Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler Aplysia'nın

Hücre içi kalsiyum, sinaptik plastisitenin çeşitli mekanizmalarının önemli bir parçası olarak ima edilmiştir. Bu fikirler, kalsiyumdaki değişiklikleri ve sinaptik etkinlikteki değişiklikleri aynı anda izleyerek test edilebilir. Burada, kalsiyum görüntülemeyi hücre içi kayıtla birleştirerek bunun nasıl başarıldığını gösteriyoruz.

Deneylerimiz yumuşakça Aplysia Cahora'nın bir ganglionu ile gerçekleştirilmiştir. Bu hazırlığın, tanımlanmış büyük nöronlar, apia için doğal olan düşük sıcaklıklar, sinyalleri yavaşlatması ve görüntülemeyi kolaylaştırması gibi bir takım avantajları vardır, ancak gösterdiğimiz genel teknikler diğer sistemlere kolayca aktarılır. Merhaba, ben Colin Evans, Fishburg Sinirbilim Bölümü'ndeki Elizabeth Cropper'ın laboratuvarında ve New York'taki Mount Sinai Tıp Okulu'ndaki Freedman Beyin Enstitüsü'nde.

Bugün, yumuşakça Aplysia cahora'nın bukkal ganglionunda hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinlikteki değişikliklerin eş zamanlı görüntülemesini göstereceğiz. Hücre içi kalsiyumu tespit etmek için, hücre IMP permean kalsiyum indikatör boyası kalsiyum turuncu ile pre-sinaptik bir nöron enjekte edeceğiz. Preparat daha sonra mikroskop altında hareket ettirilir ve postsinaptik öncesi ve sonrası nöronlar keskin elektrotlarla saplanır.

Tekrarlanan presinaptik stimülasyon, artan postsinaptik potansiyel veya PSP amplitüdü olarak görülebilen gelişmiş bir postsinaptik yanıt ile sonuçlanır. Kalsiyum indikatör boyasının floresan sinyalinin ölçülmesi, presinaptik hücre içi kalsiyumdaki eşzamanlı değişiklikleri tespit etmemizi sağlayacaktır. Yaklaşık 150 gram ağırlığındaki yetişkin bir hayvanı 75 mil izotonik magnezyum klorür çözeltisi enjekte ederek uyuşturmaya başlamak için, anestezi uygulanmış hayvanı balmumu kaplı bir tabağa sabitleyin, ardından brüt forseps ve makas kullanarak hayvanın ayağında bir kesi yapın ve bukkal kütleyi açığa çıkarın.

Bukkal ganglion, bukkal kitlenin ventral tarafında yer alır ve birbirine bağlı iki hemi gangliyondan oluşur. Diğer gangliyonlardaki nöronlarla birlikte hayvanın beslenme davranışının oluşumuna ve kontrolüne katkıda bulunan birkaç yüz nöron içerir. Tüm tokalı sinirleri ince bir makasla keserek ganglionu dikkatlice serbest bırakın ve hayvandan çıkarın.

Daha sonra serbest kalan gangliyonu yapay deniz suyuyla doldurulmuş sil koruyucu kaplı bir tabağın tabanına sabitleyin. Ganglion, tek tek nöronları açığa çıkarmak için çıkarılması gereken bir bağ dokusu kılıfına sarılır. Bu kılıfı kesmek için doğrulama forsepsleri, iris makası ve çok dikkatli kullanın.

Nöronlara zarar vermekten kaçınmak için, görüntüleme sırasında herhangi bir hareket sorunlu olacağından, de kılıf ganglionunu yaklaşık 15 dakikalık pimlerle stabilize edin. Hücre içi kayıt ve boya enjeksiyonu için keskin elektrotlar hazırlamak için, kılcal boruyu bir mikro elektrot çektirme ile çekin. Dış çapı bir milimetre olan ince cidarlı filament boa silikat cam kullanıyoruz.

Kayıt elektrotları, üç molar potasyum asetat ile doldurulduğunda yaklaşık 10 mega'lık bir dirence sahip olmalıdır ve bu nedenle D elektrotlarını doldurmak için çektirmeyi buna göre ayarlıyoruz. Çekilen elektrotun arkasını, elektrotun içindeki cam filaman boyunca kalsiyum turuncu boya kılcal hareketinin 10 milimolar çözeltisine batırın, boyayı uca çekecek, daha sonra iyi bir elektrik teması sağlamak için elektrodu 200 milimolar potasyum klorür ile doldurun. Elektrot özelliklerini iyileştirmek ve kayıt elektrot direncini yaklaşık beş megaya düşürmek için özel olarak üretilmiş bir Bela kullanıyoruz.

Elektrot, bir alüminyum oksit süspansiyon akışına 45 derecelik bir açıyla tutulur. Sodyum klorürün süspansiyona karıştırılması ve bir ome metrenin bağlanması, elektrot direncinin izlenmesini sağlar. Kaynak ağzı açma işlemi sırasında, aldatılmış toka gangliyonlarını içeren çanağı bir elektrofizyoloji teçhizatına aktarıyoruz ve ilgilenilen nöronları elektrotlarla kazığa oturtarak ve kimliklerini doğrulayarak buluyoruz.

