Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Bu deneysel prosedürün genel amacı, bakteriyel konjugasyon kullanarak Escherichia coli veya Shigella flexneri'de yüksek yoğunluklu bir transpozona ekleme kütüphanesi oluşturmaktır. Bu teknik, bir Tn10 transpozonunun rastgele genomik eklenmesi yoluyla yüz binlerce benzersiz bakteriyel mutantın oluşturulmasına olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, transpozonu taşıyan plazmanın aktarımının, elektroporasyon gibi daha az verimli diğer yöntemler yerine bakteriyel konjugasyon aracılığıyla gerçekleştirilmesidir.

Ayrıca, Tn10 transpozonunun kendisi, diğer transpozonlara göre genom üzerine daha az yanlılıkla eklemlenir. Steril teknik kullanarak, donör suşun bir mililitre gece boyu kültürü steril bir eppendorf tüpüne ekleyin. Tüp, örneğin donör için D şeklinde etiketlenmelidir.

Aynı işlemi alıcı suş için tekrarlayarak, alıcı suşun gece boyu büyütülmüş kültüründen bir mililitresini steril bir eppendorf tüpüne aktarın. Örneği, alıcıyı temsil eden R etiketiyle işaretleyin. Her iki tüpü oda sıcaklığında 14,000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Bu işlem bir masaüstü santrifüjle gerçekleştirilebilir. Santrifüj çalışırken, konjugasyon için filtreleri hazırlayın. Antibiyotik içermeyen, etiketlenmiş bir LB agar plağının üzerine steril pens yardımıyla bir nitroselüloz filtre yerleştirin.

Alternatif olarak, nitrosellüloz filtre yerine steril blotting kağıdı kullanılabilir. Kontaminasyonu en aza indirmek için her bir filtreyi ayrı bir LB agar plakasına yerleştirin. Her filtrenin uygun şekilde etiketlenmiş bir LB agar plakasına yerleştirildiğinden emin olun.

Her biri bir filtre içeren üç plaka hazırlayın. Biri donör suş, biri resipiyent suş ve biri de kütüphane için olacaktır. Santrifüj işlemi tamamlandığında, gece boyu inkübe edilen kültürleri çıkarın.

Antibiyotik içeren tüm büyüme ortamını eppendorf tüpünden uzaklaştırın ve atın. Bakteriyel hücre peletini bozmamaya veya yerinden oynatmamaya dikkat edin, ancak tüm büyüme ortamını uzaklaştırmaya çalışın. Aseptik çalışmaya özen gösterin ve her örnek arasında uçları değiştirin.

Her bir eppendorf tüpüne, antibiyotik içermeyen 110 µL taze LB medyumu ekleyin ve kültürü yeniden süspande etmek için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemini gerçekleştirin. Aseptik çalışmaya özen gösterin. Hücre kümelenmelerinin kalmadığından emin olmak için pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekme işlemi yapın.

Bu adım, bakteri kültürünü konsantre etmek ve gece boyu süren kültürden kalan tüm antibiyotikleri uzaklaştırmak için gerçekleştirilir. Bir pipet kullanarak, konsantre donör kültüründen 50 µL'yi Donor olarak etiketlenmiş filtre üzerine yerleştirin. 50 µL'yi filtreye yavaşça, damla damla ekleyin.

Resüspande edilmiş kültürden 50 mikrolitre konsantre resüspande kültürü, damla damla alıcı filtre üzerine ekleyerek aynı işlemi alıcı suş için de yapın. Konjugasyonun gerçekleşmesi için hem alıcı suş hem de donör suş, yakın fiziksel temas halinde bulunmaları amacıyla aynı filtre kağıdına eklenir. Bunu yapmak için, donör suşun ve alıcı suşun her ikisinden 50 mikrolitre, kütüphane (library) olarak etiketlenmiş plaka üzerindeki aynı filtreye ekleyin.

Filtreleri içeren bu agar plaklarını altı saat boyunca 37 derecede bekletin. Konjugasyon süreci, 37 santigrat derecede altı saat boyunca gerçekleşir. Konjugasyon sırasında pJA1 plazmidi alıcı suşa geçer.

Konjugasyon sonrası bakteriler, vorteksleme ile filtreden ayrıştırılır ve 1 mM IPTG ile indüklenir. IPTG, transpozazı indükler ve Kanamisin direnç genini içeren transpozon, alıcı suşun genomuna rastgele eklenir. Transpozonu taşıyan alıcı suşu seçmek için bakteriler, kanamisin ve başka bir antibiyotik içeren LB agar plaklarına ekilir.

