Name: Temel Caenorhabditis elegans Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans senkronizasyon yöntemini gelişim biyolojisi ve nörobilim araştırmaları için. Alkali hipoklorit çözeltisi kullanarak embriyo izolasyonu ve L1 larva aşamasında senkronizasyon sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar finansmanı için MICINN (PTA programı Montserrat Porta de la Riva destekleyen), AGAUR (Laura Fontrodona için Doktora Bursu), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programı Julián Ceron destekli) ve Marie Curie IRG, ISCIII ve IDIBELL tanımak istiyoruz lab.

1. Protokol A: 11 Kasar için Kültüre Worms C. Büyük popülasyonları elegans sıvı ortam içinde veya plakaların katı ortam üzerine ya kültürleme bunlardan elde edilebilir. Bunlar genellikle E ile katı NGM (Nematodu Büyüme Media) ve beslenen yetiştirilmektedir coli (ısı 13 veya soğuk 14, UV 12 tarafından öldürüldü), canlı veya ölü ya plakaları eklenir bakteriler. En sık uygulanan cerrahi canlı OP50 E. kullanır urasil sentezinde arızalı bozabilir ve solucanlar olur kalın bir tabaka haline Sığmamak olamaz coli,. <ol><li> NaCl 3 g, 17 g agar ve pepton, 2.5 g karıştırın ve H 2 O ve 975 mL 50 dk için otoklava. </li><li> 55 ° C&#39;ye kadar soğumaya şişeye </li><li> 1 M CaCI2 ve 1 ml etanol içinde 5 mg / ml kolesterol 1 ml 1 M MgSO 4 ve 1 ml 1 M KPO 4 tamponu, 25 mL (hepsi aynı kolesterol önceden autoclav eklemeed). </li><li> Steril prosedürleri kullanarak Petri kapları içine NGM solüsyonu dağıtmak; kendi hacminin 2/3 tabak kadar doldurun. </li><li> Kuruduktan sonra, kirletici maddelerin tespiti için kullanımdan önce 2-3 gün için oda sıcaklığında plakaları bırakmak için tavsiye edilir. OP50 E. bir çizgi hazırlayın Bir gliserol stoktan coli (OP50 Caenorhabditis Genetik Merkezi&#39;nden temin edilebilir). </li><li> Tek bir koloni seçin ve ajitasyon ile 37 ° C de bir gece LB içinde büyür. </li><li> Laminar akış kapağı kaldırarak plakalardan buharlaşması ve steril bir Pasteur pipetle plakaların merkezine OP50 eklemek için neme aşan izin verir. </li><li> OP50 E. İzin coli çim 8 saat boyunca oda sıcaklığında ya da 37 ° C de bir gece boyunca büyümesi. </li><li> Plakalar (37 inkübe halinde ° C plakalar kullanılmadan önce oda-sıcaklığında soğutulur edilmelidir) ile solucanların istenen miktarda ekleyin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Medya aynı miktarda dökmebir pipetle veya pompa ile dağıtıcı plakalarda agar plakaları, aynı hacim sağlar ve stereomikroskop yönlendirmesi gerek olmadan plakanın vites kolaylaştırır. </li><li> Oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de bir kapta saklandığında Levhalar (seribaşı ve bakteri ile dereceye giremeyen iki) birkaç hafta Hazırlanan sonra kullanılabilir </li><li> Plaka kenarına bakteri kaplama kaçının. Çim solucanlar tarafı yukarı tarama olabilir plakanın kenarlarına kadar uzanır ise, dışarı kurur ve ölür. </li><li> Plakalar üzerinde tohumlanıyor bakteriler zaten 15 ölü varsa Worms daha uzun yaşıyor. </li></ul> 2. Protokol B: Alkali Hipoklorit Çözüm tedavisi (&quot;Bleaching&quot;) 11 Ağartma yöntemi C. senkronizasyonu için kullanılır İlk larva aşamasında elegans kültürleri (L1). Yumurta kabuğu e korur yöntemin prensibi solucanlar ağartıcıya duyarlı olduğunu yatmaktadırbundan mbryos. Alkalin hipoklorit solüsyonu ile tedaviden sonra, embriyolar kuluçka verir fakat daha fazla gelişimini engeller, gıda, sıvı olmadan medyada inkübe edilir. <ol><li> Solucanlar erişkin aşamasına kadar büyümesine izin verin. </li><li> M9 tamponu ile tabak yıkama ile 15 ml tüpler içinde gebe yetişkin kurtarın. </li><li> Oda sıcaklığında 400xg (standart bir tablo santrifüj üzerine ~ 1500 rpm) 2 dakika santrifüj ve süpernatan atmak tarafından Pelet solucanlar. </li><li> Tampon