Name: Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler Aplysianın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin Aplysia gangliyonunda kalsiyum görüntüleme ve intraselüler kayıt kullanarak sinaptik etkinlik ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu eş zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik sinaptik plastisite araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A PHS Grant (MH51393) bu çalışmalarını desteklemiştir. Kullandığımız Aplysia&#39;nın Bazı Araştırma Kaynakları, NIH National Center for Grant RR10294 altında Miami Üniversitesi Aplysia&#39;nın için Ulusal Kaynak tarafından sağlanmaktadır.

1. Hazırlık <ol><li> 75-100 ml izotonik magnezyum klorid çözeltisi enjekte edilerek hayvan anestetize. Biz görüntüleme için kullanmak Aplysia&#39;nın genellikle 150-200 gram ve Marinus Bilimsel elde edilir. </li><li> Bir balmumu kaplı çanak anestezi hayvan Pin. Şırınga iğneleri bu amaç için iyi çalışır; steril teknikler gerekli değildir. Brüt forseps ve standart makas kullanarak hayvanın ayağı bir kesi yapmak ve bukkal kitle maruz. Bukkal ganglion bulun. Tüm bukkal sinirler kesilerek ganglion dikkatle ücretsiz, yay makas ve ince forseps kullanma. </li><li> Ganglion çıkarın ve yapay deniz suyu içeren bir Sylgard astarlı çanak yerleştirin. Ganglion stabilize bukkal sinirler aracılığıyla birkaç böcek işaretçilerine yerleştirin. Desheath intrasellüler kayıt için nöronlar maruz ultra ince forseps ve yaylı makas, böylece kullanarak bukkal ganglion. Sonra yaklaşık 15 ince böcek (kullanarak ganglion re-pin minutien) işaretçilerine. Herhangi bir hareket görüntüleme sırasında sorunlu olacak gibi gangliyon sıkıca tutulmalıdır. </li></ol> 2. Elektrotlar hazırlayın <ol><li> Filament cam kapiller tüp kullanarak elektrotlar (örneğin TEFE TW100F-4) ve bir çektirmesi çekin. Ayarları ayrı ayrı istenilen direnç elektrodlar oluşturmak için kararlı olmalıdır. Elektrotlar eğimli olabilir, ya da yaklaşık 5 MOhms eğim verme aşaması atlanmıştır durumunda ise 3 M KAC ile dolu olduğunda (potasyum asetat) bizim elektrot direnci 10 MOhms yaklaşık genellikle. </li><li> Bir şırınga ve bir iğne kullanılarak Mikrofil 3 M KAc/30 mM KCI ihtiva eden bir çözelti ile elektrot arasında bir set doldurun. Bu elektrotlar elektrofizyoloji için kullanılacaktır. </li><li> , Boya de elektrodun arka ucu ile daldırma kalsiyum gösterge boya ile elektrot ikinci bir set dolgu önceden yaklaşık ile sulandırılır. 500 ug boya için 40 ul distile su. Elektrodun ucunda dolu sonra, geri yaklaşık 1/4 inç doldurmakiyi elektriksel temas sağlamak için KCl 200 mM elektrotun sonu. </li><li> Bu boya enjeksiyonu kolaylaştırır ve çoklu membran girmeler tarafından yapılan hasar azaltır gibi, konik elektrotlar için faydalıdır. Biz bir tuzlu su / alümina toz süspansiyonu bir akım üretir özel beveler kullanın. Elektrot tutucu monte ve ucunun 45 ° açıyla akışı girer. Direnci KAC dolu elektrotlar için yaklaşık 5 MOhm ulaştığında Elektrod direnci sürekli olarak izlenmekte ve bizote sonlandırılır. Boya dolu elektrotlar bir zaman eşit miktarda eğimli ve genellikle 15-20 MOhm arasında dirençleri vardır. </li></ol> 3. Kalsiyum Gösterge Boya yükleniyor <ol><li> Bir elektrofizyoloji teçhizat hazırlık yerleştirin ve görsel ilgi presinaptik nöron bulun. Bizim deneylerin çoğu beslenme, B21 5, 6 sırasında yararlanılan belirlenen duyusal nöron ile yapılır. Nispeten sabit position, boyut (~ 100 mikron) ve B21 en soma uzatılmış şekli bulmak için kolaylaştırır. </li><li> Kalsiyum gösterge boyası içeren bir elektrot ile ilgi nöron kazığa oturtmak. B21 kimlik post-sinaptik nöron B8 