Alıcı suş Lambda pir negatif olduğu için pJA1 plazmidi kaybolur. 37 °C'de altı saatlik büyümenin ardından konjugasyon tamamlanır. Filtreleri içeren plakaları inkübatörden çıkarın.

Negatif donör kontrolünü içeren filtreyi LB agar plakasından çıkarmak için steril pens kullanın. Filtre kağıdının konik tüpün tabanına inmesini sağlamak için tüpe hafifçe vurun ve filtrenin LB besiyerine tamamen daldırıldığından emin olun. Bu tüp, bir milimolar nihai konsantrasyonda IPTG içeren iki mililitre LB besiyeri içermektedir.

Bakterileri nitrocellüloz filtreden ayırmak için tüpü bir dakika boyunca vorteksleyin. LB besiyeri, bakteriyel hücrelerle bulanıklaşmalıdır. Bu işlemi alıcı kontrol ve kütüphane için de tekrarlayın.

Bakteriyel hücreleri içeren filtreler, bakterilerin filtreden ayrışması için iyice vortekslendikten sonra, bakteriyel hücreler seçici besiyerlerine ekilir. Bu aşamada, bakteriler kanamisin ve nalidiksik asit gibi başka bir antibiyotik içeren LB agar plaklarına eklenir. Kanamisin, kanamisin direnç belirtecini içeren transpozonun genomuna başarıyla entegre olduğu alıcı hücrelerin seçilmesi için kullanılır.

Genomuna işaretleyici entegre edilmemiş alıcı hücreler seçilimle dışlanır. Donör suşu seçilimle dışlamak için nalidiksik asit gibi başka bir antibiyotik kullanılır. Burada kullanılan donör suşu nalidiksik asite duyarlıyken, alıcı suşu nalidiksik asite dirençlidir.

Bu ikinci antibiyotik kullanılarak, donör suşun uzaklaştırılması mümkündür. Bu aşamada, kütüphanenin yeterince aralıklı ve çok sayıda koloni veren bir dilüsyonunu belirlemek için birkaç farklı dilüsyon ekilmelidir. Transpozom kütüphanesini içeren tüm plakalardaki koloni sayıları sayılıp kaydedildikten sonra, bazı kullanıcılar kütüphaneyi tek bir tüpte toplamak veya birleştirmek isteyebilir.

Bu işlem steril bir yayma çubuğu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Transpozon kütüphanesini içeren LB agar plakasına bir mililitre LB besiyeri ekleyin. Besiyeri plağa eklendikten sonra, bakterileri plakadan kazımak ve birbirinden ayırmak için steril yayma çubuğunu kullanın.

Tüm bakterileri plaklardan uzaklaştırmak genellikle mümkün değildir. Bakteri süspansiyonunu uzaklaştırın ve 50 ml veya 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Bu işlemi tüm plaklar için tekrarlayın.

Tüm plakalar sıyrıldıktan sonra, hücre kümelerini dağıtmak için havuzlanmış bakteri süspansiyonunu tam bir dakika boyunca vorteksleyin. Bu işlem artık havuzlanmış kütüphaneyi oluşturur. 37 °C'de 18 saatlik büyümeden sonra, donör veya resipiyent kontrol plaklarında herhangi bir büyüme olmamalıdır.

Mutant kütüphanesini içeren plakalar, ideal olarak çeşitli boyutlarda birçok koloni içermelidir. Farklı koloni boyutları, farklı fitness düzeylerine sahip klonları gösterir ve protokolün başarılı olduğunun iyi bir işaretidir. Bakterilerde yoğun bir transpozon mutajenez kütüphanesinin oluşturulması; virülans genlerinin ve bakteri patojenlerinin keşfinden, esansiyel genlerin incelenmesine ve genetik etkileşim ağlarının tanımlanmasına kadar birçok alt uygulama için potansiyel olarak avantajlıdır.

Tüm bu aşağı akış uygulamaları, yoğun bir transpozon insersiyon kütüphanesinin oluşturulmasına dayanmaktadır. Burada sunulan yöntem, E coli veya Shigella flexneri gibi enterobakteriyel suşlarda çok yoğun bir transpozon kütüphanesi oluşturmak için basit, hızlı ve düşük maliyetli bir prosedür sağlamaktadır.