bakteri net görünene kadar 1-3 yıkama yapın. </li><li> Istenilen beyazlatma solüsyonu (Tablo I) ekleyin ve (yetişkin doku yıkımı mikroskop altında izlenen ve yetişkinlerin izleri hala görünür olduğunda reaksiyon genellikle birkaç bağlı olarak 3 ila 9 dakika sürer, durdurulması gerektiğini bazı dakika için kışkırtıcılık Bu tür tartışma bahsedilen solucanı pelet hacim) (Şekil 3) gibi sorunları,. </li><li> M9 Buffe ekleyerek reaksiyonu durdurunr tüpü doldurmak için. </li><li> Hızla 400 xg 1 dakika için (tedavisi hala aktif olabilir beri) santrifüj ve supernatant atın. </li><li> M9 tamponu ile tüp doldurarak pelet daha üç kez yıkanır. </li><li> Pelet için M9 tampon 1 ml ekleyin, ya da dereceye giremeyen NGM plakalarına yumurta yerleştirin ve yavaşça sallanarak ile istenilen sıcaklıkta inkübe edin. Uygun havalandırma (Şekil 4) temin edilmelidir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Farklı beyazlatma çözümü vardır, (Tablo 1, Şekil 1). Elinizde daha iyi çalışır birini seçin. </li><li> Zaten plakalar üzerine serilir yumurtaları, böyle bir X-ışını filmine bir parça gibi yumuşak bir malzeme ile agar yüzeyi kazıma ile geri kazanılabilir. </li><li> Onlar yakın zamanda yumurtadan larva için bir gıda kaynağı teşkil gibi yetişkin hayvanların çok fazla kalıntı senkronizasyonu bozabilir. </li><li> Yüksek sıcaklıklar biraz rahatsız edici olduğunu gelişimini hızlandırmak isenkronize ve eşitlenmemiş solucanlar arasındaki gelişmişlik farkının daha yüksek sıcaklıklarda daha fazla olacaktır, çünkü f herhangi bir solucan atlar senkronizasyonu. </li><li> Ağartma çözeltisi ile kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bir süre açık olmuştur sonra ek olarak, bu ağartıcı fotosensitivite bağlı, kısmen potensi kaybeder. Biz kaybını önlemek ve ışık maruziyeti en aza indirmek için küçük sarı şişeler içine tablet, her yeni şişe öneririz. </li></ul> 3. Protokol C: Solucan Kaplama <ol><li> Ağartma yapıldı sonra 12 ve 24 saat (embriyonik gelişimi tamamlamak için zaman sıcaklığına bağlıdır) arasında bekleyin ve santrifüj (400 xg&#39;de 2 dakika) solucanlar kurtarabilirsiniz. </li><li> Gerekli plakalar üzerinde yüzer, tohum solucanlar atın ve kalan sıvı kurumaya bırakın. </li><li> Gerekli sıcaklıkta tabak yerleştirin. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> M9 tampon içinde L1 larvaları ° C&#39;de bir hafta boyunca en az bir sallanan Wi 15 tutulabilirbariz değişiklikler thout. </li><li> çok beklenenden daha hızlı gıda tüketmesine ve deneme kalıntısı olabilir çünkü tohum olacak solucanlar hesaplanırken dikkatli olun. Yaklaşık 500 L1 yiyecek tükeniyor olmadan bir 55 mm levha erişkin ulaşabilirsiniz. </li></ul> 4. Protokol D: C. elegans Gözlem D.1 Nomarski gözlem Diferansiyel girişim kontrast mikroskopi boyanmamış şeffaf örneklerinde kontrastı artırmak için kullanılan optik mikroskopi aydınlatma tekniğidir. Kelimesi Nomarski Yaratıcısının adını kullanılan prizma, ifade eder. Hayvanları canlı canlı gözlemleyerek, immobilizasyon elde sadece değişikliklerle hayvan fizyolojisi incelemek mümkündür. Herhangi sabitleştirici eklenir Buna ek olarak, flüoresan belirteçler in vivo tespit edilebilir. Bu gerçek bir ilgi ve gen üzerinde ısıtılmadan floresan işaretleri olasılığı bu mümkün w süreçleri takip etmeyi kolaylaştırırÇalışmanın proteini tutulabilir hich. Bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak, canlı solucanlar sadece görülebilir, ama onlar da yine kurtarıldı ve kaplama yapılabilir. Agar ped hazırlama (sadece kullanımdan önce): <ol><li> Su içinde% 2 agaroz hazırlayın ve eritin. 