Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen bir DNA konstrüktünü bakteriyel kromozomdaki önceden belirlenmiş bir lokusa entegre etmektir. Bu, dört mühendislik ürünü bakteri suşunu içeren bir çiftleşme protokolü ile gerçekleştirilir. Alıcı suş, kromozomuna entegre edilmiş, spekmişisin direnç geni ve ATP bölgeleriyle çevrelenmiş e coli beta glukuronidaz geni içeren bir iniş pedi (landing pad) dizisine sahiptir.

P JH one 10 donör suşu, bir dolgu kırmızı floresan protein genini çevreleyen B bölgeleri ve bir antibiyotik direnç geni içeren bir plazmid taşımaktadır. PJC two donör suşu, LAC promoter kontrolü altında streptomyces faji C 31'den gelen bölgeye özgü integraz içeren bir plazmid taşımaktadır. Dördüncü suş olan MT 616 ise, plazmidlerin hücreden hücreye aktarımı olan konjugasyon için gerekli transfer genlerini sağlayarak alıcı suşlar aracılığıyla transların oluşturulmasını sağlar.

İntegraz aracılı kaset değişimi için gerekli olan iki plazmidin temini. PJ H one 10 plazmidindeki donör kasetin, kromozom üzerindeki iniş alanı kasetinin markerları ile değişimi, sonuç olarak iniş alanı markerları olan SPR ve UIDA'nın kaybına ve ortaya çıkan trans immigrant içinde donör kaset RFP ve GMR'nin korunmasına yol açar. Bu tekniğin homolog rekombinasyon gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, protokolün kolaylığı ve verimliliğidir.

Ayrıca çok çeşitli bakterilere aktarılabilir. Bu videoda kullanılan alıcı suş bir S. milli suşudur; trans-integrinler oluşturmak için yapılacak çiftleştirme işleminden iki gün önce, tek bir koloniden 5 mL spectmycin içeren TY besiyerine ekim yapın. S. milli suşunu 30 °C'de, çalkalamalı inkübatörde iki gün boyunca inkübe edin. Çiftleştirme işleminden bir gün önce, aşağıdaki E. coli suşlarının her birini, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB sıvı besiyerine ekim yapın: integraz ekspresyon plazmidi içeren DH5α'yı tetrasiklinli besiyerine, mobilizatör MT616'yı kloramphenicol'lü besiyerine ve donör kaset plazmidi içeren DH5α'yı gentamycin'li besiyerine ekim yapın. Hücreleri çiftleştirme işlemine hazırlamak için üç E. coli suşunu 37 °C'de, sabit çalkalamayla gece boyunca inkübe edin. Dört kültürün her birinden 1,5 mL'yi bir tüpe aktarın ve hücre peletini toplamak için 17,000 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin; besiyerini boşaltın ve her bir hücre peletini 1 mL steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Süpernatantı attıktan sonra tüpleri tekrar santrifüjleyin. Her bir peleti, bir pipet kullanarak 100 µL steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Her suş için yıkanmış kültürden 10 µL'yi düz bir TY agar plağına tek tek noktasal olarak ekleyin.

Bu noktalar kontrol noktalarıdır. Ardından, Pjc two içeren e coli DH five alpha hariç olmak üzere, her suşun 40 µL'sini steril bir tüpe ekleyin ve pipetle aşağı yukarı çekerek karıştırın; bu karışımdan 120 µL'yi düz TY agar plakasına damlatın. Bu nokta, integraz içermeyen negatif kontroldür.

Son olarak, steril bir tüpe dört suşun her birinden 40 µL ekleyip karıştırın ve bu karışımdan 160 µL'yi aynı TDY agar plağına damlatın. Bu nokta, integraz aracılı kaset değişim çiftleşme noktasıdır.

Plakayı laminer akışlı kabine yerleştirin ve lekelerin yaklaşık 20 dakika boyunca kurumasına izin verin. Plağı mühürleyin ve çiftleşme protokolü çizgisinden bir gün sonra, gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. İki kontrol lekesini ve IMCE çiftleşme lekesini, streptomisin ve gentamisin takviyeli TY agar plakalarına ekleyin.

S milli alıcı suşu, IMCE verimliliğinin hesaplanması için streptomisine karşı yüksek düzeyde direnç sağlayan bir mutasyon taşır. IMCE çiftleşme noktasının yaklaşık dörtte birini 500 µL steril %0,85 Sodyum klorür içerisinde süspande edin. 10⁻⁷'ye kadar on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Trans-immigrantleri seçmek için 10⁻² ile 10⁻⁵ arasındaki dilüsyonları streptomisin, gentamisin ve xgl takviyeli TY agar plakalara ekin. Hem trans-immigrantleri hem de potansiyel alıcıları seçmek için 10⁻³ ile 10⁻⁷ arasındaki dilüsyonları streptomisin ve xgl takviyeli TY agar plakalara ekin. Toplam alıcılar için plakaları 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edin.

RFP trans'ları yeşil ışık altında ve kırmızı filtre üzerinden görüntüleyin; trans göçmenlerin CFU'sunun toplam alıcıların CFU'suna oranını hesaplayarak yüzde IMCE verimliliğini belirleyin. Streptomisin ve Gentamisin ile desteklenmiş Ty ortamında üç günlük inkübasyon sonrası, trans'ların yaklaşık yarısı gerçek değişime uğramış olacak ve bu da onları beyaz ve duyarsız hale getirecektir. Aşağıdaki kontrol suşlarında büyüme olmamalıdır: integraz kontrolü s milli latte UW 2 27 kontrolü, e coli MT 616 kontrolü, P JH one 10 kontrolü içeren e coli DH five alpha kontrolü ve PJC two kontrolü içeren e coli DH five alpha kontrolü. Buna karşılık, çiftleşme noktasından alınan IMCE çizgide, baş çizgide konfluen büyüme ve ikinci çizgide çok sayıda koloni görülmelidir. Sonraki iki görüntü, çiftleşme noktasının 10⁻² seyreltmesinin TY streptomycin xgl agar üzerinde ve TY streptomycin Gentamycin xgl agar üzerindeki resüspansiyonlarını göstermektedir.

Mavi koloniler tekil rekombinantlardır. Beyaz koloniler ise yeşil ışık altında ve kırmızı filtre aracılığıyla bakıldığında gerçek kaset değişimi geçirmiş trans integrinlerdir; TY strept cin xgl agarı üzerindeki çiftlendirme lekesi resüs vüransiyonunun negatif iki dilüsyonunda floresan görülmez. Buna karşılık, Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agarı üzerindeki çiftlendirme lekesi resüs süspansiyonunun 10⁻² dilüsyonu iki seviyeli floresan gösterir.

Daha parlak kolonlar mavi kolonlara karşılık gelir ve muhtemelen vektördeki LAC promoterından gerçekleşen read through nedeniyle daha yüksek RFP ekspresyonuna sahiptir. Daha az parlak kolonlar ise gerçek kaset değişimine uğramış ve sadece kendi yakın promoterına sahip olan, LAC promoterından read through içermeyen RFP'ye sahip beyaz kolonlara karşılık gelir. Bu eğilimdeki kolonların aynı zamanda specksmycin duyarlı olması gerekir.

Toplam alıcıların içindeki trans göçmenlerin yüzdesi olarak ifade edilen trans entegrasyon verimliliği %0,5 aralığında olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel kromozoma DNA konstrüktlarını yerleştirmek için mühendislik ürünü suşlarımızı kullanarak bakteriyel konjugasyonun nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.