Nöronu kalsiyum görüntülemeye hazırlamak için önce hücre somasına içi boya dolu bir elektrot yerleştiriyoruz ve boya elektrosunu teorik olarak 30 dakikalık hiperpolarize edici, 15 nano amper akım darbesi ile yüklüyoruz. D kalsiyum turuncusu hücreye girdiğinde, SOR soluk pembe bir renk alacaktır. Daha sonra kayıt elektrotlarını dikkatlice geri çekiyoruz ve boyanın nöronun ince işlemlerine yayılmasına izin vermek için hazırlığı en az 30 dakika bekletiyoruz.

Daha sonra, preparatla birlikte çanağı bir floresan mikroskoba aktarın. Sahneyi değil lensi hareket ettirerek odaklanan dik sabit kademeli bir mikroskopta 10 kez NA 0.3 suya daldırma lensi kullanıyoruz. Bu, manipülatörlerin montajını kolaylaştırır.

Kayıt elektrotları için uygun bir filtre bloğu seçin. Bir SI üç filtre bloğu, kalsiyum turuncu için doğru uyarma ve emisyon filtrelerini sağlayacak, nötr yoğunluk filtreleri ve alan açıklığı ile kamera parametrelerini ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayacaktır. Daha fazla ışık daha az gürültüye neden olur, ancak potansiyel olarak hazırlığı ağartabilir.

Havalı snap CCD kamera, saniyede yaklaşık 30 kare hızında 500 x 300 piksellik bir alan ve iyi bir sinyal-gürültü oranı yakalayabilir. Işık kaynaklarının deklanşörünü mümkün olduğunca kapalı tutarak fil nöronlarının aydınlatmasını en aza indirin. Görüntüleme yazılımında, ilgilenilen bölgeleri veya R ois'i seçin.

Bu bölgeler, yazılımın yoğunluk ölçümlerini nerede yapacağını tanımlar. Genellikle presinaptik nöronun birincil, ikincil ve üçüncül dallarını görüntüleriz. Daha sonra diğer tüm veri noktalarından çıkarılan bir arka plan değeri elde etmek için difi nöronun yanına ek bir ROI yerleştirin.

Sinaptik öncesi ve sonrası nöronlardaki hücre içi kayıt elektrotları, sinaptik iletimi indüklemek ve izlemek için kullanılır. Veri toplama yazılımını başlatmak için kameranın kare çıkışı tetikleme sinyalini kullanırsanız, elektrofizyolojik ve görüntüleme verilerinin toplanması arasında senkronizasyon sağlayabilirsiniz. Senkronizasyonu sağlamanın başka bir yolu da kamera bağlantı noktasının içine bir LED monte etmektir.

Bu LED, kayıt oturumunun başında kısa bir süre yanar ve böylece bir senkronizasyon işareti sağlar. Tipik bir deney sırasında, kısa akım darbelerinin enjeksiyonu ile presinaptik nörondaki aksiyon potansiyellerini tetiklersiniz. Bu örnekte, belirli hipotezleri test etmek için kalsiyum sinyalinde bir ani yükselme patlaması ve buna karşılık gelen artışlar gösteriyoruz.

Kalsiyum sinyali manipüle edilebilir ve sinaptik iletim üzerindeki etkiler belirlenebilir. Örneğin, kalsiyum şelatörü EGTA gibi ilaçlar presinaptik olarak enjekte edilebilir veya perfüzyon sistemi yoluyla uygulanabilir. Veriler, görüntüleme yazılımından bir metin dosyasına ve daha sonra elektrofizyolojik verileri elde etmek için kullanılan yazılıma aktarılarak analiz edilir, bu da bizim durumumuzda Cambridge Electronic Design tarafından ikinci başaktır.

ROI yoğunluk değerlerini ve membran potansiyelindeki karşılık gelen değişiklikleri çizmek için özel bir yazılı komut dosyası kullanıyoruz, arka plan ROI'sinden elde edilen arka plan sinyalini çıkararak ve gösterilen denklemle nispi değişikliği hesaplayarak kalsiyum sinyalindeki değişiklikleri ölçüyoruz. F sıfır, stimülasyondan hemen önceki floresandır ve F, stimülasyon sırasındaki floresandır. Burada, tanımlanan nöron B 21'deki kalsiyum floresansındaki değişiklikleri görüntülediğimiz bir deneyin sonuçlarını gösteriyoruz.

Görüntülediğimiz bölge A'da belirtilmiştir, B birde, B 21'de bir ani yükselme patlamasına neden olduk, bu da B sekizde postsinaptik potansiyellere ve kalsiyum sinyalinde bir değişikliğe neden oldu. B iki, kalsiyum şelatörünün enjeksiyonunun etkisini gösterir. B 21'deki EGTA sivri uçları artık kalsiyum floresansında yaygın artışlara neden olmaz ve post sinaptik potansiyel genliği azalır.

Sonuç olarak, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu eş zamanlı olarak izlemek ve sinaptik iletimin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek teknikler gösterdik. Bu teknikler, çoğu işlevsel görüntülemeye kıyasla yalnızca mütevazı ekipman gerektirir ve öğrenmesi kolay ve hızlıdır.