Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen bir DNA yapısını önceden belirlenmiş bir lokusta bakteri kromozomuna entegre etmektir. Bu, dört mühendislik ürünü bakteri suşunu içeren bir çiftleşme protokolü ile elde edilir. Alıcı suş, bir spec misin direnç geni ve kromozomuna entegre ATP bölgeleri ile çevrili e coli beta glukuronidaz geninden oluşan bir iniş pedi dizisine sahiptir.

P JH bir 10 donör suşu, bir doldurucu kırmızı floresan protein geni ve bir antibiyotik direnç geni çevreleyen B bölgelerinde içeren bir plazmit taşır. PJC iki donör suşu, LAC promotörün kontrolü altında streptomyces faj C 31'den bölgeye özgü integraz içeren bir plazmit taşır. Dördüncü suş MT 616, konjugasyon için gerekli transfer genlerini sağlar: plazmitlerin hücreden hücreye transferi, alıcı suşlar boyunca trans oluşturulmasıyla sonuçlanır.

İntegraz aracılı kaset değişimi için gerekli olan iki plazmitin elde edilmesi. Donör kasetinin PJ H one 10 plazmidinden kromozom üzerindeki iniş pedi kasetinin belirteçleri ile değiştirilmesi, iniş pedi belirteçlerinin, SPR ve UIDA'nın kaybına ve sonuçta ortaya çıkan trans göçmende donör kaseti RFP ve GMR'nin korunmasına neden olur. Bu tekniğin homolog rekombinasyon gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, protokolün kolaylığı ve verimliliğidir.

Aynı zamanda çok çeşitli bakterilere de bulaşabilir. Bu videoda kullanılan alıcı suşu, trans integrinler oluşturmak için çiftleşme prosedüründen iki gün önce bir S milli latte suşudur: tek bir koloniden beş mililitre TY ortamına inoküle edin, spect misin ile S milli suşunu 30 santigrat derecede iki gün boyunca inkübe edin, çiftleşme prosedüründen bir gün önce çalkalanarak aşağıdaki e coli suşlarının her birini takviye edilmiş beş mililitre LB sıvı ortama aşılayın Tetrasiklin MT 616 ile ortama integraz ekspresyon plazmidini içeren uygun antibiyotik DH beş alfa ile, kloramfenikol ile mobilizer intermedia ve donör kaset plazmidini içeren DH beş alfa ile Gentamisin ile ortama üç e Coli suşunu inkübe edin, hücreleri çiftleşme prosedürüne hazırlamak için sürekli çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede. Dört kültürün her birinden 1.5 mililitreyi bir tüpe aktarın ve hücre peletini toplamak için 30 saniye boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin, ortamı atın ve her hücre peletini bir mililitre steril% 0.85 sodyum klorür içinde yeniden süspanse edin, süpernatanı attıktan sonra tüpleri tekrar santrifüjleyin Resus, her peleti 100 mikrolitre steril% 0.85 sodyum klorür içinde askıya alın, her biri için 10 mikrolitre yıkanmış kültürü ayrı ayrı tespit edin düz bir TY agar plakası üzerinde süzün.

Bu noktalar kontrol noktalarıdır. Daha sonra, steril bir tüpe Pjc iki içeren e coli DH beş alfa hariç her suştan 40 mikrolitre ekleyin ve bu karışımın 120 mikrolitresini düz TY agar plakası üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Bu nokta integraz negatif kontrolü yok.

Son olarak, steril bir tüp karışımına dört suşun her birinden 40 mikrolitre ekleyin ve lekeleyin. Bu karışımın 160 mikrolitresi aynı TDY agar plakasında. Bu nokta, integraz aracılı kaset değişimi çiftleşme noktasıdır.