impaling ile kontrol edilebilir. ~ 8 nA akımı ile B21 arasında depolarizasyon sivri ve B8 7 PSP kolaylaştırmada sonucu tetikleyecektir. </li><li> Yaklaşık olarak 30 dakika için hiperpolarize darbeleri (tipik olarak, -15 nA, 1 Hz,% 75 görev döngüsü) geçme ile, ilgilenilen presinaptik nöronların içinde boya enjekte edilir. Boya yükleme başarılı olursa, nöronun soma soluk pembe renk kazanacaklardır. Yavaş nöron onu çekerek boya içeren elektrot çıkarın. </li><li> Boya takipçisi nöronlar ile sinaptik temas ince süreçlere yayılması için yaklaşık 30 dakika hazırlıkları bırakın. </li></ol> 4. Kalsiyum Görüntüleme ve elektrofizyolojik Kaydı <ol><li> Görüntüleme Microsc üzerinde hazırlık yerleştirinope. Hazırlık ile çanak kil aksine, ıslakken yapışkan kalır Permagum sızdırmazlık kord parçaları ile bir soğutma platformu üzerinde tutulur. Sabit mikroskobu objektif hareket ettirerek odaklanır. Sahne mıknatıs monte manipülatörler bağlama izin veren, sabit kalır. Yüksek büyütme titreşimleri (özellikle yanal hareket) bir sorun yapar gibi, tüm görüntüleme kurulumu bir titreşim izolasyonu platform üzerine konulmalıdır. </li><li> Normal elektrolit solüsyonu içeren elektrotlar ile presinaptik ve postsinaptik nöronlarda kazığa oturtmak. </li><li> Görüntü Kalsiyum Turuncu uygun bir filtre bloğu (eksitasyon 549 nm, emisyon 576 nm) 8 seçin ve kamerayı ayarlayın. Çoğu bilimsel CCD kameralar araştırıcı dışarı okunan CCD hücrelerinin bir alt kümesi seçmek için izin. Ek olarak, hücreler (binned) kombine edilebilir. Ederken binning duyarlılığı artırır, daha küçük bir alt kümesini artar hız seçme. Bu iki ayar birlikte pozlama süresi ile belirlemekKare hızı saniyede elde edilebilir kaç resim yani. Uygun ayarları olacak görüntüyü 500 x 300 piksel (10x lens ve 0.5x kamera adaptörü kullanarak) ile 580 x 350 mikron 2 bir alan. Bir maruziyet süresi &lt;25 ms ile doğru pozlama sağlar az miktarda aydınlatma yoğunluğunu ayarlamak için ışık yolu ile nötral yoğunluk filtreleri ekleyin. Bu ayarlar yaklaşık 30 Hz kare hızı yol açmalıdır - Aplysia&#39;nın kalsiyum değişiklikler uyarılmış görüntüyü tek başak için yeterince hızlı olan. Son olarak, sadece görüntülü alan aydınlatılır, böylece alan açıklık bulunur. </li><li> Görüntüleme yazılımı olarak ölçmek istediğiniz nöronun bölgeleri işaretlemek. Elements AR yazılımı bu ilgi alanları (ROI) yerleştirilerek &quot;Zaman Ölçümü&quot; bölümünde yapılır. B21 Bir bipolar nöron ve daha önceki çalışmaları ilgi 9 onun lateral çıkıntısı kişileri postsinaptik nöron göstermiştir. Biz genellikle görüntü birincil, ikincil ve üçüncül sutyennöron her bir parçası üzerinde bir ROI yerleştirerek yanal işlemi nches. Boya dolu nöron için yanındaki bir başka ROI daha sonra, diğer tüm veri noktaları çıkartılır bir arka plan değeri sağlamak için ölçülür. </li><li> Kameranın &quot;çerçeve okuma&quot; sinyali tarafından sağlanan bir tetikleme sinyali beklemek elektrofizyoloji iktisabı (bu deneylerde Spike II) söyleyin. Görüntü elde etme (Elements AR) başlatın; kameranın ilk karesini alır zaman Spike II şimdi otomatik olarak kayda başlayacaktır. Ayrıca kısaca mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED yanar 1401 Güç bir TTL çıkışını kullanabilirsiniz. Bu sonradan görüntüleme ve elektrofizyolojik verileri senkronize etmek için bir sinyal verecektir. </li><li> Istenilen frekansta kısa depolarize akım darbeleri arasında bir dizi enjekte presinaptik nöronların teşvik. Bu bir aksiyon potansiyeli successf olup olmadığını belirlemek için (bir uyarıcı tetiklenen osiloskop gibi) her bir darbe izlemek için önemlidirUlly oluşturulur. Kalsiyum Turuncu