Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

Bu çiftleşme testinin genel amacı, konjugatif transfer geni içindeki mutasyonların, fonksiyonel bir tip dört sekresyon kompleksi bağlamında plazmit transferini etkileme yeteneği üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, bakteriyel konjugasyonda fonksiyonel bir tip dört salgılama sistemini bir araya getirirken transfer proteinleri arasında meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin bölgelerinin belirlenmesi gibi proteine özgü soruların sorulmasına izin verir. Bu teknikte, büyük konjugatif plazmitler üzerindeki genler homolog rekombinasyon ile nakavt edilir.

Gen fonksiyonu, hedef genin daha küçük bir plazmit üzerindeki nakavtlara sağlanmasıyla değerlendirilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edeceklerdir çünkü organizasyon ve kurulum bu prosedürü başarılı bir şekilde yürütmenin anahtarıdır. Yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için uygun deneysel hazırlık gereklidir.

Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi sindirilmiş pBAD33 plazmidinin hazırlanmasıyla başlayın. Her sindirimi bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Bir UV kabini ve steril bir tıraş bıçağı kullanarak, kateter dizisine karşılık gelen 2,8 kiloluk taban bandını jelden kesin.

DNA'nın UV maruziyetini en aza indirmek için hızlı çalışın. Üreticinin protokolüne göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilmiş jel diliminden DNA'yı çıkarın. Ekstrakte edilen kedi kasetini polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR ile amplifiye etmek için.

Reaksiyon karışımını steril bir PCR tüpünde hazırlayın. Homolog rekombinasyon için hedef gen dizisine homolog olan çıkıntılar içeren primerler kullanın. Şablon DNA'yı çift damıtılmış su ile değiştirmek dışında, aynı bileşenleri taşıyan negatif bir kontrol ayarlayın.

Ayrıca, bir PCR reaksiyonunda çalıştığı kanıtlanmış şablon DNA ve primerler kullanarak pozitif bir kontrol oluşturun. Tüm reaksiyon içeriğini pipetleme ile nazikçe karıştırın. Ardından, metin protokolünde listelenen PCR parametrelerini kullanarak çıkarılan kedi kasetini yükseltin.

Agaroz jel elektroforezi yoluyla doğru amplifikasyon boyutunu doğrulamak için her reaksiyondan sadece beş mikrolitre kullanın. Üreticinin protokolüne sahip bir PCR saflaştırma kiti kullanarak PCR ampliconunu saflaştırın. 300 nanogram güçlendirilmiş kedi kasetini, pOX38-Tc plazmidini buz üzerinde barındıran 50 mikrolitre elektroyetkin DY330R hücresine ekleyin.

Karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Pozitif kontrol olarak değiştirilmemiş pBAD33 plazmidi kullanarak bu adımı tekrarlayın. Ardından, hücreleri önceden soğutulmuş bir milimetre elektroporasyon küvetine aktarın.

Bir elektroporatör kullanarak hücreleri 5,5 milisaniyelik bir zaman sabiti ile 1,8 kilovoltta elektropoze edin. Hemen, nabzı uyguladıktan sonra, hücreleri bir mililitre SOC ortamı ile seyreltin ve yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın. Hücreleri iki saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, her numunenin 100 mikrolitresini, mililitre tetrasiklin başına 10 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 20 mikrogram içeren agar plakalarına ayırın. Alikotu steril bir yayıcı kullanarak plakanın üzerine yayın. Plakayı gece boyunca 32 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.

Ertesi gün, başarılı rekombinantlar için seçim yapın. Hücreye sokulan kedi kaseti, ilgilenilen gen ile homolog rekombinasyona uğrayacak ve pOX38-Tc kloramfenikol nakavt klonunu oluşturacaktır. Elektroporat 300 nanogram pK184 geni veya pK184 gen mutant plazmitini, daha önce olduğu gibi pOX38-Tc kloramfenikol nakavt plazmidini barındıran 50 mikrolitre elektrokompotent DY330R hücresine ayırın.

XK1200 donör hücrelerini oluşturmak için, konjugatif çiftleşme gerçekleştirin ve ardından XK1200 hücreleri oluşturmak için elektroporasyon gerçekleştirin, metin protokolünde açıklandığı gibi hem kloramfenikol nakavtını hem de PK184 plazmidini takip edin. Bu XK1200 donör hücrelerinin kloramfenikol ve kanamisin ile 20 mililitre steril LB'de gece boyunca kültürünün hazırlanması. Ayrıca, bir gliserol stoğundan veya ang agar plakasındaki tek bir koloniden alınan hücreleri kullanarak, mililitre başına 50 mikrogram streptomisin ile 50 mililitre LB içinde MC4100 alıcı hücrelerini hazırlayın.

