Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü
July 16th, 2021
Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.
Bu yöntemler, deneysel bir manipülasyonun, hastalığa neden olan proteinin veya RNA'nın sinaptik süreçleri etkileyip etkilemeyeceği ve terapötik bileşiklerin işlevi geri kazanıp kazanamayacağı konusunda hızlı bir değerlendirme sağlar. Bu teknikler, elektrofizyolojiye kıyasla nispeten kısa bir süre içinde bir grup nörondan sinaptik fonksiyonun güvenilir bir şekilde okunmasını sağlar. Bu protokol, nöronal gelişim veya dejenerasyonun herhangi bir hastalığına uygulanabilir.
Bu, birincil kemirgen nöronal kültürleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen nöronlar için iyi çalışır. Başlamak için, konfokal görüntüleme alma yazılımını kullanarak görüntü alma ayarlarını optimize edin. Tüm numunelerde uyarma gücüne maruz kalma süresini, dedektör kazancını ve kare hızını sabit tutun.
Hızlandırılmış görüntüleme için, boya ağartmayı en aza indirmek için 512 x 512 en boy oranını ve saniyede iki görüntü kare hızı seçin. Ardından, GCaMP altı M / GCaMP üçlü Fitzy ve Stearoyl boya Trixi ile floresan uyarım, dikroik ve emisyon filtresi kombinasyonlarını seçin. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında Z'nin sürüklenmesini önlemek için, konfokal görüntüleme edinme yazılımının mükemmel odak özelliğini kullanın.
Ardından, görüntü alma panelindeki zaman sekmesini seçin. Birinci aşama için, aralığı 500 milisaniye ve süreyi üç ila beş dakika olarak ayarlayın. İkinci aşama için, aralığı 500 milisaniye ve süreyi, beş dakikayı ayarlayın.
Daha sonra yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF için yerçekimi perfüzyon aparatını monte etmek için, yüksek potasyum klorür ACSF tamponunu aparatın üstündeki 50 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın. Ardından, nöronları içeren 35 mililitrelik bir cam tabağı, çanak kenarına yerleştirilmiş perfüzyon borusunun ucu ile konfokal görüntüleme aşamasına yükleyin ve görüntüleme alanını seçin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, birincil kortikal veya motor nöronları düşük potasyum klorür ACSF tamponunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra tamponu aspirasyonla ve bir pipet kullanarak çıkarın, karanlıktaki nöronları 50 milimolar potasyum klorür ve 10 Mikro molar stiril boya içeren ACSF ile doldurulmuş bir cam tabanlı Petri kabına yükleyin. Beş dakika sonra, yükleme çözeltisini çıkarın ve spesifik olmayan boya yüklemesini ortadan kaldırmak için nöronları 37 santigrat derecede düşük potasyum klorür ACSF tamponunda 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra çanağı ters çevrilmiş konfokal mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin ve hücreleri 20 kat hava hedefi veya 40 kat yağ daldırma hedefi altında gözlemleyin.
Çelik boyayı 546 nanometre lazer kullanarak uyarın ve 570 ila 620 nanometre bandpass filtresi kullanarak emisyon toplayın. Görüntüleme alanını seçtikten ve mükemmel odağı kullandıktan sonra, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, Trixi ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın. Ardından, satın alma yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın ve boya yoğunluğundaki değişiklikleri hariç tutmak için bazal kaydı üç ila beş dakika boyunca gerçekleştirin.
İkinci aşamaya geçişte, perfüzyon sistemi için açma düğmesini tetikleyin ve boya boşaltmayı kolaylaştırmak için nöronlara sürekli olarak 50 milimolar potasyum klorür perfüze edin. Kayıtları beş dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından perfüzyon sistemi için kapatma düğmesini tetikleyin. Denemeyi daha sonra konfokal yazılımı kullanarak veri analizi için kaydedin.
GCaMP altı M ile transfeksiyondan 48 saat sonra, birincil kemirgen kortikal nöronlarını 15 dakika boyunca düşük potasyum klorür ACSF ile inkübe edin. Ardından çanağı görüntüleme platformuna monte edin ve GCaMP altı M floresansını bir Fitzy filtresi ve 20 kez veya 40 kez objektif kullanarak görselleştirin. Görüntüleme alanını seçtikten ve mükemmel odağı kullandıktan sonra, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, Fitzy ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
Ardından, edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın ve bazal kaydı üç ila beş dakika boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi nöronlara 50 milimolar potasyum klorür içeren ACSF'yi perfüze edin ve beş dakika boyunca kaydedin. Görüntü alma işlemi durduğunda, deneyi kaydedin ve konfokal yazılımı kullanarak veri analizine devam edin.
