Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Mühendislik ürünü doku konstrüktlarını incelemek için, genellikle numunenin tahrip edilmesiyle sonuçlanan geleneksel mekanik testler kabul edilebilir değildir. Bu yöntem, küçük yumuşak dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için non-invaziv bir teknik olarak mikroskobik manyetik rezonans elastografiyi veya mikro MRE'yi kullanır. İlk olarak, doku oluşturmak amacıyla hücreler bir biyomalzeme iskele üzerine yerleştirilir.

Doku aros jel içinde süspande edilir ve bir aktüatör ucu jel içine yerleştirilir. Ardından aktüatör hareketini karakterize etmek için hareket örneğe aktarılır ve bir lazer Doppler vibrometre kullanılarak tespit edilir.

Numune ve aktüatör, bir mıknatısa ve manyetik rezonansa aktarılır. Elastografi görüntüleri alınır. Elde edilen görüntülerin analizi, hem osteojenik hem de adipojenik konstrüktler için makaslama sertliğindeki değişimi gösterir.

Öncelikle bu teknikle ilgili bir fikir geliştirdik ve hastalık teşhisinde kullanılan manyetik rezonans görüntülemeyi gözlemleyerek bunun doku mühendisliğine uyarlanabileceğini fark ettik. Bu tekniğin mekanik testler gibi diğer mevcut tekniklere göre temel avantajı, MRI'ın non-invaziv teknolojisini dokuların temel mekanik özelliklerine uygulamasıdır. Bu tekniğin uygulamaları doku mühendisliğine kadar uzanmaktadır; çünkü mekanik özelliklerin bilinmesi, kemik ve kıkırdak mühendisliğinde hedeflenen kullanımlar için uygunluğunu sağlayacaktır.

Bu yöntemler doku mühendisliği hakkında değerli bilgiler sunsa da, örneğin karaciğer fibrozisi, travmatik beyin hasarı veya beyin kanseri gibi farklı organlardaki hastalıkların teşhisinde de kullanılabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü öğrenilmesi zor adımlar ile doku mühendisliği ve büyüklük ritim görüntülemesine dair ön bilgileri içerir. Doku konstrükt hazırlama süreci; hücre popülasyonunun genişletilmesi, hücrelerin bir biyomalzeme iskeleye ekilmesi ve kimyasal sinyal molekülleri kullanılarak farklılaştırılması olmak üzere üç ana aşamadan oluşur.

Hücre hattının kültürü ve ekspansiyonunun ardından, kemik oluşumu için insan mezenkimal kök hücrelerini veya HMC'leri, mililitre başına 1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda bir jelatin süngere ekleyin. Yaklaşık üç gün sonra, farklılaşmayı indüklemek için hücreler iskele üzerinde konfluent görünmelidir. Besiyerini uzaklaştırın ve yerine adipojenik indüksiyon besiyeri ekleyin.

Ardından hücreleri üç gün sonra 37 °C'de %5 karbondioksit ile inkübe edin. Besiyerini, mililitre başına 10 µg insan rekombinan insülin içeren genişletme besiyerinden oluşan koruma besiyeri ile değiştirin. 24 saatlik inkübasyonun ardından, koruma besiyerini indüksiyon besiyeri ile değiştirin.

Bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Osteogenezi indüklemek için, bundan sonra dört hafta boyunca her iki günde bir idame besiyerini değiştirin. Çalışma süresince her iki günde bir taze osteojenik besiyeri ile değiştirin.

Bu çalışmada süre dört hafta olup her hafta MRE uygulanmaktadır. Manyetik rezonans elastografi, mekanik özelliklerin yerel değerlerini değerlendirmek için mekanik kayma dalgalarının yayılımına dayanır. Bu nedenle, söz konusu doku içerisinde piezoelektrik bir aktüatör kullanılarak bu mekanik titreşimlerin oluşturulması ve karakterize edilmesi gerekir. Numuneyi hazırlamak için doku kültürünü, katı bir taban ve 0,5% AGROS jel tabakası içeren 10 milimetre çaplı bir test tüpüne aktarın.