65 eridi tutun ° C </li><li> Üçüncü, temiz slayt her iki tarafında onlara bir bant ile iki slayt yerleştirin. </li><li> Bir Pasteur pipeti yere temiz bir yüzey üzerine agar bir damla. </li><li> Dik üç slayt üstüne yerleştirilen başka bir temiz slayt agar örtün. </li><li> Böylece agar damla bandı aralayıcılar kalınlığına düzleştirilir yavaşça basın. </li><li> Agar katılaşır sonra, yavaşça bantlanmış slaytlar çekin ve birini diğerine göre kaydırarak kalan iki slaytlar ayırın. </li></ol> Canlı hayvan Montaj <ol start="7"><li> T üzerine bir yerde bir levamisole 1mM damla (10 mikrolitre) veya sodyum azid 10-30 mMo yastığı ortalarsınız. </li><li> Bir solucan seçim kullanarak damla içine hayvanlar aktarın. </li><li> Yavaşça hayvanlar üzerinde bir coverslip yerleştirmek ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> 4 ° C de% 2 agaroz hacimde tutun </li><li> Erimiş agaroz, en az bir gün boyunca 65 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Not: Levamisole spastik kas felci 16 elicits bir nikotinik reseptör agonistidir. </li><li> Dikkatli olun, Sodyum Azide son derece zehirlidir! </li></ul> D.2 Etanol fiksasyon ve DAPI boyaması Burada açıklanan protokol Ancak, çünkü solucanın dissecation bazı yapıları bazı değişiklik ortaya çıkabilir, DAPI ile solucanlar boyama hızlı bir şekilde temsil eder. Böyle daha iyi solucan 17 bütünlüğünü korumak Carnoy çözümü veya formaldehit ile fiksasyon olarak DAPI boyama önceki solucanlar düzeltmek için birçok yöntem vardır. Etanol fiksasyon (18 değiştirilerek) <ol><li> Yeri ~ bir mikroskop lamı üzerine M9 tampon 10 ul (veya su). </li><li> Bir solucan kullanarak dikkatle damlasına kadar 10-25 solucanlar aktarmak bulmaya başladım. </li><li> Solucanları kaldırma ya da kuru izin vermeden filtre kağıdı ya da mümkün olduğunca bir mikro-pipet kaldırmak kadar M9 tampon kullanma. </li><li> % 90 etanol ~ 10 ul ekleyin ve kurumaya bırakın. </li><li> Bir veya iki kez 4. adımı yineleyin. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama <ol start="6"><li> 2 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona istenen yarığına sahip DAPI karıştırılır. </li><li> Yarığına karışımı: etanol tamamen buharlaştırıldı sonra, DAPI 7 ul ekleyin. </li><li> Bir coverslip yerleştirin ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. Slaytlar DAPI ilave edildikten sonra gözlem yaklaşık 5 dakika için hazır hale gelecektir. </li></ol> İPUÇLARI: <ul><li> Montaj medİA gliserol içeren, az miktarda bir bütün hazırlanması karşılamak için yeterli olacak şekilde. </li><li> Ticari yarığına geniş bir yelpazede (Fluoromount veya Prolong, örneğin) vardır, bunların kalite ve fiyat sizin örnek saklamak istediğiniz ne kadar bağlıdır. </li><li> Dikkatli olun, DAPI DNA zengin bölgeler AT güçlü bağlar bilinen bir mutajen olduğunu. </li></ul> Tarifler Nematod Büyüme Orta (NGM) % 1.7 (w / v) Agar 50 mM NaCl % 0.25 (a / h) pepton 1 mM CaCI2 5 ug / ml Kolesterol 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9 tampon 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Kasar çözümleri test <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> tarifi # 1 </td><td> tarifi # 2 </td><td> tarifi # 3 </td><td> tarifi # 4 </td><td> tarifi # 5 </td></tr><tr><td> Su (ml) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> sodyum hidroksit (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> sodyum hipoklorit% 4 (ml) Resimler ~ </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tablo I. Farklı beyazlatma solüsyonu tarifleri Bu yazı için test edilmiştir. Tarifler # # 3 ve 4 2x olup, M9 aynı hacimde ilave edilmelidir. # 1, # # 2 ve 5 tarifleri için daha önceden 2, 11, 19 bildirilmiştir. Final konsantrasyonları: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl% 0.8 Resimler ~<html> , # 2 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~% 1, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~% 1.6, # 5 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8. 5.. