Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, kültürde morfolojik ve fizyolojik olarak doğal akciğer dokusu ile karşılaştırılabilir akciğer dokusu oluşturmaktır. Bu, ilk önce yetişkin bir sıçandan kalp ve akciğerlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, pulmoner arteri ve trakeayı kanüle etmek ve kanüllü akciğerleri hücreden arındırma için bir biyoreaktöre bağlamaktır.

Hücre giderme ve durulamadan sonra, akciğer steril bir kültür biyoreaktörüne aktarılır ve oturma için hazırlanır. Prosedürün son adımı, akciğerin istenen bölmesini hazırlanmış bir hücre popülasyonu ile tohumlamaktır. Sonuç olarak, hücrelerden arındırılmış hücre dışı matrisin, immünofloresan mikroskobu yoluyla bölgesel olarak spesifik akciğer belirteçlerini eksprese eden hücrelerle verimli bir şekilde yeniden doldurulduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, akciğer hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesine yönelik mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücrelerin farklılaşmış fenotipleri uzun bir süre boyunca muhafaza etmesidir, bu nedenle üç boyutlu biyolojik olarak türetilmiş bir substratta birkaç hafta boyunca incelenebilirler. Hücreden arındırma için, akciğerler vasküler kanül yoluyla biyoreaktör kapağına bağlanır ve kapak, hücre çözme aparatına bağlanır. Akciğerlerin üzerindeki cam şişe, bir halka sehpası ve bağlı kelepçe ile yerinde tutulur.

Bu noktada, hücresel materyal ile yeniden doldurulabilen hücre dışı bir matris iskelesi oluşturmak için hücresel materyal çıkarılabilir. Tasarlanmış akciğer dokusunun tohumlanması ve kültürü için biyoreaktörün montajı bu şemada gösterilmiştir. Trakeal kanülün yem kilidi konektörü, trakea rezervuarı ile ana oda arasındaki bir solunum döngüsüne bağlanır.

Solunum döngüsü, iki adet tek yönlü valf içerir. Ortamın akciğere giren ve çıkan farklı bir yol izleyeceği şekilde pozisyonlar. Endotel hücrelerinin tohumlanması için perfüzyon hattına geçici olarak küçük bir rezervuar dahil edilir.

Hücreleri rezervuardan akciğerin vasküler bölmesine taşımak için bir pulsatil pompa kullanılır. Vasküler perfüzyon, bir silindir pompası kullanılarak sağlanır. Ortam, bağlı kanül yoluyla pulmoner artere perfüze edilir, akciğer damar sisteminden akar ve pulmoner venden doğrudan ana biyoreaktöre akar ve burada besiyeri perfüzyon için çekilir.

Pulmoner epitel, solunum halkasına enjeksiyon yoluyla oturtulur. Akciğeri içeren ana odacık ve trakea rezervuarı uzun süreli akciğer kültürü için kullanılır. Akciğerler çıkarıldığında ve arter ve trakea doğru şekilde kanüle edildiğinde, yeni çıkarılan akciğerler havayı sızıntı yapmadan tutmalıdır.

Bu, sıvıya batırılmışken hava ile şişirilerek doğrulanabilir. Hava sızıntısını gösteren herhangi bir kabarcık olmamalıdır. Protokole başlamak için, akciğerler sodyum nitropress içeren PBS ile şişirilir, ancak akciğerler dolana kadar ancak aşırı şişirilmemiş, akciğerlerin şişmiş kalması için trakeal kanülü hemen kapatın.

Daha sonra, akciğerleri PBS ve SNP ile 15 milimetre cıvada en az 15 dakika perfüze edin. Bundan sonra, akciğerlerin sönmesine izin vermek için durdurucuyu trakeal kanülden çıkarın. Gerekirse PBS ve SNP ile perfüzyona 15 ila 30 dakika devam edin.

Bolluk basıncının 10 ila 15 milimetre cıvada tutulmasını sağlamak için PBS ve SNP'yi yeniden doldurun. Uzun hücreden arındırma prosedürüne başlamak için, biyoreaktör kapağı hücre hücreden arındırma aparatına bağlanır. Daha sonra akciğerler kapağa bağlanır.

