Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, etanol maruziyetinin gelişmekte olan zebra balığı üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu, öncelikle erken gelişim dönemindeki zebra balıklarının, normal embriyo suyu içindeki etanol dozlarına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından etanol uzaklaştırılır ve balıkların istenen zaman noktasına kadar gelişmelerine izin verilir.

Ardından, kontrol embriyolarıyla karşılaştırmalı olarak, işlem görmüş embriyolarda hem genel fiziksel değişiklikler hem de gen ifadesindeki değişimler analiz edilir. Son olarak, etanol kaynaklı gelişimsel kusurların değiştirilip değiştirilemeyeceğini belirlemek için embriyolar mRNA, morfolino veya ilaçlar ile manipüle edilir. Nihayetinde, kantitatif PCR ve in situ hibridizasyon kombinasyonu, etanolün gelişmekte olan zebra balığı embriyoları üzerindeki etkilerinin gen ifadesindeki değişimlerle bağlantılı olduğunu göstermektedir.

Gen ekspresyon seviyelerinin sonradan manipüle edilmesi, etanol kaynaklı gelişimsel kusurları iyileştirebilir veya önleyebilir. Bugün göstereceğimiz teknikler, hem fetal alkol sendromunun doğasına dair bilgilerimizi genişletmekte hem de omurgalılardaki gelişimsel süreçleri korumaktadır. Embriyoların etanol ile tedavi edilmesini bugün laboratuvarımdaki teknisyen Steph Erhardt gösterecek.

Embriyoları, yabani tip çiftleşmelerden elde ederek embriyo suyunda 28 °C'de kubbe evresine kadar büyütün. Bir yumurta grubundaki embriyoları, kap başına 10 ile 50 embriyo düşecek şekilde istenen sayıda kaba paylaştırın. Embriyolara balık suyu içerisinde hacimce %0,2 ile %2,5 arasında etanol çözeltisi ekleyin ve istenen maruziyet süresinin ardından en fazla 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Kantitatif PCR için mRNA toplamak amacıyla, gelişimin belirli bir döneminde, su içeren etanolü taze embriyo suyu ile değiştirin. H eşleşmiş embriyoları eppendorf tüplerine yerleştirin. Balık suyunu uzaklaştırın ve TCEP içeren lizis tamponu ekleyin.

Motorlu bir pulverizatör kullanarak embriyoları fiziksel olarak ayrıştırın ve ardından yavaş hızda döndürmek için santrifüje yerleştirin. Çözünür maddeyi bir ön temizleme kolonuna aktarın, ardından kolonu santrifüjleyin. Bu işlem, ayrışmış büyük parçaları uzaklaştırmak içindir.

RNA'yı ekstre etmek için bir RNA izolasyon kiti kullanın. Ardından, embriyoları in situ hibridizasyon ve antikor boyamasına hazırlamak için QPCR veya mikroarray analizi için standart yöntemleri kullanarak cDNA sentezleyin. Döllenmeden sonraki 6 ila 24 saatlik embriyoları, PBS artı %0,1 tween ile üç yıkamanın ardından, 4 °C'de gece boyunca %4 paraformaldehit içerisinde sabitleyin.

Mikroskop altında iki keskin penset kullanarak koryonu çıkarın. Ardından, artan metanol konsantrasyonu ve azalan PBT konsantrasyonu içeren bir dizi sıvı değişimiyle embriyoları metanole aktarın. Embriyolar %100 metanole aktarıldıktan sonra, kıkırdağı boyamak için onları -20 °C'de saklayın.

Embriyoları döllemeden sonraki beş veya altı güne kadar büyütün. Dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içerisinde gece boyunca sabitleyin. Ardından, etanol maruziyeti nedeniyle hangi gen ekspresyon seviyelerinin değiştiğini belirlemek için embriyoları PBT ile üç kez yıkayın.

Öncelikle primerleri doğrulamak için primerler tasarlayarak QPCR gerçekleştirin. Bunları üç biyolojik örnek üzerinde test edin. Bu kontrol biyolojik örnekler, ilgili gen o yaşta eksprese edildiği sürece herhangi bir yaşta olabilir.

Primerler doğrulandıktan sonra, örnekleri üç paralel şeklinde çalıştırarak ve zebrafish kontrolü için bir kontrol örneği ekleyerek QPCR gerçekleştirmek üzere önceden hazırlanmış CDNA'yı kullanın; gap dh için primerler kullanıyoruz. Sonuçları gap DH seviyelerine göre normalize edin. Ardından, güçlü yöntem (powerful method) kullanarak gen ekspresyonunun bağıl seviyesini hesaplayın.

Vahşi tipe kıyasla deneysel farkı gösteren iki delta delta CT varyasyonu. C'de iki hibridizasyon konstrüktü. İlgili gene yönelik işaretli ribo probları.

Ardından bunları, standart koşullar altında yaşa uygun embriyolarla inkübe edin ve hibridizasyon paternini alkali fosfataz kullanarak tespit edin; morfogenik gelişimi değerlendirmek için örnekleri bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin (örneğin, ağız şekli gibi). İnteroküler mesafeyi ve vücut uzunluğunu değerlendirmek için canlı embriyoları görüntüleyin. İlk olarak, embriyoları paraformaldehit ile sabitleyin. Daha sonra, alkol uygulamasının larvalardaki gelişen kıkırdak yapıları üzerindeki etkilerini incelemek için görüntüler toplayın ve boyama yapın.