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Iki farklı inkübasyon zamanlarda beş farklı beyazlatma çözümler Karşılaştırılması. N2 solucanlar M9 ile iki kere yıkanır, her beyazlatma solüsyonu içeren beş 15 ml konik tüpler içine ayrıldı. Tüpler kuvvetli bir şekilde çalkalandı ve 1 ml belirlenmiş bir süre sonra tepkime durdurma M9 sahip yeni bir tüpe aktarıldı. Ağartma sonra prosedürü solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile inkübe edildi. Her iki durumda da, daha düşük bir görüntü, sadece 24 saat sonra, üstte resim ağartma sonrası alınmıştır. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 2 &quot;/&gt; Şekil 2. Ağartıcı çözeltinin sıcaklığı tedavisinde de etkilidir. N2 solucanlar eşit hacimleri, ya daha önceden 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutuldu ve aynı süre için 25 ° C&#39;da muhafaza aynı ağartma çözeltisi ile ağartılmış edildi. Sadece beyazlatma sonrası sol gösteri resimlerin üzerine iki sütun. Tedavi solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 1 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde inkübe edildikten sonra. 24 saat sonra sağ ekranda resimlerin Sütunlar. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Oranı solucanı pelet: alkalin hipoklorit inkübasyon süresi tedavisinde de etkilidir solucanı pelet 50, 100, 250 ve 500 ul 3, 6 ve 9 saat için çözelti içinden 3 ağartma 2 ml ile inkübe edildi.. Taranmış L1, ölü embriyo ve yetişkin parçalarının kalıntıları 2 için 20 ° C&#39;de inkübasyondan sonra ölçüldü<html> 4 M9 tamponu 1 ml olan 15 ml&#39;lik tüplere konik saat. Erişkin solucanlar ile yaklaşık üç konfluent 55 mm levha 100 ul solucan pelet almak için gereklidir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Uygun havalandırma kuluçkalık ve C. yaşaması için gereklidir elegans embriyosu. N2 solucanların A 100 ul topağı 6 dakika süreyle ağartılan ve 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de M9 arasında, belirtildiği gibi, 1, 5 ya da 10 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde kuluçkalanmağa devam etmiştir. Oklar yumurtadan vermedi yumurta işaret nerede rakam üst kısmı, 24 saat sonra kültürlerin resimleri görüntüler. En altta belirtilen şartlarda beyazlatma sonrası larvalar (açık gri) ve ölü embriyo (koyu gri) 48 saat miktarını gösteren bir grafik var. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 5 &quot;/&gt; Şekil 5. C. yaşam döngüsü elegans. Bir. Farklı aşamalarda solucanlar yaklaşık uzunluğu. Saat sıcaklığı (20 değiştirilerek) Belirtilen gelişim aşamalarında farklı solucan. B. Nomarski (yukarı) ve DAPI (aşağı) resimler bağlı olarak her bir aşamaya ulaşmak için gerekli. Her aşamada en önemli özelliği büyütülmüş L1: ok gonad somatik ve germ hattı öncüleri gösterir L4 Erken: siyah ok (Nomarski) gelişmekte olan vulva gösterir; beyaz oklar (DAPI) iki gonadal silah işaret Orta... L4 geç: ok sözde Noel ağacı aşamada gelişen vulva gösterir Genç Yetişkin:. siyah ok rahim içinde embriyo gösterir, ok ucu noktaları spermateka için, beyaz ok Yumurta gösterir Hamile olan yetişkin:. ok (DAPI) puan Döllenen embriyolar. DAPI görüntü Ok spermateka gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> 6 Şekil. L3, L4 ve Yetişkin aşamalarında vulva morfolojisi. L3 aşamada vulvada oluşan küçük bir lümen görülebilir. L4 anda bu lümen sözde &quot;Noel ağacı&quot; oluşturan genişler. Erişkin vulva zaten kapalıdır. Sarı çizgiler bu üç aşamada vulva yerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. L3 DAPI lekelenme, erken L4, L4 geç ve Yetişkin aşamaları. L3 anda, germ line uzamıştır. L4, gonad silah mevcut U-şekil morfolojileri. Geç-L4 aşamada spermin az gonad distalinde görülebilir. Genç Yetişkinler oosit sunuyoruz. Yetişkin germ line oosit ve embriyolar sunuyor. Sarı çizgiler th germ hatları sınırlandırmake farklı belirtilen aşamaları. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8. C. 15 ve 25 ° C N2 solucanlar az elegans gelişimi 15 M9 ve ajitasyon ° C, tabak transfer ve belirtilen sıcaklıklarda belirtilen sürelerin yetiştirilen bir gece inkübe, ağartılmış edildi.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+cell+death%3A+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li>