Görüntü analizi için, zaman atlamalı görüntüleri konfokal yazılımda açın ve Görüntü'ye tıklayarak görüntüleri hizalayın, ardından işleme, ardından geçerli belgeyi hizalayın ve ardından İlk kareye hizala'yı seçin. ROI seçim aracını kullanarak nöritler boyunca ilgi çekici bölgeleri seçin ve ayrıca arka plan floresan yoğunluğunu temsil eden bir ROI'yi işaretleyin. Ardından, seçilen yatırım getirilerinin zaman içindeki ham floresansını ölçmek için zaman ölçüm panelinden ölçüm işlevini başlatın.
Ölçümden sonra ham floresan yoğunluklarını elektronik tablo yazılımına aktarın. Styryl boya ile yüklü kültürlü sıçan primer kortikal nöronları burada gösterilmiştir. Boya yüklemesinin özgüllüğü, sinaptik vezikül belirteci sinaptofizin ile birlikte etiketlenmesi ile belirlendi ve steril boya pozitif punktanın çoğunluğu bu belirteç için eş pozitiftir.
Tüm görüntüleme periyodu boyunca ham yoğunluk değerlerinin analizi, sinaptofizin ve yoğunluğun sabit kaldığını, stiril boya yoğunluğunun ise stimülasyonu takiben azaldığını ortaya koymaktadır. Yeşil floresan protein transfekte kontrol nöronları için, başarılı sinaptik vezikül salınımı, yüksek potasyum klorür depolarizasyonu üzerine boya floresansının çarpıcı kaybına neden oldu. Bu temsili video, bir nöronun stimülasyonu takiben yeni bir sağ bölgede stiril boyayı seçici olarak boşalttığını göstermektedir.
Buna karşılık, GA 50'ye boya peptidi tekrar yapısına bağlı bir C dokuz ORF 72 ile transfekte edilen nöronlarda, bozulmuş sinaptik iletim, yüksek potasyum klorür depolarizasyonundan sonra bile tutulan boya floresansı ile temsil edilir. Potasyum klorür depolarizasyonundan önce ve sonra GCaMP altı M ile transfekte edilen kortikal nöronların temsili floresan görüntüleri burada gösterilmiştir. GCaMP altı M ile transfekte edilen artmış floresan değerleri ve kortikal nöronlar, potasyum klorür indüklenmiş depolarizasyonu takiben nöritlere kalsiyum girişini gösterir.
Temel kayıt periyodunun sonunda, nöronlar GCaMP altı M'yi düşük floresan ile ifade etti. Daha sonra stimülasyonun başlangıcında dramatik bir floresan artışı gözlenir. Steril boya ve GCaMP için floresan taban çizgisi kayıtlarının kararlı olduğundan emin olun.
Görüntü kaymasını önlemek için her zaman mükemmel odağı kullanın, bu da görüntü sonrası veri işlemeyi zorlaştırır. Nöronların daha fazla kültürlenmesi önerilmez, çünkü yemekler bolluk sırasında havaya maruz kalır. Bununla birlikte, immün boyama veya protein veya RNA'nın ekstraksiyonu, sinaptik değişikliklerin potansiyel nedenlerini değerlendirebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, kültürlenmiş nöronlarda presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun gerçek zamanlı izlenmesine odaklanan sinaptik iletime ait alt hücresel olayları görselleştirmek için iki yöntemi tartışmaktadır. Sunulan protokoller, sinaptik süreçlerle ilgili deneysel manipülasyonları değerlendirmek ve potansiyel terapötik müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Sinaptik İletim
- Canlı Hücre Görüntüleme
Arka Plan
- Sinaptik süreçleri anlamak, nöronal gelişim ve dejenerasyon mekanizmalarını açıklamak için çok önemlidir.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, kalsiyum dinamiklerinin ve sinaptik vezikül salınımının izlenmesini sağlar.
- Teknikler, kemirgen birincil kültürleri ve iPSC'den türetilmiş nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli nöronal modeller için uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Sinaptik fonksiyonu izlemek ve deneysel veya terapötik bileşiklerin etkisini değerlendirmek için güvenilir yöntemler geliştirmek.
- Hastalıkla ilgili proteinlerin veya RNA'ların sinaptik iletime etkilerini araştırmak.
- Geleneksel elektrofizyolojik değerlendirmelere hızlı bir alternatif sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Konfokal mikroskopi kullanılarak uygulanan in vitro kültürlenmiş nöronlarda canlı hücre görüntüleme.
- Biyolojik modeller olarak primer kemirgen korteks nöronları ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş nöronlar kullanıldı.