Ardından, kapatmak için 0.5 acro gel ekleyip ısıtın. Acro gel'in beş dakika boyunca donmasını bekleyin.

Oda sıcaklığında, piso elektrikli eğme motorunun ucunu jel yüzeyine yerleştirin. Ardından, örneği içeren tüpü ve aktüatörü sabit bir desteğe sabitleyin. Lazer doppler barometresinin ışınını mekanik aktüatörün ucuna doğru yönlendirin.

Barometrede görüntülenen yansıtılan sinyal gücünü optimize etmek için sistemin konumlandırmasını ayarlayın. Yansımayı maksimize etmek için, gerekirse yansıtıcı bant kullanarak aktüatörü yaklaşık 250 mikronluk önemli genliklerde zararsız makaslama dalgaları oluşturacak şekilde kurun. Fonksiyon jeneratörünü, beyaz gürültü sinyali ve 20 volt tepe-tepe çalışma voltajı kullanarak istenen frekans aralığını tarayacak şekilde ayarlayın.

Bu deney için istenen frekans aralığı 20 ile 2000 hertz arasındadır. Karakterize edilen spektrumu Polytech Rsof programında görüntülemek için hız ve FFT ekranını seçin. Sinyali yakalamaya başlayın ve spektrumdaki piklere dayanarak sistemin rezonans frekansını belirleyin.

Ardından, aktüatörün sapmasını ölçmek için aktüatörü belirlenen rezonans frekansında sürekli bir sinüzoid verecek şekilde ayarlayın. 200 volt tepe değeri işletme voltajı kullanarak, aktüatör tarafından jel yüzeyine iletilen yer değiştirmeyi belirtmek için fiber soft'u Y ekseninde yer değiştirme olacak şekilde FFT görüntüleyecek şekilde ayarlayın. Aktüatör karakterize edildikten sonra, örnek ve aktüatörü içeren deney tüpünü 10 milimetrelik bir RF bobininin yuvasına yerleştirin, ardından örneği ve aktüatörü MRI tarayıcısının merkezine yerleştirin.

Konstrükt konumunun belirlenmesi için bir ön izleme (scout) görüntüsü alın. Doku konstrüktü tespit edildikten sonra, görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Tipik bir in vitro sagital taramanın tekrarlama süresi 1000 milisaniye olacaktır.

20 ila 40 milisaniye eko süresi, 0,5 ila 1 milimetre kesit kalınlığı ve 128 x 128 piksel matris boyutu ile 12 x 10 milimetrekare görüş alanı kullanılmıştır. Elastografi parametreleri için, aktüatör frekansını lazer doppler vibrometer karakterizasyonu ile belirlenen değere ayarlayın. Bu örnek için, 50 gauss/cm gradyan genliği ve sıfıra ayarlanmış bir MRE gecikmesi ile bir çift bip (bipair) gereklidir.

Fonksiyon jeneratörünü burst moduna getirin ve frekans ile döngü sayısı da dahil olmak üzere, fonksiyon jeneratörünün parametrelerini elastografi görüntüleme parametrelerindekilerle eşleşecek şekilde ayarlayın. Ayrıca, fonksiyon jeneratörünü harici tetiklemeli olacak şekilde ayarlayın. Sagital bir görüntü elde etmek için hareket hassasiyetini pozitif kesit yönünde ayarlayın ve görüntüleme sonrası taramayı başlatın.

Doku konstrüktündeki sinyal kalitesini değerlendirmek için görüntüyü kontrol edin. Görüntü çok karanlık görünüyorsa, MR parametrelerini ayarlayın ve başka bir tarama gerçekleştirin. Ardından, duyarlılığı negatif kesit yönüne değiştirin.