diğer boyalara göre çok foto stabil iken, meydana beyazlatma boya ne kadar kontrol etmek uyarımı olmaksızın bir kontrol deneme kaydetmek iyi bir fikirdir. </li><li> Hücre içi kalsiyum konsantrasyonları manipüle edildiği denemelerde, EGTA gibi bir ilaç presinaptik sinir hücresi içine uygulanır ve yukarıda tarif edilen uyar ve veri toplama işlemler tekrarlanır. </li></ol> 5. Örnek Veri Analizi <ol><li> Bir metin dosyasına yazarak görüntüleme verileri (her bir ROI için ölçülen yoğunluk değerleri listesi) aktarın. Spike II özel bir komut dosyası daha sonra metin dosyasını içe aktarabilirsiniz. Bu program, bireysel sondanın alanı değerlerini normalleştirir ve arka plan prob değerini çıkarır. Veri noktaları daha sonra bir &quot;sanal RealWave&quot; kanal olarak elektrofizyoloji verilerle birlikte çizilir. Spike II &quot;kanal prosesi / zaman kaydırma fonksiyonu&quot; hassas görüntüleme verileri poi hizalamak için kullanılırreferans olarak LED sinyal kullanarak NTS,. </li><li> Yüzde değişim gibi değerleri elde etmek için, dF olarak floresans içinde göreceli değişiklik hesaplayarak görüntüleme verileri analiz / F o = (FF o) / F o. F o sadece uyaran sırasında uyarıcı ve F floresans önce floresans seviyesini gösterir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Deney Genel düzeni. Deneyler Aplysia bir ganglion hazırlık yapılır. Hücre içi kalsiyum değişim iontophoretically presinaptik nöronların sokulur bir floresan boya olan görüntülü. Bu sinaptik iletim indüklenen ve izlenebilir böylece Pre-ve postsinaptik nöronlarda sonra keskin elektrotlar ile Impaled edilir. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> <strong&gt; Şekil 2. Kalsiyum görüntüleme ve Aplysia&#39;nın ve bukkal ganglion tespit nöronların hücre içi kayıt. Nöron B21 ve görüntülü yan dal (A) Foto. Kutu ilgi ölçülen bölgesi gösterir. B21 ve (B1) Hücre içi stimülasyon aynı zamanda aksiyon potansiyelleri ateşe neden postsinaptik takipçisi nöron B8 (orta iz) aksiyon potansiyelleri (altta iz) ve kolaylaştırıcı postsinaptik potansiyelleri (PSP) çağrıştırıyor. Presinaptik kalsiyum floresan artışlar üst iz gösterilmiştir. Homosynaptic kolaylaştırma presinaptik EGTA arasında (B2) Etkisi. EGTA intraselüler olarak ~ 15 dakika daha önce hücre içi uyarım B21 içine enjekte edildi. Bu EGTA düşük konsantrasyonlarda sinaptik iletim bastırmak için yeterince hızlı değil yavaş hareket eden kalsiyum şelasyon olduğu düşünülmektedir. Yaygın kalsiyum sinyal ve PSP genlik karşılık gelen azalma azalma not edin. (C) PSP genlik presinaptik calciu ile ilişkilidirm sinyal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%22">The Handbook</a>. , 10th edition, Invitrogen. (2005).</li>
<li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+JH+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu aynı anda hücre için kalsiyum konsantrasyonunun izlemek ve sinaptik etkinliğinin değerlendirilmesi için de kullanılabilir yöntemleri göstermektedir. Bu teknikler, kısa süreli plastiklik çeşitli şekillerde nasıl yönlendirildiğini belirlenmesi bakımından yararlıdır. Görüntüleme floresan mikroskop ve CCD kamera ile yürütülmektedir. En fonksiyonel görüntüleme set-up ile karşılaştırıldığında bu ekipman gereksinimleri nispeten mütevazı. Tekniği basit ve öğrenmesi kolay. CCD kamera ile görüntüle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlamak </td></tr><tr><td> Kalsiyum Turuncu </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum kalibrasyon tampon kiti </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> sinyalinin duyarlılık ve dinamik aralığı test etmek için yararlı </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür hekzahidrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> hayvan anestetize 0.33 M solüsyon olarak kullanılmaktadır </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlamak </td></tr><tr><td> FN-1 dik floresan mikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> Narishige ile ITS-FN1 aşamasında </td></tr><tr><td> NMN-21 manipülatörler </td><td> Narishige </td><td> mıknatıslar ile sahne üzerine monte </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD kamera </td><td> Fotometrik </td><td></td></tr><tr><td> NIS elemanları AR (Sürüm 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> görüntüleme yazılımı floresans verileri toplamak için kullanılan </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Planı Fluor hedefi </td><td> Nikon Instruments </td><td> Bu suya daldırma objektifi 3,5 mm çok uzun bir çalışma mesafesi vardır </td></tr><tr><td> 120 PC metal halide lamba X-Cite </td><td> EXFO </td><td> floresan görüntüleme için kullanılır </td></tr><tr><td> LS-DWL halojen lâmba </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-Cy3 filtre seti </td><td> Chroma Teknoloji </td><td>; </td></tr><tr><td> Güç 1401 A / D dönüştürücü </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td> örnekleme 3 kHz&#39;de yapıldı </td></tr><tr><td> Spike II (Sürüm 7.07) </td><td> Cambridge Elektronik Tasarım </td><td> Yazılım elektrofizyoloji verileri toplamak için kullanılan </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplifikatör </td><td> NPI elektroniği </td><td> 10X bir headstage ile ikinci </td></tr><tr><td> Model 410 amplifikatör </td><td> Brownlee hassas </td><td> sinyali yükseltmek ve filtrelemek için kullanılır </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> eksi k Teknolojisi </td><td> görüntüleme için titreşim izolasyonu </td></tr><tr><td> soğutma platformu </td><td> ısmarlama </td><td> pirinç levha hangi aracılığıyla buz su bir değişken hızında pompalanan </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Kullanılan ekipman.

mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve synaptic etkinliği İzlenmesi değişiklikler<em&gt; aplysia&#39;nın</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Bu, hücre içi kalsiyumda değişiklikler sinaptik plastisite (örn., homosynaptic kolaylaştırma 1) arasında önemli formları bir dizi indüksiyon aracılık öne sürülmüştür. Bu hipotezler eşzamanlı intraselüler kalsiyum değişiklikleri ve sinaptik etkinliği değişiklikler izlenerek test edilebilir. Bu hücre içi kayıt tekniği ile kalsiyum görüntüleme birleştirerek gerçekleştirilebilir gösterilmektedir. Bizim deneyler yumuşakça Aplysia&#39;nın californica bir bukkal ganglion yapılmaktadır. Bu hazırlık deneysel avantajlı bir dizi özellik vardır: Gangliyon kolayca Aplysia&#39;nın kaldırılır ve deneyler, normal sinaptik bağlantıları yapmak ve normal bir iyon kanal dağıtım olan yetişkin nöron kullanmak olabilir. Aplysia için doğal hayvan düşük metabolik oranı ve nispeten düşük sıcaklıklarda (14-16 ° C) bağlı olarak, müstahzarlar uzun süreler boyunca stabildir. Bu uzun dalga boyu floresan boya kalsiyum bağlandığı zaman biz kolayca iyontoforez yoluyla nöron içine &#39;yüklü&#39; olduğunu Kalsiyum Turuncu 2 hücre geçirgenliği olmayan sürümünü kullanacaktır intrasellüler serbest kalsiyum değişiklikleri. saptamak için ent &quot;&gt;, floresan yoğunluğu artar. Kalsiyum Turuncu var hızlı kinetik özellikleri 3 ve rasyometrik boyalar aksine (örneğin, Fura 2), görüntüleme için herhangi bir filtre tekerleği gerektirir. Kararlı ve diğer boyalar (örneğin, flüoresan 3) 2,4 daha az