- Veri toplama için 3-5 dakikalık aralıklarla faz tabanlı görüntüleme zaman dizileri içeriyordu.
- Boya yükleme ve görüntüleme ayarları için spesifik protokoller detaylandırılarak, görüntüleme kalitesinin ve veri güvenilirliğinin artırılması sağlandı.
Ana Sonuçlar
- Başarılı sinaptik vezikül salınımının görselleştirilmesi, kalsiyum dinamiklerinin sinaptik fonksiyonla ilişkili olduğunu gösterdi.
- Belirli deneysel koşullarda boya floresansının korunması, bozulmuş sinaptik iletimi gösterdi.
- Floresans yoğunluk ölçümleri, depolarizasyon öncesi ve sonrası sinaptik aktivite hakkında bilgi sağladı.
- Bulgular, yöntemlerin sinaptik işlev bozukluklarını anlama ve tedavi etme potansiyel terapötik uygulamasını desteklemektedir.
Sonuçlar
- Çalışma, sinaptik iletimde kritik olayların görselleştirilmesini sağlayarak nöronal sağlığın değerlendirilmesine yardımcı olur.
- Geliştirilmiş yöntemler, sinaptik süreçleri hedefleyen terapötik bileşiklerin araştırılmasını kolaylaştırabilir.
- Genel olarak, bu yaklaşımlar sinaptik mekanizmaların ve potansiyel hastalık müdahalelerinin anlaşılmasına temelden katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Real-time fluorescent measurement of synaptic functions provides a rapid, quantitative readout of presynaptic activity in neuronal models, enabling early assessment of compound effects on neurotransmission. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs by linking molecular perturbations to functional synaptic outputs. The multiplexable design allows integration with overexpression of disease-associated proteins, facilitating phenotypic screening and translational biomarker alignment in ALS and related models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and calcium influx as functional readouts of neuronal health.
- Operational Value: Enables rapid screening of compounds that may restore synaptic function in disease models, reducing reliance on slower electrophysiology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying synaptic rescue in FUS-ALS and C9ORF72-ALS models using primary rodent cortical and motor neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates normalized fluorescence readouts of styryl dye loss and GCaMP6m gain, providing unambiguous, quantifiable metrics of vesicle release and calcium dynamics.
- Reproducibility: Requires consistent excitation power, exposure time, detector gain, and frame rate across samples to ensure reliable longitudinal comparisons.
- Scalability: Compatible with high-content imaging platforms and perfusion systems, enabling time-lapse acquisition over 3–5 minute basal and 5 minute stimulation phases.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models synaptic dysfunction in FUS-ALS and C9ORF72-ALS, capturing early pathophysiological changes preceding neurodegeneration.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing functional readouts that correlate with neuronal communication deficits in motor and cognitive domains.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables evaluation of whether disease-associated proteins or RNAs impair synaptic transmission, informing target confidence and lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for neurodegenerative disease programs where synaptic dysfunction is an early biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic or pharmacological manipulations to changes in synaptic vesicle recycling and presynaptic calcium flux.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity over time) that enable comparison of compound effects across conditions.
- Analytics: Provides normalized fluorescence measurements that allow teams to assess synaptic function rescue or impairment relative to baselines.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by modeling synaptic deficits in human-relevant ALS genotypes using primary and iPSC-derived neurons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal assessment of synaptic health across multiple projects and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity between genetic insults and functional synaptic outcomes.
- Operational Value: Standardizes synaptic function assessment via reproducible live-imaging protocols with built-in baseline and stimulation phases.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by offering early, functional evidence of target engagement in neuronal models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds that demonstrate synaptic rescue in ALS-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, live-cell imaging, and fluorescent dye handling (styryl dye and GCaMP6m).
- Dependent on stable perfusion systems and image acquisition software with perfect focus to minimize drift during time-lapse acquisition.
- Necessitates standardization of staining, incubation, and perfusion protocols across laboratories to ensure cross-site reproducibility.
- Adaptation to iPSC-derived neurons requires optimization of transfection efficiency and maturation timing while maintaining consistent KCl stimulation parameters.
- Practical limitation: Extended culturing post-perfusion is discouraged due to air exposure, limiting downstream assays to fixed endpoints like immunostaining or molecular extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Microscope and Perfusion System Setup
2:33
Styryl Dye Imaging of Synaptic Vesicle Release
4:30
Fluorescence Imaging of Gcamp6m Calcium Transients
5:36
Image Analysis
6:23
Results: Real-Time Monitoring of the Dynamics of Presynaptic Calcium Influx and Synaptic Vesicle Membrane Fusion in In Vitro Cultured Neurons
8:15
Conclusion