<li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li>
<li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li>
<li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+longevity%3A+lessons+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li>
<li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).</li>
<li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li>
<li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504(2007).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li>
<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Nematod Senkronizasyon Çeşitli çözümler ağartma tarif edilmiştir. Biz beş farklı tarifler (Tablo I) çalıştı ve bizim ellerimizde, onlar solucan nüfus senkronizasyon önemli farklılıklar (Şekil 1) göstermemiştir. Solucanların hacmi (Şekil 3) ve embriyo (Şekil 4) kuluçka inkübe edilir hangi ile M9 hacmi etkide: Bununla birlikte, bu tür deneyler sıcaklığında (Şekil 2), ağartıcı çözelti oranı gibi parametreleri oldu...

temel<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; yöntem: senkronizasyon ve gözlem

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Nematod Caenorhabditis elegans moleküler ve gelişim biyolojisi üzerine araştırmalar Sydney Brenner tarafından Yetmişli yılların başında başladığını ve o zamandan beri bir model organizma 1 olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. C. elegans gibi uzun yıllar 2 temel biyolojik çalışmalar için uygun bir deneysel sistem yaptık sadelik, şeffaflık ve kısa yaşam döngüsü gibi önemli özelliğe sahip. Birçok hücresel ve moleküler süreçlerin kontrolü hayvan gelişimi evrimsel korunmuş 3 olduğunu, çünkü bu nematod Keşifler geniş etkileri vardır. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan C. elegans yaşam döngüsünün bir embriyonik evre ve dört larval evreden geçer. Kalkınma sıcaklığa bağlı olarak 2 ila 4 gün sürebilir. Aşamaların her birkaç karakteristik özelliklerini görülebilir. Derin annotat ile birlikte 4,5 komple hücre soyunun bilgigenom iyon 7,8 yaşlanma nörobiyoloji 6, kök hücre biyolojisi 9 ve germ line biyoloji 10 gibi çok farklı alanlarda büyük bir modelin içine bu nematod açın. C. kılan ek bir özelliği çalışmak için cazip bir model elegans nispeten kolay bir protokol ile belirli bir aşamada senkronize solucanlar nüfus alma imkanı vardır. Bu nematod sürdürmek ve yayma kolaylığı gibi RNAi ekranlar, mikroarrayler, masif sıralama gibi küçük ya da yüksek verim denemeleri çeşitli için kullanılabilir solucanlar büyük miktarda elde etmek için güçlü bir araç sağlar senkronizasyon imkanı eklendi diğerleri arasında immunoblotting veya in situ hibridizasyon,. Şeffaflığı, C. nedeniyle elegans yapıların da Nomarski micros olarak bilinen, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu kullanılarak mikroskop altında ayırt edilebilirkopyalayın. Bir floresan DNA bağlayıcı, DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) kullanımı, örneğin, belirli bir tanımlama ve Lokalizasyon tek tek hücrelerin yanı sıra, hücre içi yapıları / bunlara eşlik bozukluklara yol açabilir.

Nematod koruma ve yayma kolaylığı<em&gt; C. elegans</em&gt; Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Nematod Caenorhabditis elegans'ın moleküler ve gelişim biyolojisi üzerine araştırmalar, yetmişlerin başında Sydney Brenner tarafından başlatılmış olup...

