Name: Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, bakteriyel kromozomlara ΦC31 integraz aracılığıyla siteye özgü DNA entegrasyonu için kaset borsası yöntemini. Bu teknik, konjugasyon kullanarak genetik mühendislik uygulamalarında hızlı ve verimli genetik modifikasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nazik integraz klon sağlamak için CM Margaret Smith Destek finansmanı: Genom Kanada / Genom Prairie NSERC Discovery ve Stratejik Proje hibeleri

1. Kültür Üretimi <ol><li> TY 10 (5 g / l tripton, 3 g / l maya ekstresi, 0.44 g / l kalsiyum klorid dihidrat), ve LB 11 (10 g / l tripton, 5 g / L maya ekstresi, 5 g /: steril sıvı ortam hazırlamak sodyum klorid, pH 7). </li><li> SmUW227: 50 mg / ml spectinomycin ile TY medya (S. meliloti LP-suşu: inşaat kodlanabilir, istek üzerine inşaat detayları zorlanma) () 5 ml içine tek bir koloni inoküle. E.: verilen antibiyotik ile ilave aşağıdaki suşlar LB sıvı ortamları 5 ml içine inoküle coli DH5α 12 10 ug / ml tetrasiklin pJC2, plazmid integraz ifadesi, içeren; E. coli 10 ug / ml Kloramfenikol ile MT616 13, harekete geçirici, ve E. coli DH5α 5 ug / ml gentamisin ile pJH110, plazmid donör kaset, içeren. </li><li> Inkübe E. 37 ve geceleme colideg; sürekli sarsıntı C. Inkübe S. çalkalama ile, iki gün süre ile 30 ° C &#39;de meliloti suşu. Bir S. elde etmek mümkündür Daha büyük bir inokulum (doymuş bir kültür alt kültürü 1:500) ile bir gece kültüre meliloti. </li></ol> 2. Kültür Hazırlama ve Karıştırma <ol><li> 30 saniye süreyle 17,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre peleti toplanması ve 1 ml steril% 0.85 NaCl içinde resuspending her bir suş için kültür 1.5 ml yıkanır; tekrarlanan bir kez. </li><li> Steril% 0.85 NaCl 100 ul yılında Pastör pipetiyle pelet. </li><li> Bireysel düz TY Agar yüzeyindeki her bir suş için yıkanmış kültür 10 ul nokta. Bu lekeler kontrol noktalar vardır. </li><li> E. hariç her bir suş 40 ul ekleme coli DH5α 12 steril bir tüp, mix ve düz TY agar Bu karışımı spot 120 ul yılında pJC2 içeren. Bu nokta hiç integraz negatif kontrolüdür. </li><li> Steril bir t, her bir suş 40 ul eklemeUbe, mix ve spot düz TY Agar yüzeyindeki bu karışımın 160 ul. Bu nokta IMCE çiftleşme yerdir. </li><li> Noktalar bir laminer akış kaputu kurumasını bekleyin. </li><li> Contası plakalar ve 30 ° C&#39;da gece boyunca inkübe. </li></ol> 3. Trans-integrants İzolasyonu <ol><li> TY agar plaklarına Streak kontrol noktaları ve IMCE nokta 200 mikrogram / ​​ml streptomisin (SmUW227 streptomisin 14 yüksek düzey direnç sağlayan bir mutasyon taşıdığı Rm1021 dayanmaktadır) ve 30 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş. </li><li> IMCE verimlilik hesaplanması için, yaklaşık tekrar süspansiyon ¼ 500 ul steril% 0.85 NaCl IMCE çiftleşme spot. 10 -7 ile 10 kat seri dilüsyonlar olun. Plaka dilüsyonları 10 -2 trans-integrants için seçmek için 200 mikrogram / ​​ml streptomisin ve 30 mg / ml gentamisin, takviye TY Agar plaklarda -5 ile 10. Plaka dilüsyonları 10 -3 through trans-integrants ve potansiyel alıcılar, yani toplam alıcı hem de seçmek için 200 mg / ml streptomisin ile desteklenmiş TY agar 10 -7. </li><li> Markerless trans-integrants izolasyonu için steril% 0.85 NaCl 500 ul yaklaşık IMCE çiftleşme nokta dörtte tekrar süspansiyon. 