Plakayı laminer bir akış başlığına yerleştirin ve bundan sonra lekelerin yaklaşık 20 dakika kurumasını bekleyin. Plakayı kapatın ve çiftleşme protokolü çizgisinden sonraki gün gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İki kontrol noktası ve IMCE çiftleşme noktası, streptomisin ve gentamisin ile desteklenmiş TY agar plakaları üzerine birleştirilmiştir.

S milli alıcı suşu, IMCE verimliliğinin hesaplanması için streptomisine yüksek düzeyde direnç sağlayan bir mutasyon taşır Resus, IMCE eşleşme noktasının yaklaşık dörtte birini 500 mikrolitre steril% 0.85 Sodyum klorürde askıya alır, negatif yedinci plakaya 10'a kadar on kat seri seyreltme yapar Seyreltmeler, streptomisin ile takviye edilmiş TY agar plakalarında negatif iki ila 10 ila negatif beşe eğilimlidir, trans göçmenler için seçilecek gentamisin ve xgl. Plaka seyreltmeleri, hem trans göçmenler hem de potansiyel alıcılar için seçim yapmak üzere streptomisin ve xgl ile desteklenmiş TY agar plakalarında negatif üç ila 10 ila negatif yedi arasında olma eğilimindedir. IE toplam alıcıları, plakaları üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe eder.

RFP trans'ı yeşil ışık altında ve kırmızı bir filtre aracılığıyla görüntüleyin, toplam alıcıların CFU'suna kıyasla trans göçmenlerin CFU'su olarak IMCE verimliliğinin yüzdesini hesaplayın, transların yaklaşık yarısı, streptomisin ve Gentamisin ile desteklenmiş Ty'da üç günlük kuluçka döneminden sonra onları beyaz ve duyarsız hale getiren gerçek bir değiş tokuşa uğramış olacak, aşağıdaki Kontrol suşlarında büyüme olmamalıdır, integraz kontrolü yok s milli latte UW 2 27 kontrol e coli MT 616 kontrol e coli DH beş alfa P JH bir 10 kontrol ve e coli DH beş alfa PJC içeren iki kontrol. Buna karşılık, çiftleşme noktasından gelen IMCE çizgisi, baş çizgisinde birleşen büyümeye ve ikinci çizgide birçok koloniye sahip olmalıdır. Bu sonraki iki görüntü, TY streptomisin xgl agar üzerindeki çiftleşme noktasının 10 ila negatif iki seyreltmesinin ve TY streptomisin Gentamisin xgl agar üzerinde TY streptomisin Gentamisin xgl agar üzerinde yeniden süspansiyonlarını göstermektedir.

Mavi koloniler tek rekombinantlardır. Beyaz koloniler, yeşil ışık altında ve kırmızı bir filtreden bakıldığında gerçek kaset değişimine uğramış trans integrinler iken, TY strept cin xgl agar üzerindeki çiftleşme noktası resus süspansiyonunun negatif iki seyreltme eğilimi floresandan yoksundur. Buna karşılık, Ty streptomisin Gentamisin Xgl Agar üzerindeki 10 ila eksi iki çiftleşme noktası resus süspansiyonu seyreltilmesi, iki floresan seviyesi gösterir.

Daha parlak koloniler mavi kolonilere karşılık gelir ve muhtemelen vektördeki LAC promotöründen bir okumayı teşvik etmesi nedeniyle daha yüksek RFP ekspresyonuna sahiptir. Daha az parlak koloniler, gerçek kaset değişimine uğramış ve yalnızca hemen promotörü olan ve LAC promotöründen okunmayan RFP içeren beyaz kolonilere karşılık gelir. Bu eğilimler göçmenler de misin duyarlı lekeler olmalıdır.

Trans göçmenlerin toplam alıcılara oranı olarak ifade edilen trans entegrasyonunun verimliliği %0,5 aralığında olmalıdırBu videoyu izledikten sonra, DNA yapılarını bakteri kromozomuna yerleştirmek için tasarlanmış suşlarımızı kullanarak bakteriyel konjugasyonun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.