Dosyaları MRI tarayıcıdan MATLAB yüklü başka bir bilgisayara aktarın ve kayma dalgalarının yayılımını betimleyen bir görüntü oluşturmak için karmaşık bölme işlemini gerçekleştirecek MATLAB programını çalıştırın. Görüntüyü, kayma dalgalarının varlığı ve olası artefaktlar açısından değerlendirin; dalganın kalitesini ve genliğini daha iyi değerlendirmek için faz sarma (phase wrapping) hat çizgisi profilleri çizdirilebilir. Eğer sarma meydana gelirse, gradyan genliğini düşürün ve başka bir tarama gerçekleştirin.

Görüntüde herhangi bir ayarlama gerekmiyorsa, parametre dizisi boyutunu sıfır saniye ile karakterize edilen rezonans frekansının tam periyodu arasında eşit aralıklı sekiz değere ayarlayın. Görüntüler elde edildikten sonra, hem pozitif hem de negatif kesit yönelimlerinde bir tarama gerçekleştirin.

Kayma dalgası verilerini ve numunede yayılan dalganın karşılık gelen videosunu oluşturmak için tasarlanmış bir MATLAB programı kullanın. Bu dosya, mekanik özelliklerin tahmin edilmesi için gerekli olan dosyadır. MRE'nin son adımı, kayma dalgası görüntülerinden kayma sertliğini hesaplamaktır.

Verileri, üç boyutlu veri setini değerlendirecek olan MATLAB programına yerleştirerek başlayın; görüş alanı, gradyan, genlik ve bipolar çift sayısı dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini belirleyin ve kodu çalıştırın. Algoritma, her bir parametrenin ortalamasının ve standart sapmasının hesaplanacağı ilgi bölgelerinin seçilmesine olanak tanır. İlgi bölgesini seçmek için doku konstrüktünün konturlarını çizin.

Seçilen ilgi bölgesindeki sertliğin, depolama modülünün ve kayıp modülünün ortalaması ve standart sapması görüntülenir. Program ayrıca filtreleme sonrası dalga, yönlü filtreleme sonrası dalga ve geri kazanımın doğruluğunun tahmin edilmesine yardımcı olan çizgi profilleri dahil olmak üzere ara sonuçlar da sunar. Doğru bir tahmin için filtrelenmiş dalganın pürüzsüz olması gerekir.

İlgi bölgesindeki belirli bir parametrenin standart sapması, gerektiğinde hesaplamanın kalitesinin bir göstergesidir; mühendislik ürünü konstrüktlerin gelişimleri sırasındaki mekanik özellik değişimlerini gözlemlemek için mekanik özelliklerin doğru değerlerini elde etmek amacıyla diğer parametreleri gerektiği gibi ayarlayın. MRE testi dört haftalık bir süre boyunca uygulanmıştır. Bu konstrükt gelişim haritası, A harfi ile belirtilen adipojenik ve O harfi ile belirtilen osteojenik konstrüktleri; bunlara karşılık gelen magnitüd görüntülerini, kayma dalgası görüntülerini, ELA'ları ve ortalama kayma sertliklerini göstermektedir.

ELA'lar için renk haritası, çubuğun renk şemasıyla uyumludur. Grafik ve hata çubukları, her bir konstrüktün ilgi alanındaki standart sapmayı temsil etmektedir. Zamanla adipojenik konstrüktler daha az sert hale gelmiş olup, bu durum yağ dokusuna benzer özellikler gösterdiklerini belirtmektedir.

Benzer şekilde, osteojenik konstrüktlar dört haftalık süre boyunca daha sert hale gelmiş olup bu durum kemik benzeri diferansiyasyona işaret etmektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, aktüatörün tam olarak karakterize edilmesi önemlidir. Mineral birikiminin doğrulanması gibi soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından biyokimyasal analiz ve histoloji gibi yöntemler kullanılabilir.

İnsan hücresel materyalleri ve MRI ile çalışırken, durumun son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürler gerçekleştirilirken uygun BSL 2 ve MRI önlemleri konusunda farkındalık sağlanmalıdır.