Bu videoda, C. elegans'ı birinci larval evrede nasıl senkronize edeceğinizi göstereceğiz. Bu basit ancak oldukça yaygın kullanılan bir yöntemdir, bu nedenle oldukça faydalı olacaktır. Hala başlangıç aşamasındasınız.Eğer C konusunda uzmansanız, burada bu protokolü optimize etmek için bazı ipuçları bulabilirsiniz. Solucanların senkronizasyonunun temeli, clen ve embriyoların alkali hipoklorit çözeltisine karşı yetişkin tavşanlara göre gösterdiği göreceli dirence dayanmaktadır. İçlerinde çok sayıda embriyo bulunan bu yetişkin solucanlar, ölmeleri ve yalnızca embriyoların kalması için bir hipoklorit çözeltisi ile inkübe edilir.Senkronizasyonun ikinci kısmı, embriyolar farklı zamanlarda yakalansa bile L1 aşamasından daha ileriye gelişmemeleri için gıda eksikliğiyle sağlanır. Bir blitzing protokolünü başlatmanın ilk adımı, solucanların yumurtlama aşamasında olması ve plakaya birkaç yumurtanın dağılmış olmasıdır. Hasat etmek amacıyla yetişkinleri geri kazanmak için M9 kullanın.Ayrıca, plaka yüzeyinde bulunan embriyolar, bir röntgen filmi parçası gibi yumuşak bir materyalle sıyrılabilir ve geri kazanılan bakteriler birkaç kez M9 yıkamasıyla uzaklaştırılabilir. Genellikle birkaç yıkama yeterlidir. Solucanlar yıkandıktan sonra, tercihlerimize göre taze hazırlanmış ağartma çözeltisini ekleme zamanı gelmiştir.Tüpü sallarken inkübasyon süresini kontrol edin. Erişkinlerin oluşumunu stereo mikroskop altında izleyebilirsiniz. Neredeyse hiç karkas kalmadığında, tüp tamamen dolana kadar M nine ekleyerek reaksiyonu durdurun.Protokolü tamamlamak için en az üç yıkama işlemi gerçekleştirin. Yumurtalar, M9 tamponu içerisinde gece boyunca sürekli ajitasyonla inkübe edilir; bu işlem yumurtaların açılmasına izin verirken solucanların daha fazla gelişmesini önler. Senkronizasyon 15 ile 25 derece arasındaki herhangi bir sıcaklıkta gerçekleştirilebilse de, 15 derece önerilir.Gelişim daha yavaş olduğu için, gelişim süreci boyunca belirttiğimiz üzere, C. elegans yetişkinliğe erişmeden önce, yetiştirildiği sıcaklığa bağlı olarak dört larva evresinden geçer. C tipi C. elegans 15 ile 25 derece arasındaki büyüme sıcaklıklarına tolerans gösterirken, büyüme hızı bu aralıkta daha yüksektir.Buradaki yüksek sıcaklıkta, 24 saat sonra solucanların bulunduğu evrelerin nasıl farklılaştığını görebilirsiniz. 15 ve 25 derecelerde, 25 derecede 48 saat sonra halihazırda embriyolar gözlemliyoruz. Ancak, plakların yüzeyinde embriyoları görmek için 80 saatten fazla beklememiz gerekiyor.Optimal sonuçlar elde etmek için 15 °C'de yetiştirilen solucanlarla blitzing deneyi yaparken birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca, deneyin gerçekleştirilmesi için solucanların istenen evrede olduğunun belirlenmesi önemlidir. Bu nedenle, evrelerin boyut, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu veya boyama yöntemiyle nasıl ayırt edileceğini size göstereceğiz.Bu grafikte, GaN solucanlarının sıcaklığa bağlı büyüme oranını görebilirsiniz; örneğin, 25 derecede çok daha hızlı büyüdükleri görülmektedir. Deniz elementlerinde hayvan boyutu ile gelişim arasında bir korelasyon vardır. Uygun yazılım kullanılarak hayvanlar ölçülebilir ve ardından uygun gelişim evresine göre sınıflandırılabilir.Ancak bu grafiğe göre, bölge gelişim aşamalarının genel bir belirtecidir. Diferansiyel girişim kontrast mikroskobisi veya DPI boyaması ile gözlemlenebilen ve tanınabilen anatomi kısımları izlenerek daha üzerinde uzlaşılmış bir evreleme gerçekleştirilebilir. Laboratuvarımızda bu protokolü; tekli boyamada mikro yumurtalar, in