fototoksik oldukça fotoğrafı. olmayan tüm rasyometrik gibi Bu yükleme ve difüzyon nedeniyle boya konsantrasyon değişiklikleri hesaba katmak için mümkün değildir, çünkü boyalar, kalsiyum Orange, kalsiyum konsantrasyonu olarak göreceli değişiklikleri gösterir. Ancak, bu mutlak bir kalsiyum konsantrasyonu sağlayacak şekilde kalibre edilebilir değildir. Bir dik, sabit sahne, bileşik mikroskop saniyede 30 kare etrafında kayıt yapabilen bir CCD kamera ile görüntü nöronlar için kullanılmıştır. Aplysia&#39;nın Bu zamansal çözünürlükteHücre içi kalsiyum konsantrasyonunda dahi, tek bir sivri uç oluşturulan değişiklik tespit etmek için yeterli olacaktır. Keskin elektrotlar aynı anda tespit pre-ve postsinaptik nöronların sinaptik indüklemek ve kaydetmek için kullanılır. Her denemenin sonunda, özel bir komut dosyası elektrofizyoloji ve görüntüleme verileri birleştirir. Doğru senkronizasyon sağlamak için biz mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED bir ışık nabız kullanın. Presinaptik kalsiyum düzeyleri (intrasellüler EGTA enjeksiyon yoluyla örneğin) Manipülasyonu bize plastisite çeşitli şekillerde arabuluculuk intraselüler kalsiyum rolüne ilişkin spesifik hipotezleri test etmeye imkan vermektedir.

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini göstermektedir<em&gt; Aplysia&#39;nın</em&gt;. Biz görüntü intraselüler kalsiyum floresan boya, Kalsiyum Turuncu ve keskin (hücre içi) elektrotlar ile sinaptik iletim teşvik ve izlemek kullanarak.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Hücre içi kalsiyumdaki değişimlerin, bir dizi önemli sinaptik plastisite formunun (örneğin, ...

Hücre içi kalsiyumun, sinaptik plastisitenin çeşitli mekanizmalarının önemli bir parçası olduğu öne sürülmüştür. Bu fikirler, kalsiyumdaki değişimler ve sinaptik etkinlikteki farklılaşmalar eş zamanlı olarak izlenerek test edilebilir. Burada, kalsiyum görüntülemenin hücre içi kayıt ile birleştirilmesiyle bunun nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz.Deneylerimiz, mollusk türü Aplysia Cahora'nın bir ganglionu ile yürütülmektedir. Bu preparat; büyük tanımlanmış nöronlar, apia için doğal olan düşük sıcaklıklar, görüntülemeyi kolaylaştıran yavaş sinyaller gibi bir dizi avantaja sahiptir; ancak gösterdiğimiz genel teknikler diğer sistemlere kolaylıkla aktarılabilir. Merhaba, ben New York City'deki Mount Sinai Tıp Fakültesi'nde, Fishburg Nörobilim Bölümü ve Freedman Beyin Enstitüsü'nde, Elizabeth Cropper'ın laboratuvarından Colin Evans.Bugün, mollusk *Aplysia cahora*'nın bukkal ganglionunda hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişimlerin ve sinaptik etkinliğin eş zamanlı görüntülemesini göstereceğiz. Hücre içi kalsiyumu tespit etmek için, presinaptik bir nörona hücre IMP geçirgen kalsiyum indikatör boyası olan calcium orange enjekte edeceğiz. Ardından preparat mikroskobun altına alınacak ve pre ve postsinaptik nöronlara keskin elektrotlar yerleştirilecektir.Tekrarlanan presinaptik stimülasyon, artan postsinaptik potansiyel veya PSP amplitüdü olarak gözlemlenen güçlendirilmiş bir postsinaptik yanıtla sonuçlanır. Kalsiyum indikatör boyasının floresan sinyalini ölçmek, presinaptik hücre içi kalsiyumdaki eş zamanlı değişimleri tespit etmemizi sağlayacaktır. Başlamak için, yaklaşık 150 gram ağırlığındaki yetişkin bir hayvana 75 ml izotonik magnezyum klorür solüsyonu enjekte ederek anestezi uygulayın, anestezi altındaki hayvanı balmumu kaplı bir kaba iğneleyin, ardından kaba forseps ve makas kullanarak hayvanın ayağına bir insizyon yapın ve bukkal kütleyi açığa çıkarın.Bukkal ganglion, bukkal kitlenin ventral tarafında yer