1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

Süpermoleküler yapıların işlevselliğini arttıracak yapılar büyüdükçe, 1, 2-dithiolane gruplarını kendi kendine birleşen peptitlerle birleştirmenin bu yöntemi, süpermoleküler yüzeylerdeki reaktivite ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, 1, 2-ditiolan öncü molekülünün bağlanması ve korumasının kaldırılmasının, son modifiye peptitin yalnızca tek bir saflaştırma aşaması ile reçine üzerinde meydana gelmesidir. Düzeneklerin nihai süpermoleküler yapılarına olgunlaşmaları için geçen süre değiştiğinden, süpermoleküler düzenekler için karakterizasyon yöntemlerinin ve sonuçlarının görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Ditiolan öncüsünü sentezlemek için, önce bir gram 3-bromo-2-propriyonik asidi, 55 santigrat derecede 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir reaksiyon şişesinde yaklaşık dört mililitre bir molar sodyum hidroksit içinde karıştırarak çözün. Reaktifin tamamı çözelti içinde süspanse edildiğinde, reaksiyon şişesini bir septa ile kapatın ve şişeyi nitrojen atmosferi altına yerleştirin. Daha sonra, yerinde tiyoasetik asit oluşturmak için dört mililitre deiyonize suya 1.49 gram potasyum tiyoasetat ve üç mililitre iki molar sülfürik asit ekleyin.

Tiyoasetik asit çözeltisini plastik, tek kullanımlık 10 mililitrelik bir şırıngaya aspire edin ve şırıngayı 18 gauge bir iğne ile donatın, ardından karışımı reaksiyon şişesine damla damla eklemek için septayı iğne ile delin ve reaksiyona gece boyunca 55 santigrat derecede devam edin. Ertesi sabah, bir metanol ve diklorometan karışımı kullanarak silika jel 60 F254 plakaları üzerinde ince tabaka kromatografisi ile reaksiyonu izleyin ve bromokresol yeşil boyası ile reaksiyon ilerlemesini görselleştirin. Tamamlanan reaksiyon oda sıcaklığına soğuduğunda, karışımı iki molar sülfürik asit ile bir pH değerine kadar asitleştirin.

Sarı bir yağ çözeltiden ayrılmalı, daha sonra ürünü üç adet 40 mililitrelik soğuk kloroform ilavesi ile ekstrakte etmeli ve organik katmanları magnezyum sülfat üzerinde kurutmak için birleştirmeli ve kloroformu düşük basınç altında uzaklaştırmalıdır. Ürün, toplam verimi %83 olan sarı bir yağ olmalıdır ve daha fazla saflaştırma yapılmadan kullanılabilir. Ditiolan öncüsünü reçine üzerindeki peptidin N-terminaline bağlamak için, beş mililitre dimetilformamide dört eşdeğer dimetilformamid, dört eşdeğer HBTU ve 10 eşdeğer DIPEA'ya dört eşdeğer ditiolan öncüsü ekleyin.

Numuneyi N-terminal reçinesi içeren fritli şırıngaya eklemeden önce birleştirme karışımının oda sıcaklığında 10 dakika önceden aktif hale gelmesine izin verin. Birleştirme reaksiyonunu iki saat boyunca çalkalayın, ardından taze dimetilformamid içinde üç adet beş mililitrelik yıkama yapın ve birleştirme reaksiyonunu ve gece boyunca çalkalamayı tekrarlayın. İkinci birleştirmeden sonra, reçineyi üç adet beş mililitrelik dimetilformamid yıkaması ve ardından üç adet beş mililitrelik diklorometan reçine yıkaması ile yıkayın ve kurutulmuş reçineyi 10 mililitrelik bir mikrodalga reaksiyon tüpüne aktarın.

Daha sonra, tiyoasetat grubunu N-terminal dithiolane öncüsünden korumak için, tüpe iki mililitre dimetilformamid ekleyin. Reçinenin şişmesine izin verin, kaba küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve reçineyi düşük hızlı manyetik karıştırma ile yeniden süspanse edin. 15 dakika sonra, tüpe iki mililitre konsantre amonyum hidroksit ekleyin, reaksiyon kabını bir silikon septa ile kapatın ve kabı karıştırarak 75 santigrat derecede 45 dakika boyunca bir mikrodalga reaktörüne yerleştirin.