situ görselleştirme ve apikal boyama gibi farklı deneyler için solucanları senkronize etmek amacıyla kullandık.Ayrıca, bu Protokol kontaminasyonu önlemenize de yardımcı olur. Kontrastı artırmak için diferansiyel girişim kontrastı veya nomar mikroskopisi kullanılır. Boyanmamış şeffaf örneklerde, hayvanlar %2 Agros tabanı üzerine canlı olarak monte edilir; Agros önceden hazırlanabilir ve gerektiğinde dört derecede saklanabilir.Eritilip 65 derecede tutulabilir. Agaroz eridiğinde, bir lama bant yapıştırın ve bunları üçüncü bir lamın her iki yanına yerleştirin. Dikkatlice bir miktar agaroz alın ve bantlanmamış lamın üzerine bir damla damlatın.Agro plakalarını, enlemesine yerleştirilmiş başka bir lamla kapatın. Yol katılaştığında, lamların birini diğeri üzerinde dikkatlice kaydırarak iki lamı birbirinden ayırın. Pedlerden biri lamlardan birine yapışacaktır.Solucanların hareketsiz kalmasını sağlamak için pedin üzerine bir miktar Amazon ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında bazı solucanları seçin ve onları lele damlasına aktarın. Yola zarar vermekten kaçının.Bir lamel alın ve kenarlarına biraz oje sürün. Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek lameli lam üzerine dikkatlice yerleştirin. Hazırlanan örnek mikroskop altında hemen gözlemlenebilir. C. elegans anatomisinin en kolay ayırt edilen özelliklerinden biri farenksdir.Örneğin, Noel ağacı şeklindeki aava, L4 evresinin karakteristiğidir. Gelişim boyunca c. elegans anatomisine ilişkin ayrıntılı bilgilere www.orla.org adresinden ulaşılabilir. Hücreleri tanımlamak için yaygın bir prosedür olan Tapis boyaması kullanılır.Tünel ile fiksasyon, solucanları sabitlemek için hızlı bir yöntemdir. DAPI boyaması için, önce mikroskop lamının yüzeyine bir damla M9 tamponu ekleyin. Plakadan doğrudan bazı solucanları alın ve bunları M9 damlasına aktarın.Fazla M9'u bir pipetle veya yumuşak bir dokuyla temizleyin. Solucanlara bir tünel ekleyin. İşlemi tekrarlayın.İlk damla kuruduktan sonra, preparatı mikroskoba götürmeden önce API ve oversleep içeren montaj medyumu ekleyin. Go gelişimi, api içeren sıcak stent ile kolayca gözlemlenebilir.

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, gelişimsel olarak senkronize bir steril yetişkin C. elegans popülasyonu üretme yöntemini gösteriyoruz. Örnek protokol, canlı hayvanlarda oksijen tüketim oranlarını incelemek için solucanları senkronize eder.

Nematod Senkronizasyonu: Aynı Gelişim Aşamalarında Solucan Popülasyonları Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Burada, moleküler düzeyde RT-qPCR kullanan Caenorhabditis elegans ısı şok tepkisi (HSR) indüksiyondeğerlendirmek için standart protokoller sunulmaktadır, hücresel düzeyde floresan muhabirler, ve organizma düzeyinde termokurtarma.

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.

4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Bu çalışma, en büyük Lyapunov üssünü (LLE) ölçerek C. elegans'ta yaşın hareket üzerindeki etkisini incelemektedir. Yaşlandıkça, C. elegans motor kontrolünde bir artış ve ardından düşüş gösterir. Sonuçlar, beş günde LLE'nin zirve yaptığını ve ardından solucanlar yaşlandıkça bir düşüş olduğunu gösteriyor.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşa Bağlı Hareket Dinamiği: Bir Lyapunov Üs Analizi

Öğrenin Caenorhabditis elegans senkronizasyon yöntemini gelişim biyolojisi ve nörobilim araştırmaları için. Alkali hipoklorit çözeltisi kullanarak embriyo izolasyonu ve L1 larva aşamasında senkronizasyon sağlayın.

Temel

Daha fazla video keşfet