Görüntüleme öncesinde embriyoları sabitlemek ve şeffaflaştırmak için zebrafish'leri birkaç saatten gece boyunca lc ve blue ile işleyin. Canlı embriyolardaki hücre ölümünü, embriyoları PBS içerisinde 5 mg/mL aine orange ile bir saat boyunca inkübe ederek analiz edin. Embriyoları PBS ile üç kez yıkayın, ardından embriyoları lamlara monte edin, örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin ve kompozitler oluşturmak için Z serisi kullanın.

Etanol maruziyeti nedeniyle ekspresyonu azalmış genler belirlendikten sonra, ilgilenilen bir gene ait 25 ila 200 picogram per nanoliters miktarda capped mRNA, bir ila iki hücreli evreye enjekte edin. Yumurtaların dome evresine ulaşana kadar 28 °C ısıtmalı inkübatörde toparlanmasına izin verin ve ardından daha önce olduğu gibi etanol ile tedavi edin. Etanol maruziyeti sonucunda ekspresyonu artan genler için, bir ila iki hücreli evredeki embriyolara picogram ile nanogram miktarlarında antisense morphos enjekte ederek bu genleri susturun.

Bu protokol, kaplı mRNA protokolüne benzerdir. Eğer bir mRNA veya splicing morpholino enjekte ediliyorsa, doza bağlı gen aktivitesini analiz etmek için spliced ve unsliced transkript miktarlarını karşılaştırarak R-T-P-C-R ile verimliliği ölçün, enjekte edilen morpholino miktarını titre edin ve embriyoları etanol ile tedavi etmeden önce istenilen evreye kadar gelişmelerine izin verin. Zebra balığı embriyolarının etanola maruz kalması, diğer omurgalılarda bulunan fenotiplerle ilişkili bir dizi gelişimsel ve genetik defektle sonuçlanır.

Noor dahil olmak üzere aksiyel dokuların anormal gelişimi, noord'un kısalmasına ve zaman zaman bozulmasına yol açar; bu durum kısmen, burada gösterildiği gibi somitlerdeki daha sonraki anomalilere neden olur. İşlem görmemiş kontrollerde belirgin bir chevron şekli görülürken, etanol ile işlem görmüş somitler, azalmış sonic hedgehog sinyalleşmesinde görülen U şeklinde bir görünüm alır. Burada görüldüğü gibi.

Etanol maruziyetinin, muhtemelen erken gelişimsel gecikme ve ardından gelen nöral defektlerin bir sonucu olan bir diğer etkisi, embriyo uzunluğunun kısalmasıdır. Bu bulgu, gelişim sırasında etanole maruz kalan çocuklarda görülen ergenlik öncesi dönemin uzaması ve kısa boyluluk durumuyla benzerlik göstermektedir; bu da zebrafish modelinin, insandaki bu doğum kusurunun anlaşılması açısından uygun olduğunu göstermektedir. Hayvan modellerinde, şiddetli etanol maruziyetinin, sintia ve opia dahil olmak üzere belirgin fetal alkol sendromu fenotiplerine yol açtığı kanıtlanmıştır.

Zebrafish'lerde, intraoküler mesafe veya IOD, insan doğum kusurunun doğasıyla uyumlu olarak etanol dozuna bağlı bir şekilde azalır. Opia yalnızca çok yüksek dozlarda görülür, ancak daha düşük dozlar IOD'de anlamlı bir azalmaya neden olur; bu durum, bu hayvan modelinin orta hat yüz gelişiminde benzer bir kusura sahip olduğunu göstermektedir. Bu şekilde, tedavi edilmemiş ve etanol uygulanmış embriyolarda six three B ve glee one'in erken gen ekspresyon seviyeleri karşılaştırılmıştır.

Her iki gen de etanolle işlem görmüş örneklerde azalmış ekspresyon seviyeleri göstermiştir. NC iki hibridizasyon kullanılarak, six 3 B ve gooID için ekspresyon paternleri göründüğü şekilde analiz edilmiştir. Burada, her iki gen de etanolle işlem görmüş embriyolarda, işlem görmemiş kontrollere kıyasla uzamsal ekspresyonda bir azalma göstermiştir.

Her iki gen de kraniofasyal orta hat dokularına dönüşecek dokularda eksprese edildiği için, döllenmeden sekiz saat sonraki azalma, gelişimin ilerleyen aşamalarında IOD'deki azalma ile tutarlıdır. Etanolden etkilenen genler belirlendiğinde, bunların ekspresyonunun artırılabileceği veya azaltılabileceği mekanizmalar mevcuttur. Bu örnekte, gli1 seviyelerini artıran bir ligand olan sonic hedgehog için mRNA enjekte edilmiş ve bu işlem, gli1 azalması ve etanol uygulaması nedeniyle embriyolarda meydana gelen kaba defektleri gidermiştir.

Bununla birlikte, six three B enjeksiyonu, etanola maruz kalan fenotipi kurtaramamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan bir zebrafish embriyosunda etanolün neden olduğu genetik ve gelişimsel defektlerin nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Burada kullanılan teknikler, gelişmekte olan omurgalı embriyolarında diğer suda çözünür bileşiklerin toksisitesini çalışmak isteyenler için de uygulanabilir.