10 -6 10 kat seri dilüsyonlar olun. 200 ug / ml streptomisin ve 200 ug / ml X-gluc ile desteklenmiş dört TY agar plakalar üzerine 10 -6 ila 10 -4 plakası dilüsyonları. </li><li> 3 gün süreyle 30 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Yeşil ışık (525 nm) altında ve kırmızı bir filtre (&gt; 610 nm) 15 üzerinden Profil RFP trans-integrants. </li><li> Trans-integrants koloni sayısı toplam alıcı CFU kıyasla yüzde IMCE verimini hesaplayın. Trans-integrants yaklaşık yarısı duyarlı bunları beyaz ve spectinomycin yapım gerçek kaset değişim geçirmiş olacak. </li><li> Markerless trans-integrants (w bulmak içinBurada donör vektör beyaz bir koloni (genişletilmiş bir inkübasyon süresi, oda sıcaklığında 1-2 gün fazladan, X-gluc ile koloniler farklılaşma artıracaktır için ekranda) pJH110 gibi Gm r içermez, bu S. gereklidir meliloti SmUW227), antibiyotikler ve 100 mg / ml spectinomycin içeren bir TY agar olmadan TY agar plaka tarama ile koloninin spectinomycin hassasiyeti onaylayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar TY üzerinde inkübasyon üç gün streptomisin ile desteklenmiş ve gentamisin sonra kontrolü çizgiler hiçbir büyüme olmalıdır. IMCE çizgi başı çizgi ve Şekil 2&#39;de görüldüğü ikinci çizgi, birçok koloniler üzerinde birleşik büyüme olmalıdır. Toplam alıcıya trans-integrants bir yüzdesi olarak ifade trans-entegrasyon verimi,% 0.5 aralığında olmalıdır. Yaklaşık trans-integrants yarısı spectinomycin hassas ve beyaz olacakOnlar gerçek kaset döviz uğramıştır gösteren. Yeşil ışık (525 nm) altında ve kırmızı bir filtre (&gt; 610 nm) 15 bakıldığında pJH110 gelen test rfp ​​donör kaset içeren Trans-integrants ayırt RFP floresans göstermesi gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> . Şekil 1 Konjugasyon karışımı çizimde: pRK600 gelen transfer genlerinin ifadesi tarafından Destekli, tüm plazmitler hücreden hücreye rastgele aktarılır. IMCE, integraz (int) yardımcı plazmid pJC2 ve donör plazmid pJH110 için gerekli iki plazmit LP-suşu satın alma yoluyla karışımı içinde trans-integrants oluşturulması, bu aktarma sonuçlanır. Plazmid olmayan kopyalayan donör (pJH110) gelen donör kaset (LP-marker kaybına neden kromozom üzerinde LP-kaset işaretleri ile ΦC31 integraz aktivite ile değiştirilir SpR ve uidA) ve sonuçta elde edilen trans-tamamlayıcı olarak donör kaseti (RFP ve GM r) bakım. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. A:. Agar yüzeyinde kuru hücre karışımları gösteren bir non-selektif TY plaka üzerinde Çiftleşme nokta plaka B: yukarıdan streptomisin-gentamisin-X-gluc plaka üzerinde çizgili Çiftleşme noktalar, S. içine, saat yönünde IMCE hiçbir integraz kontrolü yapmamışlar meliloti, E. coli DH5α pJC2 kontrolü ihtiva eden, E. coli pJH110 kontrolü, E. içeren DH5a coli MT616 kontrolü, ve S. . meliloti UW227 kontrolü C:. TY streptomisin-X-gluc agar D çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon: TY streptomisin-gentamisin-X-gluc agar (mavi koloniler tek rekombinantlar vardır üzerinde çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon, beyaz koloniler gerçek geçirmiş. kaset değişimi) E: floresans eksikliği gösteren TY streptomisin-X-gluc agar çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon F:. iki seviye gösteren TY streptomisin-gentamisin-X-gluc agar çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon floresans (parlak kolonileri mavi koloniler karşılık gelir ve salt rağmen koloniler gerçek kaset döviz no lac promotöründen salt üzerinden sadece onun hemen promotor ile RFP içeren geçirmediyse vektör sırası gelen organizatörü nedeniyle muhtemelen daha yüksek rfp ifade var Vektör, hangi yoktur.).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
<li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li>
<li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li>
<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
<li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li>
<li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19%3A+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li>
<li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase%2Finvertase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li>
<li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+mobilizable+cosmid+vector%2C+pRK7813%2C+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li>
<li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li>
