir zincir dizisine özgü amfifilik 36 me peptitten levhalar oluşturma protokolünü açıklar.

Peptit ipliği sentezlendikten, saflaştırıldıktan ve liyofilize edildikten sonra, elde edilen beyaz toz, iki milimolar bir stok çözeltisi yapmak için DMSO içinde çözülür. Ardından, 20 mikromolar peptit çözeltisi hazırlamak için bir Dr.Glass dosyası edinin. İlk olarak, 445 mikrolitre mili Q su ve 50 mikrolitre 10 x yaprak oluşturma tamponu ekleyin.

Karıştırmak için şişeyi vorteksleyin. Daha sonra iki milimolar peptit stok çözeltisinden beş mikrolitre ekleyin ve hafifçe şişirin. Elde edilen çözelti tabakaları, seyreltik sulu peptit çözeltisinin hafifçe çalkalanması ile oluşturulur.

Kapaklı cam şişeyi yatay konumdan dik konuma yavaşça eğin. Yaprakların nazikçe çalkalanmasına neden olur, ayrıca yaprakları da verir. Bununla birlikte, birçok yüksek kaliteli levha için levhalar daha küçük ve daha az düz kenarlı olma eğilimindedir.

Nano tabakaların floresan boyanması için bir tüp döndürücü veya özelleştirilmiş bir külbütör kullanarak cam şişeleri bir gün boyunca yatay eksen etrafında yavaşça döndürün, bir mikromolar Nil çözeltisinin 100 mikrolitresine bir mikrolitre 100 mikromolar Nil kırmızısı ekleyin. Kırmızı, hidrofobik ortamlarda lokalize olduğunda floresan yoğunluğu artan, çevreye duyarlı bir boyadır. Daha sonra, sıcak suda% 1'lik bir aros çözeltisi hazırlayın ve plastik bir Petri kabına dökün.

Aros çözeltisinin yaklaşık bir inçin sekizde biri kalınlığında olduğundan emin olun ve çözeltinin düz bir yüzeyde rahatsız edilmeden soğumasına izin verin. Aros sertleştikten sonra, bir santimetre kareye bir santimetre kesmek için bir spatula kullanın. Daha sonra, tabakaları aynı düzlemde toplamak için kesilen kareleri bir cam slayt üzerine aktarın, bir mikrolitre tabaka çözeltisini aros parçasının üzerine yerleştirin.

İki dakika sonra, arolar tabakaları yüzeyde bırakarak tamponu emmelidir. Sayfayı 15 dakika içinde görüntüleyin. Alternatif olarak, görüntü tabakaları ve çözelti için bir cam slayt üzerine 20 milimetre çapında 0.12 milimetre conta içine 15 mikrolitre yükleyin.

Nano levhaların SEM'ini gerçekleştirmek için numuneyi birkaç gün içinde bir kapak fişi ve görüntü ile örtün. Nano tabakaların emilmesine yardımcı olmak için ilk plazma aşındırma silikon çipleri. Daha sonra plazma ile muamele edilmiş bir silikon substrat üzerine 20 mikrolitre peptit tabakası çözeltisi damlatın ve çözeltinin üç dakika sonra oturmasına izin verin, fazla çözeltiyi bir Kim silme pipetinin ucuyla 20 mikrolitre su ile yüzeye çıkarın ve tamponu ve tuzları çıkarmak için fazla çözeltiyi tekrar fitilleyin.

Alternatif olarak, peptit tabakası çözeltileri, tampon ve tuzu uzaklaştırmak için suya karşı diyalize edilir. Bu durumda, 20 mikrolitre diyaliz edilmiş tabaka çözeltisi plazma ile muamele edilmiş silikon substratlar üzerine damlatılabilir ve havada kurumaya bırakılabilir. Tabaka çözeltisi plazma ile muamele edilmiş silikon substratlar üzerinde kuruduktan sonra, tabaka, bir kilovolt ile beş kilovolt arasındaki ışın enerjilerinde bir lens içi dedektör kullanılarak SEM ile görüntülenebilir.

Yüksek derecede düzenli iki boyutlu bir nano tabakaya katlanan bir diziye özgü 36 me blok yük peptidinin sentezi, karakterizasyonu ve saflaştırılması gerçekleştirildi. 36 me blok yük peptidinin sentezini kullanan aminler, etilen diamini fenetil, amin ve t bütil beta alanine dönüştürecektir. Sentezden sonra, ham peptit% 95 sulu TFA ile reçineden ayrıldı.

TFA çözeltisi toplandıktan ve buharlaştırıldıktan sonra. Ham 36 me blok şarjlı peptit, ters faz HPLC ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış blok yük peptidinin kütlesi daha sonra küflü ile doğrulandı.

Gözlemlenen 4981.2 kütlesi, hesaplanan 4981.74 kütlesi ile yakından eşleşir. Liyofilize toz, iki milimolar bir stok çözeltisi yapmak için DMSO'da çözüldü ve dört santigrat derecede saklandı. Levhalar yukarıda belirtilen protokole göre hazırlandı ve floresan optik mikroskopi ile görüntülendi.

300 mikrona kadar değişen özellik boyutlarına sahip çeşitli şekiller gözlenir ve özellikle düz kenarlar belirgindir. Levhaları benzer şekilde belirgin düz kenarları ortaya çıkaran sayfaları görüntülemek için SEM de kullanıldı. Bu video, peptitlerin katı yüz sentezi ve peptitlerin nano tabakalar halinde sulu kendi kendine montajı için basit ve verimli bir protokolü açıklar.

Kelimenin tam anlamıyla yüzlerce yapı taşı hazır olduğundan ve bu protokolde kullanılabildiğinden, polipeptitlerle erişilebilen tasarım alanı pratik olarak sınırsızdır. Peptitler, sentetik esneklikleri, sağlamlıkları ve düzenleri nedeniyle biyotıp ve nanobilim araştırmaları için umut verici malzemelerdir. Özellikle atomik düzeyde, nano levhalar iki boyutlu ekran iskeleleri, membran mimetikleri, biyolojik sensörler, protein mimetikleri ve cihaz imalatı için potansiyel bir platform görevi görür.

Trior, asetik asit ve bromo asetik asit gibi aşındırıcı reaktiflerle çalışmak, yaralanmayı önlemek, tüm reaksiyonları çeker ocakta gerçekleştirmek ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek için son derece tehlikelidir.