alır ve birbirine bağlı iki hemi gangliondan oluşur. Hayvanın beslenme davranışının oluşturulmasına ve kontrolüne diğer ganglйонlardaki nöronlarla birlikte katkıda bulunan birkaç yüz nöron içerir. Tüm bukkal sinirleri ince bir makasla keserek ganglionu dikkatlice serbest bırakın ve hayvandan çıkarın.Ardından, serbest kalan ganglionu yapay deniz suyu ile doldurulmuş sil guard kaplı bir kabın tabanına iğneleyin. Ganglion, bireysel nöronları açığa çıkarmak için uzaklaştırılması gereken bir bağ dokusu kılıfı ile sarılıdır. Bu kılıfı kesip çıkarmak için ince uçlu pens, iris makası kullanın ve son derece dikkatli olun.Nöronların zarar görmesini önlemek için, görüntüleme sırasında herhangi bir hareket sorun yaratacağından, kılıfsız gangliyonu yaklaşık 15 dakikalık pinlerle sabitleyin. Hücre içi kayıt ve boya enjeksiyonu için keskin elektrotlar hazırlamak amacıyla, bir mikro elektrot çekici ile kapiler tüpleri çekin. Dış çapı bir milimetre olan ince duvarlı filament borosilikat cam kullanıyoruz.Kayıt elektrotları, üç molar potasyum asetat ile doldurulduğunda yaklaşık 10 mega dirençte olmalıdır; bu nedenle D elektrotlarını doldurmak için puller cihazını buna göre ayarlarız. Çekilmiş elektrodun arka kısmını 10 milimolar kalsiyum oranj boya çözeltisine daldırın; elektrodun içindeki cam filament boyunca gerçekleşen kılcal hareket, boyayı uca çekecektir, ardından iyi bir elektriksel temas sağlamak için elektrodu 200 milimolar potasyum klorür ile geri doldurun. Elektrot özelliklerini iyileştirmek ve kayıt elektrodu direncini yaklaşık beş megaya düşürmek için özel yapım bir Bela kullanıyoruz.Elektrot, bir alüminyum oksit süspansiyon akımı içerisine 45 derecelik bir açıyla tutulur. Süspansiyona sodyum klorür karıştırılması ve bir ohmmetre bağlanması, elektrot direncinin izlenmesini sağlar. Pah kırma işlemi sırasında, üzeri örtülmüş buckle ganglionlarını içeren kabı bir elektrofizyoloji düzeneğine aktarırız ve ilgilenilen nöronları, elektrotlarla onları delerek ve kimliklerini doğrulayarak tespit ederiz.Nöronları kalsiyum görüntüleme için hazırlamak amacıyla, öncelikle hücre somasına boya dolu bir elektrot yerleştiririz ve 30 dakika boyunca hiperpolarize edici, 15 nano amp akım darbeleriyle boyayı elektrofizyolojik olarak yükleriz. D calcium orange hücreye girdikçe, SOR hafif pembe bir renk alacaktır. Ardından kayıt elektrotlarını dikkatlice geri çekeriz ve boyanın nöronun ince uzantılarına difüze olmasını sağlamak için preparatı en az 30 dakika bekletiriz.Ardından, hazırlığın bulunduğu kabı bir floresan mikroskoba aktarın. Sabit tablalı dik bir mikroskop üzerinde 10x NA 0,3 su daldırma lensi kullanıyoruz; bu mikroskop, tabloyu değil lensi hareket ettirerek odaklama yapar. Bu özellik, manipülatörlerin kurulumunu kolaylaştırır.Kayıt elektrotları için uygun bir filtre bloğu seçin. Bir SI üçlü filtre bloğu, kalsiyum oranj için doğru eksitasyon ve emisyon filtrelerini sağlayacaktır; kamera parametrelerini ve aydınlatma yoğunluğunu nötr yoğunluk filtreleri ve alan diyaframı ile ayarlayın. Daha fazla ışık daha az gürültü ile sonuçlanacaktır, ancak preparasyonun ağartılmasına (bleaching) neden olabilir.Cool snap CCD kamera, saniyede yaklaşık 30 kare hızında 500'e 300 piksellik bir alanı ve iyi bir sinyal-gürültü oranı yakalayabilir. Işık kaynaklarının panjurlarını mümkün olduğunca kapalı tutarak fil nöronlarının aydınlatmasını en aza indirin. Görüntüleme yazılımında, ilgilenilen bölgeleri (ROI'leri) seçin.Bu bölgeler, yazılımın yoğunluk ölçümlerini nereden yapacağını belirler. Genellikle presinaptik nöronun primer, sekonder ve tersiyer dallarını görüntüleriz. Daha