<li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+theatre%3A+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li>
<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

IMCE tekniği önceden tasarlanmış suşu LP-lokusunda tek bir attB çevrili DNA kaset verimli entegrasyon sağlar. Istenen yapı donör kaset oluşturmak için RFP yerine klonlanmış sonra, tekniğin son derece güçlü hale, müteakip DNA arıtma ve dönüşüm gerektirmez. Bu antibiyotik direnci trans-integrants ve diğer değil faktörlerin oluşturulması nedeniyle belirli olabilmesi için, uygun büyüme kontrolleri dahil olduğunu önemlidir. IMCE yaklaşık% 0.5 verimle trans-integrants üretir. Bun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Streptomisin </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrasiklin </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Bakteriyolojik notu agar </td><td&gt; Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripton </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Maya Ekstraktı </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Bioshop Kanada A.Ş. </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td> Altın Biyoteknoloji A.Ş. </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli suşu MT616 </td><td> Istek üzerine </td><td></td><td> Ayrıca laboratuar dışında kullanılan </td></tr><tr><td> E. coli suşu pJC2 </td><td> Isteği ile evde, mevcut </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli suşu pJH110 </td><td> Reques tarafından evde, mevcutt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 gerginlik </td><td> Isteği ile evde, mevcut </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

siteye özgü bakteriyel kromozom mühendislik: Φc31 integraz aracılı kaset borsası (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Bakteriyel kromozom stably Mega baz aralığında 1 yabancı DNA korumak için de kullanılabilir. Kromozom entegrasyon gibi plazmid çoğaltma, plazmid istikrar, plazmid uyumsuzluk ve plazmid kopya sayısı varyans gibi konular circumvents. Bu yöntem, Streptomyces faj (Φ) C31 2,3 den site-specific integraz kullanır. AttB ve attP (sırasıyla 34 ve 39 bp) 4: ΦC31 integraz iki spesifik DNA bölgeleri arasında doğrudan bir rekombinasyon katalizler. Bu rekombinasyon istikrarlı ve 5 geri almaz. Bir spectinomycin-direnç geninden, Aada (SPR), ve E. oluşan A &quot;tampon iniş&quot; (LP) sekansı attP siteleri çevrili coli ß-glukuronidaz geni (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi ve bir intergenik bölgede Agrobacterium tumefaciens kromozomlarını entegre edilmiştir, duyuyorumsırasıyla pC odağı ve teta odağı,. S. meliloti Bu protokolde kullanılır. Bir stuffer kırmızı floresan proteini (rfp) geni ve antibiyotik direnç geni kuşatan attB siteleri içeren Mobilizable donör vektörler aynı zamanda inşa edilmiştir. Bu örnekte gentamisin dirençli plazmid pJH110 kullanılır. RFP geni 6 SPH I ve Pst I ile istenen yapı ile ikame edilebilir Alternatif attB siteleri tarafından çevrili sentetik bir yapı gibi pK19mob 7 gibi bir mobilizable vektörüne alt-klonlandı olabilir. ΦC31 integraz geni (pHS62 8 den klonlanmış) ile ifade pRK7813 9 plazmid bir mobilizable geniş bir aralığı üzerinde ana, lac promotör tarafından tahrik edilir. Bir eşleşme tetraparental protokolü LP suşu böylece donör kaset ile LP sırayla değiştirme belirteçler içine donör kaset transfer etmek için kullanılır. Bu hücreler vardır trans-integrants. Trans-integrants% 0.5 arasında, tipik bir verim ile oluşturulanlardır. Trans-integrants tipik olarak 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-glukuronik asit (X-gluc) kullanılarak antibiyotik duyarlılığı veya mavi-beyaz tarama ile taranmıştır olanlar 500-1,000 koloniler içinde bulunurlar. Bu protokol, trans-integrants oluşturma ve izole etmek için çiftleşme ve seçme işlemleri içerir.

Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Bakteriyel kromozom, mega-baz aralığındaki yabancı DNA'nın stabil bir şekilde korunması için kullanılabilir1. Kromozoma entegrasyon, ... gibi sorunların üstesinden gelmeyi sağlar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen bir DNA konstrüktünü bakteriyel kromozomda önceden belirlenmiş bir lokusa entegre etmektir. Bu işlem, mühendislik ürünü dört bakteriyel suşu içeren bir çiftleşme protokolü ile gerçekleştirilir. Alıcı suş, kromozomuna entegre edilmiş, ATP bölgeleriyle çevrelenmiş bir speksimisin direnç geni ve e coli beta glukuronidaz geninden oluşan bir iniş pedi dizisine sahiptir.P JH one 10 donör suşu, bir stuffer kırmızı floresan protein genini çevreleyen iki B bölgesini ve bir antibiyotik direnç genini içeren bir plazmid taşır. PJC two donör suşu, LAC promotör kontrolü altındaki streptomyces faji C 31'e ait bölgeye özgü integrazı içeren bir plazmid taşır. Dördüncü suş olan MT 616, hücreden hücreye plazmid transferi olan konjugasyon için gerekli transfer genlerini sağlar ve alıcı suşlar aracılığıyla translerin oluşumuna yol açar.İntegrase aracılı kaset değişimi için gerekli olan iki plazmidin edinilmesi. PJ H one 10 plazmidindeki donör kasetin, kromozom üzerindeki iniş pedi kasetinin markörleri ile değişimi, sonuç olarak iniş pedi markörleri olan SPR ve UIDA'nın kaybına ve ortaya çıkan trans-immigrantte donör kaset RFP ve GMR'nin korunmasına yol açar. Bu tekniğin homolog rekombinasyon gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, protokolün kolaylığı ve verimliliğidir.Ayrıca çok çeşitli bakterilere aktarılabilir. Bu videoda kullanılan alıcı suş bir S. milli suşudur; trans-integrinleri oluşturmak için yapılacak çiftleşme prosedüründen iki gün önce, tek bir koloniden 5 mL spektinomisin içeren TY besiyerine ekim yapın. S. milli suşunu 30 °C'de, çalkalamalı olarak iki gün inkübe edin. Çiftleşme prosedüründen bir gün önce, aşağıdaki E. coli suşlarının her birini, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB sıvı besiyerine ekim yapın: integraz ekspresyon plazmidi içeren DH5$\alpha$ tetrasiklinli besiyerine, mobilizör MT616 kloramfenikollü besiyerine ve donör kaset plazmidi içeren DH5$\alpha$ gentamisinli besiyerine ekim yapın. Üç E. coli suşunu, hücreleri çiftleşme prosedürüne hazırlamak için 37 °C'de sabit çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Dört kültürün her birinden 1,5 mL'yi bir tüpe aktarın ve hücre peletini toplamak için 17.000 $\times$g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin; besiyerini dökün ve her bir hücre peletini 1 mL steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Süpernatantı döktükten sonra tüpleri tekrar santrifüjleyin. Her bir peleti, bir pipet kullanarak 100 $\mu$L steril %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Her bir suş için yıkanmış kültürden 10 $\mu$L'yi düz bir TY agar plağına ayrı ayrı damlatın.Bu noktalar kontrol noktalarıdır. Ardından, Pjc two içeren e coli DH five alpha hariç, her bir suşun 40 µL'sini steril bir tüpe ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek karıştırın; bu karışımdan 120 µL'yi düz TY agar plakasına damlatın. Bu nokta, integraz içermeyen negatif kontroldür.Son olarak, dört suşun her birinden 40 µL'yi steril bir tüpe ekleyip karıştırın ve bu karışımdan 160 µL'yi aynı TDY agar plakasına damlatın. Bu nokta, integraz aracılı kaset değişimi çiftleşme noktasıdır.Plakayı laminer akışlı kabine yerleştirin ve lekelerin ardından yaklaşık 20 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Plağı mühürleyin ve çiftleşme protokolü çizgisinden bir gün sonra gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. İki kontrol lekesini ve IMCE çiftleşme lekesini, streptomisin ve gentamisin eklenmiş TY agar plaklarına ekleyin.S milli alıcı suşu, IMCE verimliliğinin hesaplanması için streptomisine karşı yüksek düzeyde direnç sağlayan bir mutasyon taşımaktadır. IMCE