Mikrodalga reaksiyonu tamamlandığında, reçineyi temiz, tek kullanımlık, fritli bir şırıngaya aktarın ve reçineyi iki adet beş mililitrelik dimetilformamid ve iki adet beş mililitrelik metanol yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak 1 1/2 saatlik bir inkübasyon için reçine içeren şırıngaya beş mililitre bölünme kokteyli ekleyin. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC saflaştırması için bir mililitre ham peptit hazırlamak için,% 0.1 trifloroasetik asit ile takviye edilmiş 600 mikrolitre suya asetonitril içinde 400 mikrolitre konsantre peptit stoğu ekleyin ve çözeltiyi 22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün.

Peptidi saflaştırmak için, UV dedektörleri 222 nanometre ve 330 nanometreye ayarlanmış durumdayken, 20 dakikada% 15 ila 55 asetonitril'lik doğrusal bir gradyan üzerinde dakikada üç mililitre akış hızında bir C18 yarı hazırlayıcı sütun kullanın. Ardından ilgi çekici zirveleri toplayın ve birleştirin. Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi veya MALDI-TOF kütle spektrometresi ile peptit ürün onayı için, toplanan pikin 0,5 mikrolitresini 0,5 mikrolitre 2, 5-dihidroksibenzoik asit matrisi içeren matris destekli bir lazer desorpsiyon/iyonizasyon plakası üzerinde karıştırın.

Kendi kendine montaj çözeltisi hazırlamak için, liyofilize peptit tozunun bir miligramını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde %20 asetonitril ve 10 milimolar HEPES karışımı içinde çözün, ardından montaj çözeltisini girdaplayın ve numuneyi oda sıcaklığında toplanmaya bırakın. Peptit düzeneği olgunlaşmaya ulaştığında, zayıflatılmış toplam yansıma elmas kristali üzerinde ince bir film olarak sekiz ila 10 mikrolitre montaj çözeltisini kurutun ve kuru film oluştuğunda 1640 ila 1631 ters santimetre arasında büyük ve geniş bir su zirvesinin kaybolmasını izleyin. İki ters santimetre çözünürlükle ortalama 50 tarama ile 1500 ila 1800 ters santimetre arasında arka plan ve kızılötesi spektrumlar elde edin ve her örnek taramasından önce arka plan taramalarını çıkarın.

Beta levha montajı için kızılötesi imza, 1625 ile 1635 ters santimetre arasında keskin bir tepe olarak gözlemlenmelidir. Peptit numuneleri beta tabakası bakımından zengin süper moleküler yapılara olgunlaştığında, 10 mikrolitre peptit montaj solüsyonunu bir transmisyon elektron mikroskobu karbon ızgarasının yüzeyine yükleyin ve düzeneklerin bir ila iki dakika boyunca ızgaranın yüzeyine adsorbe olmasına izin verin. Fazla numuneyi çıkarmak için filtre kağıdını ızgaranın kenarına dokundurun ve iki ila üç dakikalık bir inkübasyon için ızgara yüzeyine 10 mikrolitre taze hazırlanmış %2 uranil asetat boyası ekleyin, ardından fazla lekeyi filtre kağıdı ile çıkarın ve ızgarayı transmisyon elektron mikroskobu ile ertesi gün görüntülemeden önce gece boyunca bir vakum desikatöre yerleştirin.

Ditiolan öncü molekülünün ilk tek aşamalı sentezinin yanı sıra, 1, 2-ditiolan ile modifiye edilmiş peptit sentezinin geri kalanı katı destek üzerinde gerçekleşir. 3-bromo-2-propriyonik asidin, ditiolanın öncüsü olan 3-2-propanoik aside dönüşümü, hala reçine üzerinde bulunan bir peptidin serbest N-terminal aminine bağlanmadan önce proton ve Karbon-13 nükleer manyetik rezonansı ile doğrulanır. Korumanın kaldırılmasından sonra, ham peptit ters fazlı HPLC ile saflaştırılır ve ürünün kütlesi MALDI-TOF kütle spektrometresi ile doğrulanır.

Fourier dönüşümü kızılötesi ve dairesel dikroizm spektroskopisi, saflaştırılmış 1, 2-ditiolan peptidinin, genişletilmiş beta tabakası konformasyonlarını karakterize etmek için olgun amiloid liflerine kendi kendine montajını izlemek için kullanılabilir. Lifler daha sonra transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülenebilir. Bu yöntemler, hala reçine üzerinde bulunan herhangi bir peptit dizisinin N-terminalini değiştirmek için kullanılabilirken, peptitin kendi kendine montaj koşullarının her peptit için optimize edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Kendiliğinden birleşen peptitlere 1, 2-ditiolan grupları ekleyen bu teknikler, biyomalzemeler alanındaki araştırmacıların süpermoleküler yüzey reaktivitesini keşfetmelerine izin verecektir.