sonra tüm diğer veri noktalarından çıkarılacak bir arka plan değeri elde etmek için difi nöronun yanına ek bir ROI yerleştirin.Sinaptik iletimi indüklemek ve izlemek için pre- ve post-sinaptik nöronlarda hücre içi kayıt elektrotları kullanılır. Veri toplama yazılımını başlatmak için kameranın frame out tetikleyici sinyalini kullanırsanız, elektrofizyolojik ve görüntüleme veri toplama işlemleri arasında senkronizasyon sağlayabilirsiniz. Senkronizasyonu sağlamanın bir başka yolu ise kamera portunun içine bir LED yerleştirmektir.Bu LED, kayıt oturumunun başında kısa süreliğine yakılarak bir senkronizasyon işareti sağlar. Tipik bir deney sırasında, kısa akım darbeleri enjekte ederek presinaptik nöronda aksiyon potansiyellerini tetiklersiniz. Bu örnekte, belirli hipotezleri test etmek için bir spike serisi ve buna karşılık gelen kalsiyum sinyalindeki artışları gösteriyoruz.Kalsiyum sinyali manipüle edilebilir ve sinaptik iletim üzerindeki etkileri belirlenebilir. Örneğin, kalsiyum şelatörü EGTA gibi ilaçlar presinaptik olarak enjekte edilebilir veya perfüzyon sistemi aracılığıyla uygulanabilir. Veriler, görüntüleme yazılımından bir metin dosyasına ve ardından bizim durumumuzda Cambridge Electronic Design tarafından geliştirilen spike two olan, elektrofizyolojik verileri toplamak için kullanılan yazılıma aktarılarak analiz edilir.ROI yoğunluk değerlerini ve buna karşılık gelen membran potansiyeli değişimlerini çizdirmek için özel olarak yazılmış bir betik kullanıyoruz; arka plan ROI'sinden elde edilen arka plan sinyalini çıkararak ve gösterilen denklemle bağıl değişimi hesaplayarak kalsiyum sinyalindeki değişimleri nicelendiriyoruz. F sıfır uyarılmadan hemen önceki floresansa, F ise uyarılma sırasındaki floresansa karşılık gelir. Burada, tanımlanan neuron B 21'deki kalsiyum floresansı değişimlerini görüntülediğimiz bir deneyin sonuçlarını gösteriyoruz.Görüntülediğimiz bölge A'da belirtilmiştir; B1'de B21'de bir spike patlaması indükledik, bu da B8'de postsinaptik potansiyellere ve kalsiyum sinyalinde bir değişikliğe yol açtı. B2, kalsiyum şelatörü EGTA enjeksiyonunun etkisini göstermektedir; B21'deki spike'lar artık yaygın kalsiyum floresans artışlarını indüklememekte ve postsinaptik potansiyel genliği azalmaktadır.Sonuç olarak, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun eş zamanlı olarak izlenmesi ve sinaptik iletim etkinliğinin değerlendirilmesi için kullanılabilecek teknikleri göstermiş olduk. Bu teknikler, çoğu fonksiyonel görüntüleme yöntemine kıyasla yalnızca mütevazı ekipmanlar gerektirmekte olup öğrenilmesi kolay ve hızlıdır.

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Deneyleri, kas yapısı, sinaptik tepkiler, iyon gradyanlar ve membran potansiyelleri üzerine geçirgenlik etkilerini inceleyerek deneyim kazanmak için öğrenciler için kolay bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca, duyu-MSS-motor-kas devre nöronal devre bileşiklerin etkilerini test etmek için bir araç göstermek için sunulmuştur.

Membran Potansiyelleri, Synaptic Yanıtları, Sinir Devresi, Nöromodülasyon ve Kerevit kullanarak kas Histoloji: Öğrenci Laboratuvarı Egzersizler

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu...

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Keşfedin Aplysia gangliyonunda kalsiyum görüntüleme ve intraselüler kayıt kullanarak sinaptik etkinlik ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu eş zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik sinaptik plastisite araştırmaları için değerlidir.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler

Daha fazla video keşfet