Kültürleri 37 santigrat derecede, 200 rpm'de çalkalayarak büyütün. Tüm donör hücrelere 100 milimolar nihai konsantrasyona glikoz ekleyin. Ertesi gün, aynı antibiyotiklerle iki mililitre steril LB'de ayrı ayrı her gece kültüründen 70'te 1 seyreltme yapın.

Hücreleri 200 rpm'de çalkalayarak 37 santigrat derecede orta log fazına büyütün. Hücreleri peletlemek için hücre kültürünü santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, antibiyotikleri çıkarmak için hücre peletini soğuk steril LB ile bir kez yıkayın.

Daha önce olduğu gibi ikinci kez santrifüjledikten sonra, hücreleri iki mililitre soğuk steril LB.In kopya halinde askıya alıyoruz, 100 mikrolitre donör hücre ve 100 mikrolitre alıcı hücreyi bir mililitre toplam hacim için 800 mikrolitre steril LB ortamına alıyoruz. Hücrelerin sallanmadan bir saat boyunca 37 santigrat derecede çiftleşmesine izin verin. Bir saat sonra, çiftleşme çiftlerini bozmak için hücreleri 30 saniye boyunca girdaplayın.

Ardından, daha fazla çiftleşmeyi önlemek için hücreleri 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Mid log kültürlerini ve taze steril LB'yi kullanarak, verici ve alıcı hücrelerin 1 ve 100'den 1 ve 10 milyona kadar altı seri dilüsyonunu hazırlayın. Naladixic asit, kloramfenikol ve kanamisin içeren bir agar plakasının iki yarısının her birinde, XK1200 donör hücrelerinin her bir seyreltilmesinden 10 mikrolitre alikot tespit edin.

Streptomisin içeren agar plakaları üzerinde alıcı MC4100 hücrelerinin seyreltmeleri için lekelenmeyi tekrarlayın. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, girdap karışımını ve taze steril LB'yi kullanarak, transkonjugantların altı seyreltmesini hazırlayın.

Streptomisin ve kloramfenikol içeren agar plakalarının her yarısında her seyreltmenin on mikrolitrelik alikotunu tespit eden pOX38-Tc kloramfenikol nakavtını barındıran transkonjugan MC4100 hücrelerini seçin. Her iki yinelenen karışım için de tekrarlayın. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İlgili plakalarındaki her donör, alıcı ve transkonjugan hücre için aynı seyreltme lekelenmesinden koloni sayısını sayarak çiftleşme verimliliğini hesaplayın. Ayrıca, söz konusu seyreltmede alıcılardan daha fazla sayıda transkonjugandan kaynaklanan herhangi bir yanlılığı test etmek için alıcı kolonilerini sayın. Çiftleşme verimliliğini, 100 donör hücre başına verimlilik değerini elde etmek için transkonjugan koloni sayısının donör koloni sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması olarak hesaplayın.

Tip dört salgı sistemi gen-tra-F, pOX38-Tc plazmidinden çıkarıldığında, pOX38-Tc traF kloramfenikol nakavt plazmidinin konjugatif transferinin kaybına neden olur. Bununla birlikte, traF geni, PK184 traF plazmidi ve donör hücreler tarafından trans olarak sağlandığında, pOX38-Tc traF kloramfenikol nakavt plazmidinin konjugatif transferinde bir geri kazanım gözlenir. Donör hücrelerde traF ve PK184 plazmidinin seyreltme mutantları ile sağlandığında, pOX38-Tc traF kloramfenikol nakavt plazmitinin konjugatif transfer kaybı gözlenebilir.

Konjugatif transfer kaybı, konjugatif tip dört sekresyon sistemi içindeki protein-protein etkileşimleri için önemli olan protein bölgesini gösterir. Bu bölge daha sonra transfer verimliliğini etkileyen nokta mutasyonları ile daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beklenen büyüme süreleri ile tek bir iş gününde gerçekleştirilebilir.

Bu protokol, burada gösterilenler dışındaki hücreler üzerinde de yapılabilir. Bu noktada kritik olan şey, donör ve alıcı hücrelerin ilgilenilen plazmidi barındırmamasıdır. Böylece nakavt plazmidi eklediğinizde çelişkili sonuçlar elde etmezsiniz.

Bu prosedürü denerken, donör, alıcı ve transkonjuge hücreler için farklı büyüme koşulları ve antibiyotikler olduğundan çok organize olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen proteinin ayrıntılı bir yapısal ve fonksiyonel resmini elde etmek için kristalografi, NMR veya kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.