çiftleşme noktasının yaklaşık dörtte birini 500 µL steril %0,85 Sodyum klorür içerisinde süspanse edin. 10⁻⁷'ye kadar on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın. Transmigranları seçmek için 10⁻²'den 10⁻⁵'e kadar olan dilüsyonları, streptomisin, gentamisin ve xgl takviyeli TY agar plaklarına ekin. Hem transmigranları hem de potansiyel alıcıları seçmek için 10⁻³'ten 10⁻⁷'ye kadar olan dilüsyonları, streptomisin ve xgl takviyeli TY agar plaklarına ekin. Toplam alıcıları belirleyin; plakları 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edin.RFP trans hücrelerini yeşil ışık altında ve kırmızı bir filtre aracılığıyla görüntüleyin; trans göçmenlerin CFU değerini toplam alıcıların CFU değerine oranlayarak yüzde IMCE verimliliğini hesaplayın. Streptomisin ve Gentamisin takviyeli Ty ortamında üç günlük inkübasyon sonrası, trans hücrelerin yaklaşık yarısı gerçek değişime uğrayarak beyazlaşmış ve duyarsızlaşmış olacaktır. Aşağıdaki Kontrol suşlarında büyüme olmamalıdır: integraz kontrol s milli latte UW 2 27 kontrol e coli MT 616 kontrol e coli DH beş alfa P JH bir 10 kontrol içeren ve PJC iki kontrol içeren e coli DH beş alfa. Buna karşılık, çiftleşme noktasından alınan IMCE ekiminde, baş ekimde konfülent büyüme ve ikinci ekimde çok sayıda koloni görülmelidir. Sonraki iki görüntü, çiftleşme noktasının 10 üzeri negatif iki dilüsyondan hazırlanan resüspansiyonlarını TY streptomisin xgl agarda ve TY streptomisin Gentamisin xgl agarda göstermektedir.Mavi koloniler tekil rekombinantlardır. Beyaz koloniler ise gerçek kaset değişimine uğramış trans integrinlerdir; yeşil ışık altında ve kırmızı filtre aracılığıyla bakıldığında, TY strept cin xgl agardaki çiftleme spot resus süspansiyonunun negatif iki dilüsyonu floresans göstermez. Buna karşılık, Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agardaki çiftleme spot resus süspansiyonunun 10⁻² dilüsyonu iki seviyeli floresans gösterir.Daha parlak kolonlar mavi kolonlara karşılık gelir ve muhtemelen vektördeki LAC promoterından bir okuma geçişi (read-through) olduğu için daha yüksek RFP ekspresyonuna sahiptir. Daha az parlak olan kolonlar ise gerçek kaset değişimi geçirmiş ve yalnızca kendi yakın promoterını içeren RFP'ye sahip olan ve LAC promoterından okuma geçişi gerçekleşmeyen beyaz kolonlara karşılık gelir. Bu eğilimlerdeki kolonların aynı zamanda specks mycin duyarlı olması gerekir.Toplam alıcıların trans göçmenlere yüzdesi olarak ifade edilen trans entegrasyon verimliliği %0,5 aralığında olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, DNA konstrüktlarını bakteriyel kromozoma yerleştirmek için mühendislik ürünü suşlarımızı kullanarak bakteriyel konjugasyonun nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles embriyosunda phiC31 aracılı bölgeye özgü transgen entegrasyonunu gösteriyoruz. Bu yöntem, istenen genlerin araştırma ve endüstriyel uygulamalar için bir konak sisteme sokulmasına yardımcı olur.

phiC31-İntegraz Aracılı Bölgeye Yönelik Transgen Entegrasyonu: Bir Anofel Vektörüne Bölgeye Özgü Transgen Entegrasyonu için Bir Mikroenjeksiyon Tekniği

Bu protokol, gıda maddelerinde sınıf 1 integronlarının ve bunlarla ilişkili gen kasetlerinin tespitini açıklar.

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Burada, plazmit konjugasyonunda yer alan bir geni nakavt etmek için bir protokol sunuyoruz ve ardından çiftleşme tahlilleri kullanarak yokluğunun etkisini analiz ediyoruz. Genin işlevi, delesyon veya nokta mutasyonları kullanılarak dizisinin belirli bir bölgesine daha fazla araştırılır.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Öğrenin, bakteriyel kromozomlara ΦC31 integraz aracılığıyla siteye özgü DNA entegrasyonu için kaset borsası yöntemini. Bu teknik, konjugasyon kullanarak genetik mühendislik uygulamalarında hızlı ve verimli genetik modifikasyon sağlar.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Daha fazla video keşfet