YS şeklindeki kanüle bağlı yem kilidi bağlantıları kullanılarak, pulmoner arter kanülü perfüzyon hattına bağlanmalı ve trakeal kanül serbest kalmalıdır. Dokunun tamamen hücrelerden arındırılmasını sağlamak için havayı sistemden uzak tutmak çok önemlidir. Arteriyel ve trakeal kanüldeki tek yönlü valfler, tüpte ters akış sağlayarak tüpteki hava kabarcıklarının temizlenmesine yardımcı olur.

Bu nedenle, hava kabarcıklarının şırınga ile çıkarılmasına izin vererek, tüm hatların havadan arındırıldığından emin olun. Hücre giderme solüsyonu ile perfüzyona başlayın. Hücre giderme çözeltisi ile perfüze edilir.

500 mililitre çözelti akciğerlerden geçene kadar, optimum basınç 15 milimetre cıvadan daha azdır. Bu genellikle 2,5 saat sürecektir. Akış hızları tipik olarak başlangıçta çok yavaştır ve ikinci saat içinde hızla dakikada yaklaşık bir mililitre veya daha fazlasına yükselir.

Perfüzyon sırasında periyodik olarak çıkarılır, akciğeri ve trakeal kanülü desteklemek için yeterli sıvının kalmasını sağlarken biyoreaktörden hücre giderme sıvısı kullanılır. Decellularizasyon sıvısı ile perfüzyon tamamlandığında, akciğerleri ve biyoreaktörü bir doku kültürü başlığına aktarın. Organ durulamaya başlamak için, hücre giderme sıvısını içeren 500 mililitrelik kavanozu çıkarın ve bir litreye kadar steril PBS içeren steril bir kavanozla değiştirin.

Hatların havadan arınmış olduğundan emin olmak için vakumlu emme veya bir şırınga kullanın, PBS'yi aynı şekilde 10 ila 15 milimetre cıvada vaskülatürde geçirin. Hücreden arındırmaya gelince, steril teknikler kullanarak atık PBS'yi biyoreaktörden periyodik olarak çıkarın ve PBS kavanozunu değiştirin veya yeniden doldurun. Taze, steril PBS ile en az 2,5 litre steril PBS akciğerlere perfüze olana kadar durulamaya devam edin.

Bu, durulama tamamlandığında hücre giderme işleminin başlangıcından itibaren tipik olarak iki gün sürer. Akciğerleri taze PBS artı %10 FBS artı %10 Pen strep içeren yeni bir steril biyoreaktör sistemine aktarın, hem tüm perfüzyon döngüsünün hem de tüm hava yolu hatlarının sıvıyla dolduğundan emin olun. Bundan sonra, akciğerleri dakikada beş milimetre hızında perfüze etmek için bir pulsatil pompa kullanılacaktır.

% 10 FBS ve% 10 penisilin streptomisin içeren PBS ile gece boyunca perfüzyon ile akciğer hücre dışı matris iskelesini sterilize edin. Bu adımı tamamladıktan sonra, akciğerleri bir saat boyunca veya sıcaklık dengelenene kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın. Ben Nase ile tedaviye hazırlanırken, bir sonraki adım akciğerleri Ben Nase ile tedavi etmektir.

Her akciğer için kalan DNA'yı çıkarmak için, önce 10 mililitrelik bir şırıngayı yalnızca Prewarm Ben Nase tamponu ile ve 10 mililitrelik bir şırıngayı mililitre başına 90 birim ile doldurun. Ben Nase, Ben Nase tamponunda seyreltilmiş. Akciğerlerin perfüzyonunu durdurun.

Ardından, akciğere hava enjekte etmekten kaçınırken hava yolunu Ben Nase tamponu ile şişirin. Akciğerin bir dakika sönmesine izin verin. Ardından akciğeri Ben Nase solüsyonu ile şişirin.

Yine Ben Nase ile şişirdikten sonra akciğere hava girmemesine dikkat edin. Akciğerlerin bir saat boyunca 37 santigrat derecede perfüzyon veya ventilasyon olmadan oturmasına izin verin. Bir saatin sonunda, halihazırda biyoreaktörde bulunan PBS artı %10 FBS %10 penisilin streptomisin ile perfüzyona devam edin ve ertesi gün gece boyunca perfüzyona devam edin.

