Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, etanol maruziyetinin gelişmekte olan zebra balığı üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu, ilk olarak zebra balığının erken gelişim sırasında normal embriyo suyunda etanol dozlarına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra etanol çıkarılır ve balığın istenen zaman noktasına kadar gelişmesine izin verilir.

Daha sonra hem brüt fiziksel değişiklikler hem de gen ekspresyonundaki değişiklikler, kontrol embriyolarına kıyasla tedavi edilir. Son olarak, etanolün neden olduğu gelişimsel kusurların değiştirilip değiştirilemeyeceğini belirlemek için embriyolar mRNA, morfozlar veya ilaçlarla manipüle edilir. Sonuç olarak, kantitatif PCR ve C'de iki hibridizasyonun bir kombinasyonu, etanolün gelişmekte olan zebra balığı embriyoları üzerindeki etkilerinin gen ekspresyonu değişikliği ile bağlantılı olduğunu göstermektedir.

Gen ekspresyon seviyelerinin müteakip manipülasyonu, etanolün neden olduğu gelişimsel kusurları iyileştirebilir veya önleyebilir. Bugün gösterdiğimiz teknikler, fetal alkol sendromunun doğası hakkındaki bilgimizi genişletmenin yanı sıra omurgalılardaki gelişimsel süreçleri de koruyor. Bugün, embriyoları etanol ile tedavi etmek için laboratuvarımda bir teknisyen olan Steph Erhardt gösterecek.

Onları vahşi tip çiftleşmelerden embriyo suyunda 28 santigrat derecede kubbe aşamasına yükseltin. Embriyoları bir kavramadan, tabak başına 10 ila 50 embriyo ile istenen sayıda tabağa bölün. Embriyolara balık suyunda hacimce% 0.2 ila 2.5 arasında bir etanol çözeltisi ekleyin ve istenen maruz kalma süresinden sonra 24 saate kadar inkübatöre geri dönün.

Kantitatif PCR için mRNA toplamak için etanol içeren suyu belirli bir gelişim dönemi için taze embriyo suyu ile değiştirin. H eşleşen embriyoları einor tüplerine yerleştirin. Balık suyunu çıkarın ve TCEP ile lizis tamponu ekleyin.

Motorlu bir pulverizatör kullanarak, embriyoları fiziksel olarak ayırın ve ardından yavaş bir dönüş için santrifüje yerleştirin. Çözünen maddeyi önceden temizlenmiş bir sütuna aktarın, ardından sütunu santrifüjleyin. İlişkisi kesilmiş büyük parçaları çıkarmak için.

RNA'yı çıkarmak için bir RNA izolasyon kiti kullanın. Daha sonra, embriyoları C'de iki hibridizasyon ve antikor belirtimi için hazırlamak için QPCR veya mikrodizi analizi için standart yöntemler kullanarak CDNA'yı sentezleyin. Döllenmeden altı ila 24 saat sonra% 4 para formaldehitte% 4 para formaldehitte, üç yıkama ve PBS artı% 0.1 arasını takiben sabitleyin.

Mikroskop altında iki keskin forseps kullanarak choon'u çıkarın. Daha sonra, artan metanol konsantrasyonunun ve azalan PBT konsantrasyonunun bir dizi sıvı değişimini kullanarak embriyoları metanole taşıyın. Embriyoları %100 metanole aktardıktan sonra, kıkırdağı lekelemek için eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Embriyoları döllenmeden beş veya altı gün sonrasına yükseltin. Bunları gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraform aldehit içinde sabitleyin. Daha sonra etanol maruziyetinden hangi gen ekspresyon seviyelerinin değiştiğini belirlemek için PBT'de üç kez yıkayın.

Primerleri doğrulamak için önce primerler tasarlayarak QPCR gerçekleştirin. Bunları üç biyolojik numune üzerinde test edin. Bu kontrol biyolojik örnekleri, ilgilenilen gen o belirli yaşta ifade edildiği sürece herhangi bir yaşta olabilir.

Primerler doğrulandıktan sonra, QPCR çalışan numuneleri üç nüsha halinde gerçekleştirmek için önceden hazırlanmış CDNA'yı kullanın ve bir zebra balığı kontrolü için bir kontrol numunesi dahil olmak üzere, dh boşluğu için primerleri kullanırız. Sonuçları DH seviyelerini aralığa getirmek için normalleştirin. Ardından, güçlü yöntemi kullanarak gen ekspresyonunun nispi seviyesini hesaplayın.

Yabani tipe göre deneysel olarak fark gösteren iki delta delta BT'deki varyasyon. C'de iki hibridizasyon yapısı için. İlgilenilen gene ribo probları etiketledi.

Daha sonra, standart koşulları kullanarak bunları yaşa uygun embriyolarla inkübe edin ve alkalin fosfataz kullanarak hibridizasyon modelini tespit edin, morfojenik gelişimi değerlendirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak numuneleri görüntüleyin, örneğin interoküler mesafeyi ve vücut uzunluğunu değerlendirmek için canlı embriyoları şekillendirebilir. İlk olarak, embriyoları para formaldehitte sabitleyin. Daha sonra alkol tedavisinin larva lekesinde gelişmekte olan kıkırdak yapıları üzerindeki etkilerini incelemek için görüntüler toplayın.

Görüntülemeden önce embriyoları gece boyunca alıkoymak ve temizlemek için birkaç saat boyunca lc ve mavi kullanarak sabit zebra balığı. Canlı embriyolardaki hücre ölümünü, PBS'de bir saat boyunca mililitre aine portakalı başına beş miligram olarak inkübe ederek analiz edin. Embriyoları PBS'de üç kez yıkayın, ardından embriyoları slaytlara monte edin, örnekleri konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleyin ve kompozitler oluşturmak için Z serisini kullanın.

Etanol maruziyeti nedeniyle ekspresyonu azalan genleri tanımladıktan sonra, ilgilenilen bir gen için nanolitre kapaklı mRNA başına 25 ila 200 pikogram bir ila iki hücre aşamasına enjekte edin. Yumurtaların kubbe aşamasına gelene kadar 28 santigrat derece ısıtılmış bir inkübatörde iyileşmesine izin verin ve ardından daha önce olduğu gibi etanol ile muamele edin. Etanol maruziyetinin bir sonucu olarak ekspresyonu artan genler için, bir ila iki hücre aşaması embriyosuna nanogram miktarlarda antisens morfolara pikogram enjekte ederek bunları yıkın.

Bu protokol, kapaklı mRNA için olana benzer. Bir mRNA enjekte ediliyorsa, morfo ekleniyorsa, doza bağlı gen aktivitesini analiz etmek için eklenmiş ve dilimlenmemiş transkript miktarlarını karşılaştırmak için RTPCR kullanarak verimliliği ölçün, enjekte edilen morinoyu titre edin ve embriyoların etanol ile muamele etmeden önce istenen bir aşamaya gelişmesine izin verin. Zebra balığı embriyosunun etanole maruz kalması, diğer omurgalılarda bulunan fenotiplerle ilgili bir dizi gelişimsel ve genetik kusura neden olur.

Noor da dahil olmak üzere aksiyel dokuların anormal gelişimi, kısalmış ve bazen bozulmuş bir noord'a yol açar, bu da kısmen burada gösterildiği gibi somitlerde daha sonraki anormalliklere yol açar. İşlenmemiş kontroller güçlü bir chevron şekline sahipken, etanol ile muamele edilmiş somitler, azaltılmış sonik kirpi sinyalizasyonu ile görülen U şeklindeki görünümü alır. Burada görüldüğü gibi.

Etanol maruziyetinin bir başka sonucu, muhtemelen erken gelişimsel gecikme ve müteakip Noor kusurlarının aşağı akışında embriyo uzunluğunun kısalmasıdır. Bu bulgu, gelişim sırasında etanole maruz kalan çocuklarda bulunan ergenlik öncesi kısa boyların kalıcılığına benzer, bu da zebra balığı modelinin bu insan doğum kusurunun anlaşılması için ilgili olduğunu düşündürmektedir. Hayvan modellerinde, şiddetli etanol maruziyetinin, synthia ve opia dahil olmak üzere belirgin fetal alkol sendromu fenotiplerine yol açtığı gösterilmiştir.

Zebra balığında, göz içi mesafesi veya IOD, insan doğum kusurunun doğası ile tutarlı olarak etanol dozuna bağlı bir şekilde azalır. Opia sadece çok yüksek dozlarda bulunur, ancak daha düşük dozlar IOD'de önemli bir azalma sağlar, bu da bu hayvan modelinin orta hat yüz gelişiminde benzer bir kusura sahip olduğunu düşündürür. Bu şekilde, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş embriyolarda altı üç B ve bir glee bir'in erken gen ekspresyon seviyeleri karşılaştırılmıştır.

Her iki gen de etanol ile muamele edilen numunelerde düşük ekspresyon seviyeleri gösterdi. NC iki hibridizasyonu kullanılarak, altı üç B ve gooID için ekspresyon paternleri görüldüğü gibi analiz edildi. Burada, her iki gen de etanol ile tedavi edilen embriyolarda tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla uzamsal ekspresyonda bir azalma gösterdi.

Her iki gen de C kraniyofasiyal orta hat dokuları haline gelmeye mahkum dokularda eksprese edildiğinden, döllenmeden sekiz saat sonraki azalmaları, gelişimin ilerleyen dönemlerinde IOD'deki azalma ile tutarlıdır. Etanolden etkilenen genler tanımlandıktan sonra, ekspresyonlarının arttırılabileceği veya azaltılabileceği mekanizmalar vardır. Bu örnekte, mRNA, glee one seviyelerini artıran bir ligand olan sonik kirpi için enjekte edildi ve glee one ve etanol ile muamele edilen embriyolardaki azalmalar nedeniyle büyük kusurları kurtardı.

Bununla birlikte, altı üç B'nin enjeksiyonu, etanole maruz kalan fenotipi kurtaramadı. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosu olan etanolün ürettiği genetik ve gelişimsel kusurları nasıl keşfedeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Burada kullanılan teknikler, gelişmekte olan omurgalı embriyosunun diğer suda çözünür bileşiklerinin toksisitesini incelemek isteyenlere de uygulanabilir.