Durulama ve sterilizasyondan sonra, uzun hücre dışı matris iskelesi hücresel yeniden popülasyon için hazırlanabilir. P-B-S-F-B-S benzo a çözeltisini 250 mililitre kültürle değiştirin. Hücreler eklenmeden önce en az bir saat boyunca orta perfu ve hücreleri tohumlamadan hemen önce taze kültür ortamı ile değiştirin.

Organ çekilmesi için birçok hücre kaynağından yararlanılabilir. Burada, epitel hücre popülasyonu ile oturma gösterilecektir. İlk olarak, istenen epitel hücre popülasyonunun 15 mililitre hücre süspansiyonunu içeren bir şırınga hazırlayın.

Ardından, hava yolu rezervuarını 80 mililitre kültür ortamı ile doldurun ve tüm havalandırma hatlarının havadan arınmış olduğundan emin olun. Ardından biyoreaktörü 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve havalandırma için şırınga pompasını bağlayın. 15 mililitrelik hücre süspansiyonunu trakeal kanüle enjekte ederek tek bir hızlı bolus kullanarak hücreleri akciğerlere tohumlayın.

Ana biyoreaktördeki hava filtrelerinin kapalı olduğundan emin olun. Ardından, ana biyoreaktörden dakikada üç mililitre hızla 60 mililitre hava çekmek için şırınga pompasını kullanarak hemen tek bir yavaş nefese başlayın. Bu yaklaşık 20 dakika sürecektir.

A: Bundan sonra akciğerlerin yaklaşık 18 saat statik olarak oturmasına izin verin. Yavaş vasküler perfüzyona dakikada yaklaşık 0,5 mililitre ile başlayın. Organ kültürü sırasında, perfüzyon tipik olarak dakikada bir ila üç mililitre olarak gerçekleştirilir.

Epitel kültürü sırasında bir silindir pompası kullanılarak, ventilasyon tipik olarak dakikada bir nefes sürekli hızında ve beş ila 10 mililitre tidal hacimde sağlanır. Bir şırınga pompası kullanılarak hava, ana hazne içindeki negatif basınç ile atmosferik basınç arasında geçiş yaparak solunumu etkilemek için döngüsel olarak geri çekilir ve biyoreaktöre enjekte edilir. Havalandırma sırasında biyoreaktörün hava geçirmez şekilde muhafaza edilmesi gerektiğinden, havalandırma günlük olarak duraklatılmalı ve ana odadaki hava değiştirilmelidir.

Ek olarak, ortam yaklaşık olarak her üç ila dört günde bir değiştirilmelidir. Kültür sırasında, pulmoner epitel ve vasküler endotel kültürlenerek her seferinde toplam hacmin yaklaşık yarısı değiştirilmelidir. Biyoreaktöre monte iskele içinde, kısa zaman aralıkları için gaz değişimine katılabilen akciğer dokusu üretebiliyoruz.

Doğal sıçan akciğerinin standart bir hematik, toin ve eoin boyası, hücreden arındırılmış bir sıçan akciğerinin H ve e boyası ile karşılaştırma için burada gösterilmiştir. Son hücreden arındırılmış hücre dışı matriks, hücresel materyallerden tamamen yoksun olmalı ve doğal akciğerin brüt, mikroskobik ve ultra yapısal özelliklerini korumalıdır. H ve e boyası, hücre tohumlaması ve ardından akciğer kültürü için en uygun koşulların yetersiz hücre giderme veya durulama sonucunda iskeleye yapışan herhangi bir kalıntı DNA'nın görselleştirilmesini sağlayacaktır.

Ve biyoreaktör, akciğerin beş lobunun tamamında iyi dağılmış hücreler vermeli ve hücre dışı matris iskelesinin yaklaşık% 70'ini kapsamalıdır. Bu görüntüler, immünofloresan ile boyandığında doğal akciğeri yeniden doldurulmuş akciğerle karşılaştırır. Anahtar akciğer belirteçleri için, kültürlenmiş hücre popülasyonu, Clara hücre salgı proteini pro salgı proteini C ve Aquaporin beş için pozitiftir.

İlgilenilen işaretler kırmızı renkle gösterilir ve DAPI lekeli çekirdekler tüm panellerde mavi renktedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür hücreden arındırmadan geri çekilmeye kadar, uygun şekilde yapılırsa dört ila beş gün içinde yapılabilir.